专利名称：分枝杆菌最低抑菌浓度检测系统的制备方法
技术领域：
本发明涉及分枝杆菌的药物最低抑菌浓度(MIC)检测或抗菌药物筛选领域，具体涉及一种分枝杆菌的药物最低抑菌浓度(MIC)检测系统的制备方法，所述检测系统适用于分枝杆菌、放线菌、真菌、细胞等药敏检测检测。
背景技术：
迄今为止，结核病仍是全球范围内最为常见的感染性疾病之一，尽管全球结核病总发病率已开始下降，但耐药现象日益严重。世界卫生组织(WHO)数据表明2010年世界结核病患者880万，死亡110万。不完善的治疗方案和管理措施已导致结核病耐药率及耐药程度逐渐增加，2010年至少有5%的新发病例或复发病例属于耐多药结核病(MDR-TB)。目前，中国仍是世界第二大结核病负担国，2010年患病人数达90-120万，2008年我国基线调查表明，涂阳肺结核患者中MDR-TB患病率为8. 32%，广泛耐药结核病O(DR-TB)为0. 68%。结核病的病原体是抗酸分枝杆菌，主要是结核分枝杆菌复合群，其次为非结核分枝杆菌(NTM)。由于结核分枝杆菌耐药的增加及NTM对一些常见抗结核药物的天然耐受，使分枝杆菌MIC的检测显得尤为重要。分枝杆菌MIC值反应了细菌的耐药程度，其准确而快速的检测对临床事实个体化治疗、药物剂量的优化以及抗结核新药的筛选具有重要作用。目前可用于结核分枝杆菌MIC值测定的方法按所使用的培养基类型分为两大类一是基于传统固体培养基的表型检测方法如琼脂稀释法、纸片琼脂扩散法、Etest法等；二是基于液体培养基中结核分枝杆菌的生长或其代谢反应为基础的检测方法具体有 BACTEC放射性检测系统、分枝杆菌生长指示管MGIT、肉汤常量稀释法、肉汤微量稀释法 (BMM)、硝酸还原法(NRA)、阿玛尔蓝(Alamar blue)法、刃天青法、四唑盐法等。由于固体培养基中药敏检测周期较长，药物降解、吸附明显，测定结果偏高，其运用受到一定的限制；而基于液体培养基检测方法中的BACTEC放射性检测系统虽然检测周期较短，但常只检测药物的一个临界浓度，且具有放射性污染。分枝杆菌生长指示管MGIT法解决了放射性污染问题，检测速度快，敏感度和特异性较高，但也仅进行药物一个浓度的检测，而不是MIC检测， 此外其成本较高难以在发展中国家广泛运用。肉汤常量稀释法消耗培养基较多，成本较高。 肉汤微量稀释法(BMM)，虽然降低了培养基的使用量，但其靠肉眼观察菌量进行判读，容易误读，且灵敏度有限。液体培养中的几种基于氧化还原指示剂的微量显色法检测周期相对较短，其测定结果与血药浓度更有可比性，具有巨大的运用潜能。目前所使用的微量显色法都是先将菌液培养一段时间后，打开培养板盖子，加入显示试剂，再进行短时间的培养显色，这既操作复杂又增加了污染几率，还容易引起生物安全问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测方法的不足，提供一种适用于分枝杆菌药物MIC 检测系统的制备方法，具有操作简便、快捷、稳定性好、污染率低可用简单设备或肉眼判读结果的优点。为分枝杆菌药物MIC检测、药物筛选等提供一种简单、快速、廉价的检测系统。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现分枝杆菌最低抑菌浓度检测系统的制备方法，包括以下步骤将配制好的50-200 微升、浓度为0. 01-400微克/毫升的含药液体培养基与5-100微升1 X IO3-I X IO8个/毫升的分枝杆菌菌液、5-50微升显色剂混合，在30-40摄氏度下恒温共培养3-14天后，进行显色检测，并根据显色检测结果，判定药物最低抑菌浓度，其中在混合后，所述显色剂的终浓度为0. 08-10毫摩尔/升。在本发明的一实施方式中，所述方法还包括将5-50微升的中间电子受体与所述含药液体培养基、分枝杆菌菌液、显色剂混合，其中在混合后，所述中间电子受体的终浓度为10-200微摩尔/升。在本发明的一实施方式中，所述分枝杆菌主要为结核分枝杆菌复合群，其次为非结核分枝杆菌(NTM)，还可以为放线菌、真菌或细胞。在本发明的一实施方式中，所述分枝杆菌菌液的制备为采用麦式比浊法或吸光度法获得一定浓度的菌液，按一定倍数进行稀释或不稀释后备用。在本发明的一实施方式中，所述含药液体培养基的配制是按照倍比稀释法用液体培养基稀释药物。在本发明的一实施方式中，在适当的培养载体中配制所述含药液体培养基，所述培养载体是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的离心管或不低于5毫升的试管。在本发明的一实施方式中，所述液体培养基为含有营养添加剂的无菌 Middlebrook 7H9液体培养基，或其他适合细菌、细胞培养的液体培养基。