专利名称：一种疟疾疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及疟疾疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。
背景技术：
据世界卫生组织统计，全球大约有3. 2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约100万人的性命并导致4亿人感染，而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了 10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和血液传播等新的传播方式的出现使得疟疾疫情的控制面临更加严峻的挑战。每年感染疟疾致死的人群中，拟％为五岁以下的儿童。因而疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。疟原虫生活史有多个时期，每个生活时期具有多种抗原，而且每种抗原具有多个表位，而不同宿主的免疫反应也不相同，所有的这些因素使得疟疾疫苗的研究变得异常困难。传统的疟疾治疗主要依赖于药物治疗，氯喹是一种使用方便、疗效好且经济的红内期抗疟药物，氯喹可以与恶性疟原虫体内的血红蛋白降解产物高铁血红素结合从而影响恶性疟原虫的解毒，来达到杀灭疟原虫的目的。任何一种药物经过长时间的使用之后都会使其作用受体对其产生一定的耐受性，由于药剂量不足、治疗不彻底、药物半衰期长、疟疾传播密度高等都有可能致使恶性疟原虫对氯喹产生抗性，因此药物疗措施已面临着严重的挑战。疟疾的临床症状主要发生在疟原虫裂殖子孢子在人体红细胞内无性增殖阶段，目前疟疾疫苗研究的热点主要是基于阻止此阶段疟原虫的无性裂殖来预防疟疾的感染。裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段(MSP119。)在子孢子侵染红细胞后仍然存在于裂殖子表面，可诱导机体T细胞和B细胞产生免疫应答，因此是当前最重要的疟疾疫苗研制的候选抗原位点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的疟疾疫苗。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白 IC-末端的19kD片段(MSPl19e)展示在家蚕杆状病毒表面MSPl19e基因通过与GP64基因的跨膜(TM)基因与信号肽(SP)基因相连，通过信号肽(SP)基因的引导和跨膜(TM)基因的锚定，在病毒表达和复制过程中将MSPl19。蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原进行生产，相比于传统疟疾疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下
一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19。，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5602。
上述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64_MSPl19。的制备方法，包括以下步骤
(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过I和损οI/历III双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBaCI-gp64 ；
(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因MSPlw。序列，其5’和3’端分别引入FcMI和损ol酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBaCI-gp64，构建成重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSPl19C ；
(3)取步骤( 所得的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-MSPl19C转化大肠杆菌DHlOBac 感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养401Γ4 !后挑取白斑，培养20tT24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组， 并用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR鉴定；
(4)取步骤C3)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0°C、°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR 鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19c。本发明还提供上述重组杆状病毒BmNPV-gp64_MSPl19。表达的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。上述抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤
(1)将上述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19e感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；
(2)针刺接种法接入家蚕蛹；
(3)收集表达的上述抗原蛋白。本发明进一步提供上述重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPlli3。在疟疾疫苗制备中的应用。本发明还提供上述蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。本发明实现的技术效果如下
1、世界上首次利用家蚕杆状病毒表面展示技术高效表达恶性疟原虫抗原蛋白，制备疟疾疫苗；
2、利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器高效表达真核生物蛋白，可以达到蛋白的正确折叠，从而能保证完整的抗原性；
3、蚕蛹作为天然食品，且杆状病毒对哺乳动物无感染，致热源性少，疫苗安全性高；
4、本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的疟疾疫苗应用价值大。
图1显示的是融合杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体 pFastBacI-gp64 ；
图2显示的是含有PfMSPlli3。的重组基因结构示意图；pPolh 多角体启动子；SP :gp64 基因的信号肽序列；PfMSPl19。恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段；TM: gp64基因的跨膜区序列；Poly (A)多腺苷酸化信号；
图3显示的是GP64信号肽SP基因的PCR扩增结果图；Μ:101Λ DNA标记；1 信号肽SP 的PCR产物；图4显示的是GP64基因跨膜结构域TM基因的PCR扩增结果；M :10 DNA标记；1 ‘ 跨膜结构域TM的PCR产物；
图5显示的是MSPlwe基因的PCR扩增；M :10Kb DNA分子量标准；1 =MSPl19c基因扩增的 PCR产物；
图6显示的是重组质粒的鉴定；M :10Kb DNA分子量标准；1 :pFastBacI-gp64-MSPl19C 重组质粒的双酶切产物；2 :PFastBacI-gP64-MSPl19C重组质粒的PCR产物；
图7显示的是Bacmid-gp64-MSPl19。的鉴定；M :10Kb DNA分子量标准；1 :M13上、下游引物PCR结果；2 =MSPl19c引物PCR结果；
