专利名称：一种恶性疟疾疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种恶性疟疾疫苗及其制备方法，尤其涉及恶性疟疾疫苗制备中重组质粒和重组病毒的制备，属于生物医药技术领域。
背景技术：
疟疾是当今世界对人类危害最为严重的传染性疾病之一。据WHO最新估计，全球每年发生3亿-5亿起急性感染病例，有100多万人因这一疾病而死亡，其中大多数为非洲撒哈拉以南地区5岁以下的儿童。近年来，由于耐药性疟原虫株和耐药蚊媒的不断产生和扩散，使疟疾控制形势更为严峻。因此，研制有效的疟疾疫苗，成为控制疟疾的发病率和病死率迫切需要解决的课题。在众多的疟疾疫苗候选抗原中，恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原Kapicalmembrane antigen-1, AMA-1)在裂殖子入侵宿主红细胞过程中发挥重要作用，有希望的抗疟原虫感染的疫苗候选分子。随着AMAl分子生物学研究的深入，人们开始研制AMAl亚单位疫苗，目前世界上生物技术常用的生物体是大肠杆菌和酵母，用大肠杆菌表达的AMAl蛋白无免疫原性和保护性，而酵母表达AMAl也不能产生有效的中和抗体。哺乳细胞表达系统(CHO)等表达系统虽然效果好，但因表达量低，同时需大量培养基和牛血清蛋白，成本高，不适合生产需要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的恶性疟疾疫苗。本发明通过构建一种家蚕重组杆状病毒，并运用重组杆状病毒表面展示技术构建表达恶性疟原虫主要抗原AMAl胞外域的重组杆状病毒&iigp64AMAl，以家蚕蛹作为生物反应器生产重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原生产疫苗，相比传统疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下
一种家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMAl，该病毒于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心其简称为CGMCC(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为家蚕核型多角体病毒{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5601。上述家蚕重组杆状病毒aiigp64AMAl的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤
(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分别通过I和炀ο I /历III双酶切插入PFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFaStBaCI-gp64 ；
(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分别引入^I和I酶切位点后，连接到步骤⑴所得表面展示载体pi^StBaCI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMAl ；
(3)取步骤( 所得的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-AMAl转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养4(Γ4 !后挑取白斑，培养2(T24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；
(4)取步骤C3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液(T4°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒&iigp64AMAl。本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒aiigp64AMAl表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。上述蛋白的制备方法包括以下步骤
将上述家蚕杆状病毒Bmgp64AMAl感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹；收集表达的上述蛋白。本发明进一步提供上述重组杆状病毒&iigp64AMAl在制备恶性疟疾疫苗中的应用。本发明还提供上述蛋白在制备恶性疟疾疫苗中的应用。本发明实现的技术效果如下
利用家蚕幼虫、蛹作为生物反应器，家蚕杆状病毒表达系统高效表达具有极高临床应用价值疟疾疫苗的方法，本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的疟疾疫苗应用价值大；
疟疾疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系统是真核表达，具有翻译后修饰功能。AMAl胞外域蛋白的免疫原性与其正确构型有关，利用真核表达可以具备较好的免疫原性。
图1 融合杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体pFastBacI-gp64 ；
图2 含有PfAMAl ectodomain的融合基因结构示意pPolh 多角体启动子；SP :gp64基因的信号肽序列；PfAMAl ectodomain 恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域；TM :gp64基因的跨膜区序列；Poly (A)多腺苷酸化信号；Stu I 酶切位点；》ιο I 酶切位点。
具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。本发明所述恶性疟疾疫苗的制备方法，通过PCR的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMAl胞外域基因序列(恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域)，将其插入融合gp64信号肽和跨膜区的表面展示载体pFastBacI-gp64中，获得pFastBacI-gp64_AMAl重组质粒，转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，通过转座获得重组Bacmid-AMAl，将其转染家蚕BmN细胞，在细胞内装配形成重组杆状病毒&iigp64AMAl，并复制扩增，用第三代aiigp64AMAl接种家蚕幼虫，蛹，经5-7天后收集幼虫体液和蛹体，勻浆、离心、分离纯化，冷冻干燥，无菌条件下制成恶性疟疾疫苗冻干粉实现。下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。实施例1 重组转移质粒pFastBacI-gp64_AMAl的构建