在本发明的一实施方式中，所述药物为异烟胼、利福平、链霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、环丝氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、莫西沙星、环丙沙星、加替沙星、司帕沙星、青霉素钠、头孢西丁、头孢噻肟、阿莫西林、美罗培南、亚胺培南、克拉维酸钾、红霉素、罗红霉素、克拉维酸、妥布霉素、强力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、对硝基-苯丙酸钠、或动物、植物、微生物的提取物或发酵产物、化学合成的化学单体。在本发明的一实施方式中，所述中间电子受体为醌(BQ)类衍生物；萘醌(NQ)类衍生物；蒽醌(AnthraquinonhAQ)类衍生物；吩嗪(Wienazine)类衍生物。优选地，所述中间电子受体为甲萘醌Q-Methyl-l，4-naphthoquinone)。优选地，所述中间电子受体为甲硫吩嗪(Phenazine methyl sulfate, PMS)或 1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(l-Methoxy-5-methylphenazinium Methylsulfate, I-Methoxy PMS)。在本发明的一实施方式中，所述显色试剂为刃天青、阿玛尔蓝、孔雀绿、硝酸还原试剂、或能产生水溶性甲臜的四唑盐类化合物。优选地，所述硝酸还原试剂为硝酸盐、氨基苯磺胺、或N-(l-萘)乙烯二胺盐酸盐。优选地，所述能产生水溶性甲臜的四唑盐类化合物为XTT或WST系列化合物。在本发明的一实施方式中，所述显色检测的检测方法为在分光光度计、荧光检测仪中采用一定波长进行检测，或直接通过肉眼观察，通过所获得的吸光度值或相对吸光度值，或肉眼观察到颜色的明显改变情况，判定分枝杆菌药物的MIC值。在本发明的一实施方式中，中间电子受体可以和显色剂混合均勻后一起加入到培养基中。本发明包括以下具体步骤1.按使用目的，选择合适的分枝杆菌培养载体；2.按使用目的，选择合适的液体培养基用于分枝杆菌的快速培养；3.按照使用目的及要求，配制一定浓度的分枝杆菌菌液；4.在步骤1的培养载体中，稀释或添加一定浓度的含药液体培养基；5.选择合适的中间电子受体，并配制成一定浓度的中间电子受体溶液；6.按使用要求，选择并配制一定浓度的显色剂；7.在步骤4所配制好的含药液体培养基中，依次加入一定体积的步骤3中的菌液，步骤6中的显色剂，此外在另一实施方式中还可加入步骤5中的中间电子受体；8.将步骤7中的反应体系在一定温度下恒温培养；9.培养后的反应体系采用一定的检测方法进行显色检测；10.根据步骤9中的检测结果，判定分枝杆菌药物的MIC值；所述步骤1中，培养载体为不低于2行5列的微孔板，不低于500微升的离心管或不低于5毫升的试管。所述步骤2中，培养基为含有营养添加剂(OADC)的无菌Middle brook 7H9液体培养基，或其他适合细菌、细胞培养的液体培养基。所述步骤3中，采用麦式比浊法或吸光度法获得一定浓度的菌液，按一定倍数进行稀释或不稀释后备用。所述步骤3中，所述分枝杆菌主要为结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌，其次可以为非结核分枝杆菌(NTM)，还可以为放线菌、真菌或细胞。所述步骤4中，先在各试验孔加一定体积的液体培养基，然后选取细菌培养载体中的某一孔，加入一定浓度、体积的药物，采用倍比稀释法形成不同浓度的含药培养基。所述步骤4中，各试验孔可直接加入一定浓度、体积的含药液体培养基。所述步骤4中，药物为异烟胼、利福平、链霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、环丝氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、莫西沙星、环丙沙星、加替沙星、司帕沙星、青霉素钠、头孢西丁、头孢噻肟、阿莫西林、 美罗培南、亚胺培南、克拉维酸钾、红霉素、罗红霉素、克拉维酸、妥布霉素、强力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、对硝基-苯丙酸钠、或动物、植物、微生物的提取物或发酵产物、化学合成的化学单体。