专利名称：基于微小rna的宫颈癌诊断和治疗方法
技术领域：
本发明涉及用微小RNA(HIiciX)RNA)进行宫颈癌的诊断和治疗的方法。通过检测微小RNA的表达，对宫颈癌进行诊断；通过给病人抑癌作用的微小RNA，或者抑制致癌微小RNA的活性，达到治疗宫颈癌的目的。
背景技术：
众所周知，高危型HPV感染是宫颈癌发病的主要原因。E6和E7是在HPV感染的早期出现的两种主要癌蛋白，在宫颈癌组织和宫颈癌诱导的细胞系中均表达升高。尽管微小RNA的生物学功能还不十分清楚，ー些研究发现微小RNA可导致各种癌症的发生发展，而且它有可能參与细胞自然抵抗病毒感染的过程。微小RNA用于诊断有些微小RNA的降低导致了靶向的致瘤基因的调控紊乱， 进而加速了致瘤基因的转化。例如，在慢性粒细胞性白血病和前列腺癌中发现miR-15a，miR-16-l的表达缺失，在3'端的UTR区Bcl_2转录子与miR_15a，miR-16-l结合，从而降调抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达。同时miR-15a，miR-16-l促进白血病细胞系的凋亡。所以miR-15a，miR-16-l被认为是诱导原癌基因Bcl-2mRNA失活的肿瘤抑制剂。微小RNA与宫颈癌发病机制的关系之间的研究并不多见。我们用基因芯片的方法对1145种微小RNA在宫颈癌肿瘤组织和癌旁组织的表达进行了比较，发现了与宫颈癌的发病相关联的微小RNA.我们通过研究发现宫颈癌组织，宫颈癌细胞系的微小RNA表达谱，确定ー个精确的宫颈癌诊断和分类系统，也为发现新型治疗靶点提供了理论依据。微小RNA用于癌症的治疗一些微小RNA是癌基因，一些是抑癌基因,还有一些參与肿瘤的转移。因此模拟天然的Pri-微小RNA和Pre-微小RNA的人工微小RNA正应用于基因的研究和治疗领域。ー些研究表明微小RNAs可以作为很多疾病有用的治疗靶点。对于那些致癌性微小RNAs，它的潜在的治疗方法包括微小RNAs沉默，反义阻抑和微小RNA修正。而对于抑癌性微小RNAs，过表达它们可能是抑制肿瘤细胞生长的最有效的策略。微小RNA沉默是在它的生成过程中阻止其成熟的ー种方法。这可以通过干扰微小RNAs生成过程中的ー些成分如Drosha等的活性来实现,寡核苷酸导入不同的pri-微小RNAs中也可能干扰发卡结构的形成。Pre-微小RNA的siRNA也可抑制微小RNA的合成,但是它的效率却不高。化学修饰的寡核苷酸反义阻抑是最常用的ー种抑制微小RNA功能的方法，这些寡核苷酸叫做微小RNA“拮抗剂”，它们能够特异性的有效沉默微小RNA的表达。这种拮抗作用是特异的、有效的和长久的，它们可用于抗癌治疗中沉默癌性微小RNAs有力的工具。LNA (Locked nucleic acid)变更常常导致溶解温度的提高并且增加了双链的稳定性。LNA可以按照不同的模式合成，它的优点在于高的亲和力，好的甚至可以提高错配的识别能力，低毒性并且可以增加代谢的稳定性。它最吸引人的地方在于它在体内发挥抑制癌性微小RNAs的作用是RNAi永远也达不到的，也就是说LNA可以作为一个最有希望的抗癌的的反义治疗方法。
微小RNA激动剂可用模拟微小RNA结构的微小RNA模拟物(Mimics)，也可以通过表观遗传学的作用来提高细胞内源性抑癌性微小RNA的表达。近十年来，随着微小RNAs发现和研究的快速进展，微小RNA表达谱对阐明疾病发生机制和提供新的治疗策略将发挥重要作用。而且，微小RNAs的突变或异常表达以及他们所控制的通路可能将成为有用的治疗靶点。因此，微小RNA是肿瘤分类、早期检测、疾病预后、制定治疗方案和治疗靶点等方面的重要工具。
发明内容
本发明主要针对临床上宫颈癌的诊断和治疗效果不佳的问题，提供了基于微小RNA的诊断、治疗的解决方法。我们首先应用芯片技术对宫颈癌及癌周组织微小RNAs的表达情况进行了研究。我们应用的芯片中包含了 miRBase数据库中几乎所有的微小RNAs，这就为我们发现与宫颈癌发生、发展密切相关的微小RNAs提供了重要的技术支持和保障。本实验通过筛查用7个微小RNAs (4个上调，3个下调)将上述两组组织准确的区分开来，并且发现了miR-886-5p (也叫VaultRNA2)在宫颈癌组织中表达最高。miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a*在宫颈癌组织中表达明显高于癌周组织，是致癌性微小RNA ；而宫颈癌组织中表达下调的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b是抑癌性微小RNA ;测定这些微小RNA可帮助宫颈癌的诊断；miR-886-5p、miR-610, miR-10a*、miR_30a*的抑制剂可用于肿瘤的治疗；激活抑癌性微小RNAmiR-302d、miR-346、和miR_518b或者直接用这些抑癌性微小RNA的模拟物(mimics)也可以用于治疗宫颈癌。微小RNA可以调控细胞内重要的细胞凋亡通路，比如，miR-886-5p(VaultRNA2)降低细胞凋亡或细胞周期抑制蛋白Bax、p53和pl4的含量。提示这些微小RNA的作用物可以用干与化疗药的合并用药，提高化疗效果。本方法具有如下的优点和效果本发明用微小RNA进行宫颈癌的诊断。在以往的研究中，mRNA在临床主要应用于肿瘤诊断，预后分析和肿瘤的治疗。研究发现基于微小RNA的分类方法比基于mRNA的分类方法更为准确。因为相较需要分析成千上万的mRNA的方法，现在只需分析几百种微小RNAs即能有效的进行诊断。不同肿瘤特异的微小RNA表达谱可以成为癌症诊断和预后评判的有用的指标。另外，微小RNA特别稳定，不像mRNA —样容易分解。利用微小RNA进行治疗，可以同时进行靶向多个蛋白质，因为微小RNA常控制一系列功能蛋白的表达。以肿瘤特异性微小RNA作为靶点，可以减少对正常细胞的毒性作用。
图I为在宫颈癌肿瘤组织升高和降低的微小RNA图2为各个微小RNA的序列图3为过表达miR-886后细胞的生长增加
图4为用miR-886_5p的拮抗剂后细胞凋亡的变化图5为用miR-886_5p的激动剂(模拟物)后细胞凋亡蛋白质Bax的表达增加。
