专利名称：一种重组人巨细胞病毒蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种人巨细胞病毒蛋白及其应用。
背景技术：
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，简称HCMV)属疱疹病毒β亚科，是一种DNA病毒，其感染在人群中广泛存在，我国人群中HCMV感染相当严重。妇女在妊娠初期受HCMV原发感染是引起胎儿宫内感染和发育缺损的重要原因，在孕期原发性感染HCMV的胎儿和新生儿中，80%可导致智力低下、畸形和死亡[Middeldorp JM. Jongsma J，Haar AT, et al.Detection of immunoglobulin M and G antibodies against cytomegalovirus early and late antigend by enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin. Microbiol, 1984 ；20 (4) :763-771. ]。HCMV也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染死亡的主要原因之一。对非免疫缺陷者常导致长期隐性感染，甚至引起感染细胞的转化、畸变或癌变等 [Huang ES.The pathogenicity of Human Cytomegalovirus. Springer-Vellag.Berin， 1993，1-45]。因此快速准确的诊断HCMV病毒感染具有十分重要的意义。目前巨细胞病毒感染诊断方法有脱落细胞及组织病理检查、病毒分离、分子杂交试验和血清学检查，但由于前三种方法技术设备要求高，检测周期长的局限性，无法广泛使用，而血清学检查具有简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用，目前大多检测试剂采用盒用的HCMV蛋白质抗原主要是来源于病毒培养物或是重组表达的单一蛋白片段，或者由于蛋白质抗原纯度低及特异性差，造成假阳性而降低检测特异性；或者由于单一片段抗原蛋白所含抗原决定簇较少，所识别的抗体相应较少，易造成假阴性而降低检测敏感性，虽然多种单一片段组合制备检测试剂也可以避免上述问题，但必然要求多次进行提取纯化过程，而且小分子蛋白质或多肽的提纯技术要求更高，工作效率太低。另外，在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段，HCMV疫苗的研制也是进行HCMV研究的重要领域之一，而疫苗研究的一个重要前提是其所用蛋白质抗原应具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，因此开发一种多抗原决定簇串联的重组蛋白质技术是十分必要的。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种重组人巨细胞病毒蛋白，本发明的另一目的是提供该重组人巨细胞病毒蛋白在制备检测试剂盒中的应用。(二)本发明的技术方案本发明提供了一种编码人巨细胞病毒蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的人巨细胞病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ
3ID NO 2 所示。本发明还提供了一种人巨细胞病毒蛋白的表达载体pETj8a-HCMV，它是将SEQ ID NO 1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图 2所示。将表达载体pET18a-HCMV导入大肠杆菌中，得到表达人巨细胞病毒蛋白的工程菌株。本发明利用SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人巨细胞病毒蛋白可以通过如下步骤实现1)获得具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET_28a质粒；3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)菌株中；4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。本发明提供的检测人巨细胞病毒感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明所述的重组人单纯疱疹病毒蛋白。用于标记人巨细胞病毒蛋白的标记物选白自制胶体金、辣根过氧化物酶(HRP)。本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgG抗体划线包被浓度为 2. Omg/ml,HCMV抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。抗人IgG抗体划线量为1. 0μ 1/cm，胶体金结合物喷点量为25. 0μ 1/cm。兔抗巨细胞病毒抗体包被量为 1. 0 μ 1/cm,包被浓度为 5. Omg/ml。以下将更详细的描述本发明的技术方案本发明公开了一种编码人巨细胞病毒蛋白的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列， 利用该核苷酸序列制备人巨细胞病毒蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的人巨细胞病毒蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人巨细胞病毒感染的应用。SEQ ID NO :1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，优选根据目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(P1，P2)和(P3，P4)。pi和p2用于扩增ppl50第1447位到第2046位核苷酸， P3和p4用于扩增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4分别带有NdeI和XhoI 的酶切位点，引物P2和p3顺序互补，并共同对应于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT以人巨细胞病毒培养物为模板，以引物Pl和P2扩增ppl50片段，以引物P3和P4 扩增pp65片段；再以第一轮PCR扩增得到的ppl50片段和pp65片段为模板，加入引物Pl 和P4，扩增pp 150pp65片段；得到串联的目的基因重组片段pp 150pp65。
本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。本发明的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列制备人巨细胞病毒蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码人巨细胞病毒蛋白的如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。编码本发明蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子和pETj8a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的人巨细胞病毒蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列。本发明的一个实施方案涉及包含本发明人巨细胞病毒蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人单纯疱疹病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的巨细胞病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有人巨细胞病毒抗体， 就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成人巨细胞病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断人巨细胞病毒感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器， 其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。在用于人巨细胞病毒感染检测的试剂盒中，本发明的人巨细胞病毒蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶， 过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3' ,3' ,5' ,5'，-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H2O2作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。(三)有益效果采用本发明提供的重组人巨细胞病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人巨细胞病毒感染临床诊断的需要。本发明提供的HCMV蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在 HCMV疫苗研制领域具有实际应用价值。