所述步骤5中，中间电子受体主要为醌(BQ)类衍生物；萘醌(NQ)类衍生物， 如甲萘醌(2-Methyl-l,4-naphthoquinone)；蒽醌(Anthraquinone, AQ)类衍生物；吩嗪 (Phenazine)类衍生物，如甲硫吩嗪(Phenazine methyl sulfate,PMS)，1_ 甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(l-Methoxy-5-methylphenazinium Methylsulfate, I-Methoxy PMS)等。所述步骤6中，显色试剂主要为刃天青、阿玛尔蓝(Alamar blue)、孔雀绿、硝酸还原试剂(硝酸盐、氨基苯磺胺、Ν-α-萘)乙烯二胺盐酸盐)、及能产生水溶性甲臜的四唑盐类化合物(如XTT、WST系列化合物等)。所述步骤7中，中间电子受体可以和显色剂混合均勻后一起加入到培养基中。所述步骤9中，检测方法为在分光光度计、荧光检测仪中采用一定波长进行检测；或直接通过肉眼观察。所述步骤10中，通过所获得的吸光度值或相对吸光度值，或肉眼观察到颜色的明显改变情况，判定分枝杆菌药物的MIC值。与现有技术相比，本发明通过一开始将含药液体培养基、菌液、显色剂、中间电子受体共培养，省略了现有技术中的培养一段时间后再开盖加入显色剂的步骤，使操作更为简化，降低了操作污染及生物安全风险。本发明这一检测体系简单、安全、低污染、可目视并快速判读分枝杆菌药物的MIC值。
图1为采用96微孔板刃天青检测时药物稀释举例示意图。图2为采用96微孔板刃天青检测时药物和显色剂共培养前举例示意图。图3为采用96微孔板刃天青检测时共培养后显色举例示意图。图4为采用1. 5ml离心管孔雀绿检测时药物和显色剂共培养前举例示意图。图5为采用1. 5ml离心管孔雀绿检测时共培养后显色举例示意图。
具体实施例方式将通过以下实施例并结合附图，对本发明进行详细的说明，但不限制本发明的范围。结核分枝杆菌临床分离株A来自武汉市医疗救治中心。异烟胼、利福平、链霉素、 乙胺丁醇、左氧氟沙星、卡那霉素等药物购自美国Sigma公司。实施例1 1、选择一块无菌的96微孔板备用。2,Middle brook 7H9液体培养基配制取4. 9克Middle brook 7H9培养基干粉， 加入到含900ml蒸馏水的试剂瓶中，充分溶解，121°C高温灭菌30分钟。待培养基冷却至室温，按照10 1的比例加入营养添加剂0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)。_4°C保存备用。3、菌液的配制将结核分枝杆菌临床分离株A于罗氏培养基(市售)培养两周后， 取部分菌落用液体培养基重悬，加入6-7个3-4mm玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5 10分钟，静置10分钟后取上层均勻的悬浊液用液体培养基比浊至0. 5麦氏标准浊度，将此菌液用7H9液体培养基按1 20稀释后备用。4、抗结核药物的配制用Middle brook 7H9液体培养基配制200微升如下浓度的药物异烟胼(I，16yg/ml)，利福平(R，32 μ g/ml)，乙胺丁醇(E，128 μ g/ml)，链霉素(S， 32 μ /ml)，左氧氟沙星(0FL0,128 μ /ml)，卡那霉素(KAM，160 μ /ml)。5、按照图1，各实验孔加入100微升7H9液体培养基。6、按照图1，各行第一孔加入100微升相应的药物。按照对倍稀释法稀释药物，最终为如图1所示药物浓度。7、各实验孔加入100微升菌液，阴性对照孔(_)加入100微升7H9液体培养基。8、各实验孔加入20微升0. 02%的刃天青显色剂，剩下各孔加入200微升无菌水补齐，见图2。然后37°C恒温培养7天。9、肉眼观察显色情况，阳性对照孔⑴颜色由蓝色变为粉红色，阴性对照孔㈠未发生颜色改变，则开始判读MIC。将阻止颜色发生变化的孔所对应的药物浓度定为该药物的MIC值。如图3，结核分枝杆菌临床分离株A的异烟胼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、左氧氟沙星、卡那霉素的 MIC 值分别为 0. 25μ g/ml、0. 125 μ g/ml、4 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、1 μ g/ml、 2. 5 μ g/ml ο实施例2 1、选择8个1.5ml无菌离心管备用。2,Middle brook 7H9液体培养基配制取4. 9克Middle brook 7H9培养基干粉， 加入到含900ml蒸馏水的试剂瓶中，充分溶解，121°C高温灭菌30分钟。待培养基冷却至室温，按照10 1的比例加入营养添加剂0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)。