具体实施例方式实施实例I用Real-time PCR(实时定量PCR)的方法对宫颈组织或细胞的miR-886_5p进行定量分析。I.用Trizol等方法提取细胞总RNA，并进行定量；2.用 Stem-Loop 引物进行 microRNA 逆转录。MiR_886_5p Stem-Ioop RT引物序列5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGCTT-3'；上游引物序列为5'-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3'；下游引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；内參U6SnRNA:Stem-Ioop 引物为 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；上游引物序列为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；下游引物序列为5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。3.逆转录(Reverse-transcriptase, RT)体系的配制每个10 μ I的RT体系，其中加入O. 5-1 μ g的总RNA作为模板(另6对宫颈癌及癌周组织提取的总RNA，提取步骤同前)。体系如下(具体体系需要根据RT酶的说明而定)，在O. 5ml的薄壁管(或200 μ I PCR小管)中依次加入下列组分
总 RNA 模板O. 5-1 Ug
dNTP混合物(IOmM )0.5u I
IOOmM DTTO. 5 μ I
RNase 抑制剂 40U/ μ IO. 25 μ I
Stem-loop RT 引物(IwM)O. 5u I
M-MuLv反转录酶O. 5 U I
5X First-strand Buffer2 μ I
1%DEPC 水补足 10 μ IStem-Loop引物的microRNA逆转录,运行RT程序16 0C X30min42 °C X45min85 °C X5min4°C Hold Stem-Loop引物的microRNA逆转录，RT产物的保存短期使用，于4°C保存；长期保存，分装后置于-70°C。3. Real-time PCR 检测Real-time PCR 体系配制(25 μ I)
反应体系
Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix12. 5μ I
上游引物(ΙΟμΜ)1μ I
下游引物(IOuM)1μ I
cDNA 模板2 μ I 加无菌水至25 μ IPCR 程序为
95°C (I)6min
95O (2)30s
60°C (3)Imin
重复2—340次 根据(2_Λετ)计算每对样本的相对表达量。序列表〈110〉首都医科大学〈120〉基于微小RNA的宫颈癌诊断和治疗方法〈140>201210005318· X<141>2005-01-10<160>13<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>50<212>DNA〈213〉人工的〈220〉 <223>Stem-loop RT 引物〈400〉Igtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccgctt 50<210>2<211>18<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物
<400>2cgggtcggagttagctca18
<210>3<211>16<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>3gtgcagggtccgaggt16<210>4<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉<223>Stem-loop RT 引物<400>4ggaacgcttcacgaatttg19<210>5<211>23<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>5attggaacgatacagagaagatt23<210>6<211>19<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400>6ggaacgcttcacgaatttg23<210>7<211>23<212>RNA〈213〉人属(Homo Sapiens)〈220〉〈223>miR-886_5p<400>权利要求
1.我们对宫颈癌组织和癌旁组织的微小RNA(HiiciX)RNA)进行了比较，发现了一组在癌症表达升高的微小RNA，一组在癌症组织降低的微小RNA。我们的研究结果提示微小RNA可用于宫颈癌的诊断和治疗。
2.miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宫颈癌组织中表达明显高于癌周组织；而宫颈癌组织中表达下调的包括miR-302d、miR-346、和miR_518b ;测定这些微小RNA可帮助宫颈癌的诊断。
3.miR-886_5p、miR-610、miR-10a*、miR_30a* 的抑制物(inhibitor)用于宫颈癌的治疗；miR-302d、miR-346 和 miR-518b 模拟物(mimics)可以用于治疗。
4.上述微小RNA用于诊断时，可用原位杂交、PCR、测序等方法测定组织或/和血中的微小RNA浓度。
5.用于治疗时，抑制物和模拟物可用DNA、RNA或者肽结构的衍生物；可以局部和全身用药。
全文摘要
微小RNA用于宫颈癌的诊断和治疗。miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*在宫颈癌组织中表达明显高于癌周组织，是癌基因；而宫颈癌组织中表达下调的包括miR-302d、miR-346、和miR-518b，是抑癌基因。这些微小RNA可用于宫颈癌的诊断；miR-886-5p、miR-610、miR-10a*、miR-30a*的抑制物(inhibitor)用于宫颈癌的治疗；miR-302d、miR-346和miR-518b模拟物(mimics)或表达激动剂也可以用于宫颈癌的治疗。
文档编号C12N15/113GK102660542SQ201210005318
公开日2012年9月12日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者张玉祥, 李晶华, 贾弘褆, 郝启 申请人:首都医科大学