以杆状病毒gp64序列为模板，分别用引物PI、P2和P3、P4进行PCR扩增gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列01)』0 产物通过及 !! I/EcoR I和炀ο I /Λ /7 /ΙΙΙ双酶切插入PFastBacI载体多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFStBaCI-gp64(载体结构如图1所示)。然后以恶性疟原虫3D7标准株cDNA为模板，用引物P5、P6进行PCR扩增恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域AMAl ectodomain，PCR产物通过Sto I和ZAo I双酶切插入表面展示载体pFastBacI-gp64，构建重组转移载体pFastBacI-gp64-AMAl。该重组转移载体包括多角体启动子(pPolh)、gp64信号肽(SP)和跨膜区(TM)、恶性疟原虫顶端膜抗原AMAl胞外域(PfAMAl ectodomain)，结构如图 2 所示，将含有 PfAMAl ectodomain (融合有 gp64 )的通过Mu I和B10 I插入到多角体启动子下，利用该多角体启动子启动AMAl融合基因的表达，使融合蛋白N端具有信号肽(SP)，C端具有跨膜区(TM)，由于该启动子属于极晚期基因启动子且为强启动子，即使融合蛋白是对杆状病毒和宿主细胞有毒性的蛋白，由于以该启动子启动融合基因表达时病毒粒子已经形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表达。恶性疟原虫顶端膜抗原胞外域(PfAMAl)通过杆状病毒囊膜蛋白gp64的信号肽(SP)引导和跨膜区(TM)锚定展示于杆状病毒表面，形成刺猬状(伪病毒)，末端的多腺苷酸化信号PolyA对融合蛋白的翻译有重要作用。引物序列设计如下
Psp 1CGC.GGATCC ATGGTAGGCGCTATTGTTTXATAC'GTG
CTTTTGGC'CjGC" GGfsp 1 -40)
Psp2C GAC GTAGGCCTTTGAATTCTfba C4054-40DCGC. CG
Panxa6 CCGC"TC'GAGTTT€ATTTTATCAX4ACt(l)gp64信号肽(SP)的扩增以gp64 DNA为模板，PCR反应参数设计为，94°C预变性3min，94°C变性30s，68°C复性延伸30s, 30个循环，68°C延伸5min。
在一个无菌的0. 5ml离心管中，混合下列成分IOXPCR Buffer10 μ 125mmol MgCl28μ 1
2. 5 mmol dNTPs8μ 1
Pspl1 μ 1
Psp21 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1 加无菌双蒸水至100 μ 1
各组分混勻后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。(2) gp64跨膜域(TM)的扩增
以gp64 DNA为模板，PCR反应参数设计为，94°C预变性3min，94°C变性30s，68°C复性延伸30s, 30个循环，68°C延伸5min。100 μ 1的反应体系同上，所用引物为Ptm3和Ptm4，各组分混勻后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。(3) AMAl ectodomain 基因的扩增
以恶性疟原虫3D7标准株cDNA为模板，PCR反应参数为94°C预变性5min，94°C变性45s，53°C退火30s，68°C复性延伸90s, 35个循环，68°C延伸IOmin。在一个无菌的0. 5ml离心管中，混合下列成分10XPCR Buffer5μ 1
2. 5mmol MgSO42μ 1
2.5 mmol dNTPs5 μ 1
Pamal1. 5 μ 1
Pama21. 5 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1加无菌双蒸水至50 μ 1
各组分混勻后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计35个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。(4)重组转移质粒构建
将上述PCR扩增获得的gp64的信号肽(SP)序列和跨膜区序列(TM)分别通过BamHI、EcoR I和Xho I、HindIII (购自Fermentas公司)双酶切插入pFastBacI载体(购自hvitrogen公司)多克隆位点上下游两端，构建展示载体pFstBaCI-gp64。然后将AMAlectodomain的PCR产物通过Mu I和Β ο I (购自！^ermentas公司)双酶切插入展示载体pFastBacI-gp64,构建重组转移质粒pFastBacI-gp64_AMAl。通过酶切分析、双向测序鉴定基因序列正确。实施例2 家蚕重组杆状病毒aiigp64AMAl的获得
鉴定重组成功的重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMAl转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞(购自hvitrogen公司)，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X_gal和IPTG的LB培养板(购自上海生工生物公司)上进行蓝白斑筛选，避光培养4 后挑取白斑，培养24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定。鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞(购自hvitrogen公司)(方法参照hvitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin II Reagent说明书)，发病后(显微镜观察)获得一代病毒悬液4°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒株 Bmgp64AMAl0实施例3 =AMAl融合蛋白在家蚕5龄幼虫和蛹中的表达