_4°C保存备用。3、菌液的配制将结核分枝杆菌临床分离株A于罗氏培养基(市售)培养两周后， 取部分菌落用液体培养基重悬，加入6-7个3-4mm玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5 10分钟，静置10分钟后取上层均勻的悬浊液用液体培养基比浊至0. 5麦氏标准浊度，将此菌液用7H9液体培养基按1 20稀释后备用。4、抗结核药物的配制用7H9液体培养基配制16 μ g/ml的异烟胼200 μ 1。5、如图4，各管加入100微升7Η9液体培养基。6、如图4，1号管加入100微升所配制的异烟胼。按照对倍稀释法从1号管到6号管稀释药物，最终各管药物浓度分别为4μ g/ml、2y g/ml、ly g/ml、0. 5μ g/ml、0. 25 μ g/ ml、0.125 μ g/ml。7、1-6号管加入100微升菌液，7号管加100微升7H9液体培养基作阴性对照，8号管加100微升菌液作阳性对照。8、各管加入20微升0. 02%的孔雀绿显色剂，如图5。然后37°C恒温共培养7天。9、肉眼观察显色情况，阳性对照管(8号管)颜色由绿色变为无色，阴性对照管(7 号管)未发生颜色改变，则开始判读MIC。将阻止颜色发生变化的管所对应的药物浓度定为该药物的MIC值。如图5，异烟胼的MIC值为1 μ g/ml。实施例3 1、选择一块无菌的96微孔板备用。2,Middle brook 7H9液体培养基配制取4. 9克Middle brook 7H9培养基干粉， 加入到含900ml蒸馏水的试剂瓶中，充分溶解，121°C高温灭菌30分钟。待培养基冷却至室温，按照10 1的比例加入营养添加剂0ADC(0. 酪蛋白胨，0.5%甘油，10%油酸、牛血清
白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶)。_4°C保存备用。3、菌液的配制将结核分枝杆菌临床分离株A于罗氏培养基(市售)培养两周后， 取部分菌落用液体培养基重悬，加入6-7个3-4mm玻璃珠在漩涡震荡器上磨菌5 10分钟，静置10分钟后取上层均勻的悬浊液用液体培养基比浊至0. 5麦氏标准浊度，将此菌液用7H9液体培养基按1 20稀释后备用。4、抗结核药物的配制用Middle brook 7H9液体培养基配制200微升如下浓度的药物异烟胼(I，16 μ g/ml)，利福平(R，32 μ g/ml)，乙胺丁醇(E，128 μ g/ml)，链霉素(S， 32 μ /ml)，左氧氟沙星(0FL0,128 μ /ml)，卡那霉素(KAM，160 μ /ml)。5、中间电子受体的配制称取0.014g甲萘醌，溶于IOml 二甲基基亚砜(DMSO)，0. 22 μ m滤膜除菌，4°C保存备用。6、水溶性四唑盐WST-8的配制称取0. 034g WST-8粉末，溶于5ml无菌水蒸馏水， 0. 22 μ m滤膜除菌，4°C保存备用。7、中间电子受体、四唑盐混合液的配制第5、6步中配制的WST-8与甲萘醌溶液按照9 1的比例混合，终浓度为IOmM的WST-8和0. 8mM的中间电子受体混合液。5、按照图1，各实验孔加入100微升7H9液体培养基。6、按照图1，各行第一孔加入100微升相应的药物。按照对倍稀释法稀释药物，最终为如图1所示药物浓度。7、各实验孔加入100微升菌液，阴性对照孔㈠加入100微升7H9液体培养基。8、各实验孔加入20微升WST-8和甲萘醌中间电子受体混合液(反应体系中 WST-8、甲萘醌终浓度为ImM和80 μ M)。剩下各孔加入200微升无菌水补齐。然后37°C恒温培养7天。9、肉眼观察显色情况，阳性对照孔⑴颜色由淡黄色(或无色)变成棕色，阴性对照孔(_)未发生颜色改变，则开始判读MIC。将阻止颜色发生变化的孔所对应的药物浓度定为该药物的MIC值。结核分枝杆菌临床分离株A的异烟胼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、左氧氟沙星、卡那霉素的 MIC 值分别为 0. 25μ g/ml、0. 125 μ g/ml、4 μ g/ml、0. 25μ g/mlUu g/ ml、2.5 μ g/ml。
权利要求
