一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法。本发明的表皮细胞和真皮细胞来源于胎儿头皮、新生儿包皮或成人头皮，将表皮细胞和真皮细胞分开培养并进行传代，所用的培养基及培养方法能维持皮肤细胞的多功能性；将培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后混合制成悬浮液；然后转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上进行孵育；然后移植粘附膜上的细胞到受体上。该方法可以再生出人的完整的有功能的皮肤和毛发，再生的皮肤含有表皮层，真皮层和皮下组织及皮肤附属器官。用该技术再生的皮肤和毛发模型可应用于对人皮肤和毛发疾病的研究，对皮肤药物的筛选，还可用于开发细胞产品来治疗创伤、秃顶等皮肤疾病。
【专利说明】一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，本发明还涉及该方法制备的皮肤和毛发模型，以及该模型在对人皮肤和毛发疾病的研究，皮肤药物的筛选和开发治疗创伤和秃顶的临床产品方面的应用。属于组织细胞学和组织工程学领域。
【背景技术】
[0002]长期以来，皮肤学家和皮肤外科医生一直在努力实现能在临床上再生出有完整功能的皮肤，用于治疗皮肤的创伤和消除皮肤疤痕。有很多原因会造成皮肤的损害:比如遗传疾病、烧烫伤、慢性创伤如糖尿病引起的创伤。很多皮肤损害以后自身不能恢复，比如深度的大面积烧烫伤，皮肤大面积损伤后极易引发感染而导致死亡。目前，最普通的治疗方法是用手术移植自身其他部位没有损伤的皮肤到烧烫伤处。然而，这方法有很大局限性，一方面如果大面积烧伤，自身正常皮肤的来源有限；另一方面，移植后的皮肤存活率低也是目前临床面临的重大挑战。所以需要体外培养得技术来扩增细胞用于移植。目前用培养扩增的细胞结合框架蛋白如胶原蛋白一起来形成人皮肤的替代品在临床上代替完整的皮肤移植起着很大的应用价值，但该皮肤替代品只是形成薄薄的表皮和真皮，不能形成皮下组织和皮肤的附属器官像毛发、汗腺等，是没有正常功能的皮肤产品。再比如糖尿病人常见的足部溃疡，由于糖尿病人的微环境导致这种皮肤溃疡很难愈合，目前没有好的方法治疗。
[0003]组织工程学治疗脱发包含了移植皮肤组织或细胞到目标区域来诱导毛囊形成。毛囊的诱导与生长需要活性上皮细胞与间质细胞之间的持续地相互作用。然而不是所有自毛囊皮层移植所得的细胞都有能力诱导出新毛囊的生成。以往的研究表明，从人体头皮上分离出来的毛囊可以被移植到免疫缺陷的老鼠背上，之后成功地恢复到正常再生循环。通过移植体外培养突变型(TSCII基因缺乏)成纤维细胞形成的人类皮肤替代品而成功再生出毛发。然而，该再生的毛囊不能形成正常的毛干，而形成正常的毛干是判断是否形成成熟毛囊的核心要素之一。其他研究表明，由表皮细胞与间质细胞组成的皮肤替代物可用于移植来促进毛囊形成。由郑等人申请的美国专利2012/0095445，描述了在体外从分离的表皮与真皮细胞中生成毛囊的方法与试剂，这些细胞是单独培养，传代，然后组合形成其后被植入的毛囊。然而，因为毛囊必须在体外形成后再植入，这个过程是受限制的。
[0004]李等的美国专利(专利号2011/0321180)报道了从新生小鼠新鲜分离的小鼠皮肤干细胞再生成鼠类毛囊。因为新鲜分离细胞的数量是有限的，再生皮肤就需要使用培养扩增的细胞。不幸的是，多能性细胞在培养中经常会导致细胞分化造成所需细胞类型能力的丢失。另外这个发明专利没有报道人的 皮肤和毛发的再生。这个研究是用的是新鲜分离的老鼠细胞，而不是体外培养的人细胞。
[0005]总之，在目前，世界上还没有能用体外培养扩增的细胞来再生出完整有功能性并带有成熟毛发的人的皮肤。