图8A显示的是重组病毒在细胞中的PCR检测结果(用M13通用引物鉴定)；M=IOKb DNA 分子标准量大小；1 :M13上、下游引物的PCR产物；
图8B显示的是重组病毒在细胞中的PCR检测结果(用MSP119C基因引物鉴定);M IOKb DNA分子标准量大小；1 =MSPl19c引物的PCR产物；
图9A显示的是MSPl19e蛋白在蚕蛹中表达中的SDS-PAGE检测结果；M 标记；1 正常蚕蛹上清；2 正常蚕蛹沉淀；3 发病蚕蛹上清；4 发病蚕蛹沉淀；
图9B显示的是MSPl19c蛋白在蚕蛹中表达中W^festern Blotting检测结果；M 标记； 1 正常蚕蛹上清；2 正常蚕蛹沉淀；3 发病蚕蛹上清；4 发病蚕蛹沉淀；
图IOA显示的是离心过程均取样的SDS-PAGE检测结果；M 标记；1 超离上清；2 超离沉淀；3 :300kD超滤流出；4 :300kD超滤截留；5 :8000rpm上清；6 :8000rpm沉淀；7 15000rpm 上清；8 :15000rpm 沉淀；
图IOB显示的是离心过程均取样的Wfestern Blotting检测结果；M 标记；1 超离上清；2 超离沉淀；3 :300kD超滤流出；4 :300kD超滤截留；5 :8000rpm上清；6 :8000rpm沉淀；7 :15000rpm 上清；8 :15000rpm 沉淀。
具体实施例方式以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD片段(MSPl19c)展示在家蚕杆状病毒表面(如图2)， MSPl19c基因通过与GP64基因的跨膜(TM)基因与信号肽(SP)基因相连，通过信号肽(SP) 基因的引导和跨膜(TM)基因的锚定，在病毒表达和复制过程中将MSPl19c蛋白展示于家蚕杆状病毒的表面。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实施例1 重组转移质粒pFastBacI-gp64_MSPl19。的构建
以杆状病毒gp64序列为模板，分别用引物Pl (如SEQ ID NO=I所示)、P2 (如SEQ ID NO 2所示)和P3 (如SEQ ID NO 3所示)、P4 (如SEQ ID NO 4所示)进行PCR扩增gp64 的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)，PCR产物通过及丽TIjcoTP I和炀οI、历III (均购自！^rmentas公司)双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建展示载体 pFstBacI-gp64。以恶性疟原虫3D7标准株cDNA(由云南昆明科学院杨照青教授惠赠)为模板，用引物P5 (如SEQ ID NO 5所示)、P6 (如SEQ ID NO 6所示)进行PCR扩增恶性疟
5原虫裂殖子表面膜蛋白IC-末端的19kD抗原位点的DNA序列，PCR产物通过和IAoI (均购自！^ermentas公司)双酶切插入展示载体pFastBacI_gp64 (见图1)，构建重组转移质粒pFastBaCI-gp64-MSPl19。。该重组转移载体包括多角体启动子(pPolh)、gp64信号肽 (SP)和跨膜区(TM)、恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白IC-末端19kD片段(PfMSPl19e),结构如图2所示。将含有PfMSPl19e (融合有gp64 )的通过I和损ο I插入到多角体启动子下，利用该多角体启动子启动PfMSPlli3。融合基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)， C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白IC-末端19kD片段(PfMSPl19e)通过杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽(SP)引导和跨膜区(TM)锚定展示于杆状病毒表面，形成刺猬状(伪病毒)，末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的翻译有重要作用。引物序列设计如下
权利要求
1.一种家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19。，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5602。
2.—种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19。的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，通过I/EcoR I和损ol/历/ /ΙΠ双酶切插入pFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFastBaCI-gp64 ；(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原基因MSPlw。序列，其5’和3’端分别引入FcMI和损ol酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBaCI-gp64，构建成重组转移质粒 pFastBacI-gp64-MSPl19C ；(3)取步骤( 所得的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-MSPl19C转化大肠杆菌DHlOBac 感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养4(Γ4 !后挑取白斑，培养2(T24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物、MSPlwe引物做PCR鉴定；(4)取步骤C3)所鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液0°C、°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物、MSPl19e引物做PCR 鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19c。
3.种权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPlli3。表达的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。
4.一种权利要求3所述抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19e感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；(2)针刺接种法接入家蚕蛹；(3)收集表达的权利3所述抗原蛋白。
5.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒BmNPV-gp64-MSPl19。在疟疾疫苗制备中的应用。
6.一种权利要求3所述的蛋白在疟疾疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种疟疾疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过构建一种重组家蚕杆状病毒，并运用杆状病毒表面展示技术将恶性疟原虫裂殖子表面膜蛋白1C-末端的19kD片段(MSP119C)表达于家蚕杆状病毒表面，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒制备疟疾疫苗。相比于传统的疟疾疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。
文档编号C12N7/01GK102533677SQ20121000557
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者吴昕昕, 张耀洲, 舒特俊, 陈剑清 申请人:特菲(天津)生物医药科技有限公司