1.一种分枝杆菌最低抑菌浓度检测系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将配制好的50-200微升、浓度为0. 01-400微克/毫升的含药液体培养基与5-100微升 1 X IO3-I X IO8个/毫升的分枝杆菌菌液、5-50微升显色剂混合，在30-40摄氏度下恒温共培养3-14天后，进行显色检测，并根据显色检测结果，判定药物最低抑菌浓度，其中在混合后，所述显色剂的终浓度为0. 08-10毫摩尔/升。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将5-50微升的中间电子受体与所述含药液体培养基、分枝杆菌菌液、显色剂混合，其中在混合后，所述中间电子受体的终浓度为 10-200微摩尔/升。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述分枝杆菌菌的制备为采用麦式比浊法或吸光度法获得一定浓度的菌液，按一定倍数进行稀释或不稀释后备用。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述含药液体培养基的配制是按照倍比稀释法用液体培养基稀释药物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在适当的培养载体中配制所述含药液体培养基，所述培养载体是不低于2行5列的微孔板、不低于500微升的离心管或不低于5毫升的试管。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为含有营养添加剂的无菌Middle brook 7H9液体培养基，或其他适合细菌、细胞培养的液体培养基。
8.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述药物为异烟胼、利福平、 链霉素、比嗪酰胺、乙胺丁醇、对氨基水杨酸、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、环丝氨酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺、莫西沙星、环丙沙星、加替沙星、司帕沙星、 青霉素钠、头孢西丁、头孢噻肟、阿莫西林、美罗培南、亚胺培南、克拉维酸钾、红霉素、罗红霉素、克拉维酸、妥布霉素、强力霉素、甲硝唑、替硝唑、噻吩-2-羧酸酰胼、对硝基-苯丙酸钠、或动物、植物、微生物的提取物或发酵产物、化学合成的化学单体。
9.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述中间电子受体为醌类衍生物； 萘醌类衍生物；蒽醌类衍生物；吩嗪类衍生物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述中间电子受体为甲萘醌。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述中间电子受体为甲硫吩嗪或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐。
12.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述显色试剂为刃天青、阿玛尔蓝、孔雀绿、硝酸还原试剂、或能产生水溶性甲臜的四唑盐类化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述硝酸还原试剂为硝酸盐、氨基苯磺胺、或Ν-α-萘)乙烯二胺盐酸盐。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述能产生水溶性甲臜的四唑盐类化合物为XTT或WST系列化合物。
15.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述所述显色检测的检测方法为在分光光度计、荧光检测仪中采用一定波长进行检测，或直接通过肉眼观察，通过所获得的吸光度值或相对吸光度值，或肉眼观察到颜色的明显改变情况，判定分枝杆菌的药物最低抑菌浓度值。
全文摘要
本发明提供一种分枝杆菌MIC检测系统的制备方法，其包括以下步骤将配制好的含药液体培养基与一定体积的分枝杆菌菌液、显色剂的反应体系在一定温度下恒温共培养一段时间后，采用一定的检测方法进行显色检测，并根据显色检测结果，判定药物最低抑菌浓度。与现有技术相比，本发明通过一开始将含药液体培养基、菌液、显色剂、中间电子受体共培养，省略了现有技术中的培养一段时间后再开盖加入显色剂的步骤，使操作更为简化，降低了操作污染及生物安全风险。本发明这一检测体系简单、安全、低污染、可目视并快速判读分枝杆菌药物最低抑菌浓度值。
文档编号C12Q1/18GK102559844SQ20121000511
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者余晓丽, 孙战强, 张朝宝, 张舒林, 王洪海 申请人:上海交通大学