【发明内容】
[0006]我们发明了人类皮肤多功能细胞的分离和培养方法，以及移植该培养的细胞到小鼠身上再生出完整的有功能人类皮肤的技术。该技术包括通过获取多功能表皮和真皮细胞的分离方法、多功能表皮和真皮细胞体外增殖并维持多功能性的培养方法。通过上述技术方法再生的人类皮肤含有带有正常表皮、真皮和一个完整的皮下组织层。该再生的皮肤含所有的皮肤附属品包括毛发、皮脂腺、汗腺、神经和血管。而再生的毛发拥有正常色素并能周期循环生长的成熟的人类毛囊。再生的皮肤在小鼠上所覆盖的面积在0.1~2cm2区域内，每Icm2可产生50-2000个成熟的毛囊。
[0007]本发明的技术方案是:一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤:
[0008](I)采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本；另外来自任何组织的S0X2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞；
[0009](2)将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶(Dispase蛋白水解酶)于低温4°C过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；
`[0010](3)将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶(typsin)中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出多功能真皮细胞；
[0011](4)从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞可用任何可供细胞自然生长的培养基培养，包括MEM，DMEM, RPMI, F_12，CNT07等结合不同生长因子如纤维细胞生长因子(FGF)，表皮细胞生长因子(EGF)，B27 (神经细胞培养)因子和PC-1(原代细胞培养)补充液等；推荐细胞培养基为含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基；表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10 μ M Rock蛋白激酶抑制剂如Υ-27632来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境应接近人体生理环境，培养基PH值为6-8，优选
7.4 ;细胞的培养温度为30-40°C，优选为35°C -37°C ;另外可结合低氧培养(2%_10%)或细胞聚集培养的方法来增强细胞的多功能性，及增加真皮细胞S0X2基因的表达。
[0012](5)真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1:3-6比例传代，可传2-6代；表皮细胞按1:2-4的比例传代，至少可传2-4代；
[0013](6)培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞:真皮细胞为1-10:1的数量比在DMEM/F12(1:1)培养液中混合制成混合细胞悬浮液，总体积在100-200微升；混合细胞悬浮液可同时加入其功能性细胞如黑色素细胞，内皮细胞等；然后将混合细胞悬浮液转移到带有3.0 μ m透气孔径的半渗透性聚合物(如聚对苯二甲酸乙二醇酯膜)或硅胶膜底物上，并于37°C环境中孵育1-2个小时，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；