将家蚕重组杆状病毒&iigp64AMAl以10M0I病毒感染BmN细胞进行病毒扩增，按 IX 10PFU/条针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹(购自浙江中奇生物药业股份有限公司)，感染5-7天后，采取幼虫体或蛹体勻浆，经高速离心(12000rpm，30min)，取上清，检测重组蛋白的表达。高速离心后的上清加入等体积的2X蛋白质上样缓冲液(IOOMm Tris HC1，4%SDS，0. 15% 溴酚蓝，10% 甘油)，100°C加热 IOmin,取 20 μ 1 进行 SDS-PAGE 分析，结果表明，该家蚕重组杆状病毒已表达AMAl融合蛋白，蛋白测序结果显示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示。实施例4 恶性疟疾疫苗的获得
(1)从蚕蛹中分离纯化AMAl融合蛋白(恶性疟疾疫苗)
a.取500g经&iigp64AMAl感染的蚕蛹样品，4°C解冻后，与IL灭菌ddH20混合，勻浆至浆液细致均勻即可；
b.将约1.3L勻浆液加入500ml离心管中，配平，8000rpm离心30min，取上清，小心弃
去油脂；
c.将8000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30_120min，取上清，
弃油脂；
d.将12000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，15000rpm离心30_120min，取上清，
弃油脂；
e.将15000rpm离心上清液倒入50ml离心管，配平，18000rpm离心30_120min，取上清，
弃油脂；
f.ISOOOrpm离心后的上清，在超净台上分装于灭菌的超离管中，用注射器赶走管内气泡，平衡，放入日立CP70MX离心机中，35000rpm离心30_90min ；
(2)超滤
收集35000rpm离心后上清液(约500mL)，用截留分子量为300KD的中空纤维膜进行超滤，不断加入无菌水，所用无菌水体积约为样品的10倍，整个超滤过程均在4°C环境下操作。(3)疫苗效果
恶性疟疾疫苗进行动物体中试验，免疫动物为新西兰雄兔(购自天津市奥臣实验动物销售有限公司，11周龄，2. 3kg)，皮下注射，注射剂量为0. l-50mg/kg，2-4周后检测抗体效价，其保护抗体效价大于1 :150，攻毒试验结果显示该剂量(0. l-50mg/kg)疫苗能产生中和抗体并具有明显抵抗病毒的效果。恶性疟疾疫苗进行恶性疟原虫(云南昆明医学院)侵染实验，其保护抗体效价大于1 :150，并具有明显抵抗疟原虫侵染的效果。以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。
权利要求
1.一种家蚕重组杆状病毒angp64AMAl，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5601。
2.—种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMAl的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)由PCR扩增的方法获得杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分别通过1/EcoR I和损οIII双酶切插入PFastBacI载体多克隆位点上下游两端构建的表面展示载体pFaStBaCI-gp64 ；(2)由PCR扩增的方法获得恶性疟原虫主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分别引入^I和I酶切位点后，连接到步骤(1)所得表面展示载体pFastBaCI-gp64，构建成重组转移质粒pFastBacI-gp64-AMAl ；(3)取步骤( 所得的重组转移质粒pFastBaCI-gp64-AMAl转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上进行蓝白斑筛选，避光培养4(Γ4 !后挑取白斑，培养2(T24h后用异丙醇抽提重组杆状病毒基因组，并用M13通用引物做PCR鉴定；(4)取步骤C3)鉴定成功的重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液(T4°C保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得所述家蚕重组杆状病毒&iigp64AMAl。
3.—种权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒Bmgp64AMAl表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。
4.一种权利要求3所述蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)将权利要求1所述的重组杆状病毒Bmgp64AMAl感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增；(2)针刺接种法接入家蚕五龄幼虫或蚕蛹；(3)收集表达的权利3所述蛋白。
5.一种权利要求1所述重组杆状病毒Bmgp64AMAl在制备恶性疟疾疫苗中的应用。
6.一种权利3所述蛋白在制备恶性疟疾疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种恶性疟疾疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明通过构建一种家蚕重组杆状病毒，并运用重组杆状病毒表面展示技术构建表达恶性疟原虫主要抗原AMA1胞外域的重组杆状病毒，以家蚕蛹作为生物反应器生产该重组杆状病毒，并以此重组杆状病毒作为疟疾疫苗原生产疫苗。相比传统疫苗生产具有安全性好、生产成本低、产量高、易于操作、适用于大规模生产的特点。
文档编号C12N15/866GK102559613SQ20121000557
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者张耀洲, 申俊, 舒特俊, 陈剑清 申请人:特菲(天津)生物医药科技有限公司