图IPCR扩增产物的凝胶电泳图；图2是表达质粒pETj8a-HCMV的构建流程图3是诱导后菌体12% SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例1巨细胞病毒蛋白的制备1. 1巨细胞病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆通过计算机分析巨细胞病毒的全部氨基酸序列筛选出巨细胞病毒蛋白的强抗原表位，所述的重组蛋白质从N-末端到C-末端依次含有HCMV ppl50从N-末端第483位到第682位的200个氨基酸和pp65从N-末端第357位到545位的189个氨基酸。其中上述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No. 2所示，所述的ppl50目的肽段DNA序列是第1447位到第2046位核苷酸，pp65目的肽段DNA序列是第1069位到第1635位核苷酸。根据目的片段的DNA序列，即HCMV ppl50和pp65上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计两对PCR引物(PI, P2)和(P3，P4)。pi和p2用于扩增ppl50第1447 位到第2046位核苷酸，p3和p4用于扩增pp65第1069位到第1635核苷酸；引物pi和p4 分别带有NdeI和B10I的酶切位点，引物p2和p3顺序互补，并共同对应于ppl50上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物序列如下Pl:ATCGCATATGGGTGACGGGCGGTTTGGCGP2 GAAGAGGAAAAGCGTCGCGAGCGGCAGP3 :TCGCGACGCTTTTCCTCTTCGTCGTAGCAAACCAGCTCGTP4 :ATCGCTCGAGTTAGGGCACGTGCTGATAGCCGTGTTT上述引物由(华美生物技术有限公司)合成。以人巨细胞病毒培养物(中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物Pl 和P2扩增ppl50片段，以引物P3和P4扩增pp65片段；再以第一轮PCR扩增得到的ppl50 片段和pp65片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增ppl50pp65片段；得到串联的目的基因重组片段ppl50pp65 ；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA 条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称=TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。1. 2表达载体pET18a-HCMV的构建及鉴定pET_28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物目的DNA片段经 NdeI 和 XhoI 双酶切，产物纯化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmid purification 试剂盒， 购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌 BL2KDE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和B10I双酶切、 鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-HCMV。1. 3表达人巨细胞病毒蛋白的工程菌的构建
将表达质粒pET-28a-HCMV用化学转化法((美)J.萨姆布鲁克 (JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW. Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12% SDS-PAGE分析 (同上文献)，结果如附图3所示，确定表达人巨细胞病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株， 用甘油冷冻保存。1. 4重组人巨细胞病毒蛋白的表达制备及纯化诱导培养已构建的表达人巨细胞病毒蛋白的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1 10 (W/V)加入菌体裂解液(50mm pH 8. OTris-Cl, 50mm NaCl,50% 甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒， 超声80次)、组氨酸亲和柱(300ml 200mm的NiC12过柱，流速5ml/min ；500ml平衡缓冲液洗注，流速lOml/min ；超声离心后的沉淀用200ml平衡缓冲液稀释后上样，流速3ml/min， 500ml平衡缓冲液洗注，流速5ml/min ；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各IOOml的洗脱缓冲液洗脱，紫外检测R^Onm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。1. 5 重组蛋白 1Western-Wot 验证为验证重组HCMV型蛋白质与抗HCMV抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为10份兔抗HCMV抗体阳性血清(购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗HCMV抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为10份对照正常兔血清和30份人抗HCMV抗体阴性血清(经ELISA法检测证实)。结果如表1。表1重组蛋白Western-blot验证结果
权利要求
1.一种编码人巨细胞病毒蛋白核酸，如SEQ ID N0:1所示。
2.包含权利要求1所述核酸的人巨细胞病毒蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的核酸插入到质粒pET-28a上得到的重组pETj8a-HCMV质粒。
3.—种人巨细胞病毒蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一种重组人巨细胞病毒蛋白的制备方法，其特征在于应用权利要求1的重组DNA构建表达载体，并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述重组DNA编码的重组人巨细胞病毒蛋白。
5.一种表达人巨细胞病毒蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pETj8a-HCMV，宿主菌为大肠杆菌。
6.一种检测人巨细胞病毒感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求 2所述的人巨细胞病毒蛋白。
7.根据权利要求2所述的人巨细胞病毒蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种人巨细胞病毒蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的编码人巨细胞病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人巨细胞病毒蛋白感染临床诊断的需要。
文档编号C12N15/38GK102533795SQ20121000491
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者张晓刚, 王健, 王志新, 陈廷友 申请人:英诺特(唐山)生物技术有限责任公司