[0014](7)移植细胞到受体:先在受体上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口 ；然后将附着有真皮细胞和表皮混合细胞液的底物覆盖在整个伤口上，细胞面接触伤口，底物面朝上；并将底物与皮肤缝合，包扎，或者可以将含有传代细胞的混合细胞悬浮液直接注入皮肤或毛发需要的再生部位。通过实验证明将细胞混合物至于伤口处，移植的细胞可自身组织并相互刺激和诱导，促使包括毛囊和相关腺体等人体完整皮肤结构的形成。
[0015]使用转化生长因子β I抗体和β 2抗体(TGF betal/beta2)，促肾上腺皮质激素(ACTH)、促黑细胞激素α抗体(alpha MSH)、环孢霉素A (Cyclosporine A) or雷帕霉素(Rapamycin)等局部免疫抑制剂来配合细胞的移植，这样可减少炎症和移植排斥反应。这些局部免疫抑制剂可在移植细胞之前或之后，通过浅注射，微针疗法或局部疗法，免疫抑制剂可被传输至受体内。
[0016]该技术可以应用于建立人的皮肤模型来做药物测试和筛选；测试皮肤腐蚀的模型；建立再生人的皮肤来评价新的治疗技术，如激光治疗术，冷冻治疗术，真皮磨损术等。
[0017]该技术可以用于建立再生人的皮肤来研究药物皮肤给药方法；研究紫外线和光照对皮肤的损害；研究治疗皮肤疾病的药物；研究治疗毛发疾病的药物；研究治疗汉腺疾病的药物；研究治疗皮脂腺疾病的药物；研究皮肤抗衰老；研究皮肤消脂药物；研究皮肤静脉曲张的疾病；研究个性治疗和个性的药物筛选。
[0018]该技术可以用于建立人的建立人皮肤创伤和烧伤模型；建立糖尿病人皮肤溃疡的模型；建立毛发生长的动物模型；建立特殊皮肤疾病模型:如牛皮癣，皮肤癌，湿疹，斑秃，雄性秃发，表皮水泡病，粉刺，白化病，皮肤老化等。
[0019]该技术可以用于开发细胞产品用于临床上治疗再生毛发和皮脂腺；治疗各种秃发疾病；促进创口愈合；治疗慢性伤愈合；治疗糖尿病的皮肤溃瘍；治疗症痕组织的愈合；治疗疤痕组织并形成功能正常的汗腺，皮下组织和皮脂腺；用于无疤痕的创伤愈合；用于耳，鼻和眼睑的修复；去除纹身后的皮肤愈合；治疗牛皮癣和皮肤白化病；治疗皮肤内神经的损害以及再生皮下组织来治疗皮肤老化和抗皱。
[0020]本发明的有益成果是，在以下的实例中，我们成功的显示了用体外培养的来自胚胎头皮的真皮细胞和来自新生儿的包皮表皮细胞混合后移植到免疫缺陷的裸鼠背上再生出人的完整皮肤并包含全皮下组织层和成熟的毛囊。再生的皮肤和毛囊都有正常的色素沉着。再生的皮肤在鼠身上能将维持其人类皮肤的形态和性能至少在6个月以上。另外我们也显示再生的皮肤具有创伤愈合的功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为裸鼠移植6个月后再生皮肤和毛发的照片；其中右图为左图的放大图片；该图显示再生的皮肤是有色素沉着的
[0022]图2为图1的6个月再生皮肤的组织切片图。该图显示再生皮肤的结构和正常人的头皮结构相似含有表皮层、真皮层，皮下组织层和成熟的毛囊及皮脂腺。
【具体实施方式】
[0023]可参考以下实例进一步理解上述创新:
[0024]实例:用体外培养扩增的细胞在裸鼠上再生出人功能性的皮肤和毛囊
[0025]材料和方法:
[0026]动物:免疫缺陷的裸鼠(或纯合子nu/nu突变鼠)或非糖尿病肥胖小鼠/重症联合免疫缺陷鼠是白化鼠，这两种鼠都因免疫缺陷使其降低对异体组织等产生排异反应，因此适于作为各种异种组织移植和肿瘤移植。[0027]细胞和细胞培养基:解离的表皮细胞取自人类新生儿包皮。真皮细胞来自15周胎儿的头皮。细胞从组织分离后，真皮细胞培养基DMEM/F12(1:1) (Gibco, Cat.#11039)中培养。而表皮细胞在含有蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y27632的CNT07培养基里中培养。真皮细胞和表皮细胞需分别培养到第三周期，第三代。然后以1:1比例混合制成150 μ I细胞悬浮液DMEM/F12 (1:1) (Gibco, Cat.#11039)。然后将细胞悬浮液转移到硅胶膜(Invitrogen)上，并置于37°C细胞培养箱中培养1-1.5个小时，使细胞完全附着硅胶膜。
[0028]细胞的移植:从有免疫缺陷的裸鼠背上切取全层皮肤形成开放的伤口，将附有细胞的硅胶膜覆盖于鼠的伤口上，细胞面与伤口直接接触，硅胶膜覆盖在上面。每只裸鼠身上可做I到2个移植，并将硅胶膜与裸鼠皮肤缝合，将涂有药膏的消毒纱布至于伤口上，并用消毒绷带包裹裸鼠。移植后的裸鼠每周观察并拍照记录，可观察12周到一年。
[0029]组织学分析:在观察末期可用解剖光学显微镜检查在鼠身上再生的新皮肤，并切除收集再生皮肤的样本，样本冷冻处理后做10 μ m组织生理切片，苏木紫-伊红染色方法染色。简而言之，组织生理切片先在10%的福尔马林中浸泡定形，用IxPBS冲洗，用苏木紫染色三分钟，再用蒸馏水冲洗，然后用伊红染色30秒。再分别用浓度为70%，90%和100%的乙醇冲洗和脱水。脱水后切片用二甲苯漂净，盖玻片覆盖，用二甲苯基定型剂固化定型，并用光学显微镜检测再生皮肤的组织结构。
[0030]碱性磷酸酶(AP)着色:根据产品的操作手册(罗氏NBT/BCIP原液，Cat#l 1681451001)对6周和12周的移植物进行AP着色。将10 μ m冰冻的组织生理切片经PBS漂洗，再冰冻的丙酮固定10分钟。用I X PBS溶液漂洗两次，各5分钟，置于AP缓冲液(0.1M Tris-HCL, ρΗ9.5，0.1M NaCl, 0.05Μ MgC12)中5分钟，用新鲜配置的染色液(200 μ I NBT/BCIP原液溶于IOmlAP缓冲液中)固色5_30分钟。阳性AP反应会产生深蓝色着色效果，隔5分钟 显微镜观察一次，以确定孵育时间。深蓝色着色效果出现后，去除染色液，冲洗切片。然后用伊红复染30秒，乙醇脱水，盖玻片覆盖，二苯基固形剂固定。
[0031]利用绿色荧光蛋白(GFP)表达的培养细胞来再生皮肤:为产生GFP-表达细胞，用GFP表达的逆转录病毒传染包皮的角质细胞或新生儿头皮真皮细胞，每T75细胞培养瓶用量为6毫升的病毒液。感染三小后替换为正常生长培养基。次日，收集感染的细胞并与未感染的包皮角质细胞或真皮细胞混合，混合的细胞悬浮液像上述叙述的方法进行移植到裸鼠身上，监测其变化，并与12周后收集再生的皮肤，并用荧光显微镜检查是否形成绿色的再生皮肤。
[0032]荧光免疫检验法分析:荧光免疫检验法应按标准进行操作。冷冻后做10 μ m切片，用4%多聚甲醛/PBS固定10分钟，PBS冲洗，室温下封闭缓冲液孵育(10%驴血清+2%牛血清蛋白的PBS)1小时。一抗孵育:基底膜标记一抗(共轭鼠抗牛血清白蛋白(⑶49) α 6-合素(干细胞，cat.10111))、表皮细胞或底层细胞层标记(抗人角蛋白(BD，cat.550951))或真皮(间叶)细胞标记(兔抗波形蛋白(细胞信号传导，cat.3932))。将切片置于以上抗体溶液中4°C孵育过夜。次日，将切片置于PBS溶液中冲洗，二抗孵育I小时。用含有固形剂的DAPI (Vector Laboratory)固形,通过共聚焦显微镜分析来检查各蛋白的表达情况。
[0033]结果:
[0034]手术后每周观测老鼠移植处的皮肤形成情况。移植4周后，移植处的创面已完全愈合，并形成有色素的新皮肤，没有疤痕形成，说明可以用于无疤痕的创伤愈合。到第12周，皮肤表面产生肉眼清晰可辨的带有色素的毛发。因为免疫缺陷的裸鼠没有黑色素细胞不会形成色素的皮肤和毛发，说明新生的皮肤和毛发是来自移植的培养的细胞。长出来的毛发可以持续增长，6个月可以达到3cm长(如图1所示)。这进一步证明可通过向移植区或周边皮肤注射或和皮肤细胞混合，并配合使用免疫抑制剂，同种异体的黑色素细胞可被应用到再生的皮肤和毛囊中达到外观上接受的肤色。
[0035]6个月组织切片染色(苏木紫-伊红染色方法)分析显示(如图2所示):再生皮肤的结构和成人头皮的皮肤结构非常相似，含有表皮层，真皮层和皮下组织层。而再生的毛发其成熟毛干连接至皮脂腺和真皮乳突。我们观察到不同生长期的毛囊出现在同一个组织切片上，这建议再生的毛囊是有功能的进行循环生长。毛囊循环生长的能力是衡量成熟毛囊的重要标准。为了更进一步监测毛发循环的功能，将毛发剪短以便观测毛发循环周期。在剪后一个月，发现再生的毛发能够重新生长出来，这进一步证明再生的毛发是有功能的。值得注意的是，在有些再生皮肤区域还有汗腺的形成。汗腺的再生以前没有人报道过。
[0036]为了进一步分析再生毛发的结构，我们利用碱性磷酸酶染色标识重组毛囊的真皮乳突(dermal papilla)。碱性磷酸酶是区分识别真皮乳突和其他真皮成纤维细胞的标志物。为了进一步标记再生毛发和皮肤，对第6周和第12周再生皮肤进行碱性磷酸酶染色标识再生的毛囊。染色显示移植后第6周早期阶段的毛发的乳突呈碱性磷酸酶阳性，而第12周成熟的毛发的毛囊及其周边呈碱性磷酸酶阳性。这结果表明再生的毛囊是正常成熟的。
[0037]为了展示再生的皮肤来自移植的培养细胞，培养过程的包皮角质细胞在移植前用绿色荧光蛋白-标记逆转录病毒感染，以便移植细胞在荧光显微镜下可追踪。在移植后12周，再生皮肤从移植体分离，在荧光显微镜下进行分析。所有的再生皮肤的表皮细胞部分其中包括表皮层，毛发和皮脂腺都呈现荧光绿，表明他们来源于绿色荧光蛋白-标记的培养的包皮角质细胞。与之相反，所有的真皮部分，包括毛囊的乳突，则对于绿色荧光蛋白都是阴性的。这个实验也建议我们可以体外对培养的细胞进行基因修饰来建立特殊皮肤疾病的模型。
[0038]为进一步证明再生的皮肤和毛囊不是由受体的老鼠细胞形成，而是来自移植的体外培养的人的皮肤细胞，我们用只识别人的细胞蛋白质抗体的免疫荧光染色法来分析再生的皮肤和毛囊，通过免疫荧光显微镜分析，再次确认再生的皮肤是来源于人体细胞。首先，我们用细胞角质蛋白(Pan-cytokeratin)抗体,该抗体可识别所有的人体表皮组织细胞。角质蛋白染色显示再生皮肤所有的表皮细胞的成分，包括表皮层，毛囊和皮脂腺，都显阳性，而鼠的表皮组织是阴性。然后，我们用抗人的波形蛋白抗体(vimentin)识别人体所有的真皮细胞。该染色显示再生的真皮组织包括真皮的乳突和皮下脂肪组织显阳性，但鼠的真皮组织是阴性。以上结果表明再生的皮肤完全是人体组织。
[0039]另外，我们发现可以用低氧培养(2%_10%)或细胞聚集培养的方法来增加真皮细胞S0X2基因的表达，并且移植S0X2基因表达高的细胞可促进和提高人的毛囊形成效率。
[0040]最后，为进一步证明再生的皮肤是功能性的皮肤，我们在移植后12周，裸鼠上形成的再生皮肤中间开一个直径和深度在2_的创口，同时也在裸鼠身上开一个同样大小的创口作为对照，来观察再生的皮肤又没有能力愈合。我们发现再生的皮肤9天左右创口完全愈合，愈合过程和人的皮肤一致，但比鼠的皮肤愈合时间要长(鼠5-7天就愈合)。免疫染色显示愈合的组织也是人体皮肤组织，说明再生皮肤有自身的愈合能力。这结果进一步表明再生皮肤是功能性的人体皮肤，可以用于各种疾病如创伤愈合的研究。
[0041]总之，以上实体结果可以看出用我们的分离培养和移植技术，我们可以成功地在裸鼠身上再生出人的完整的有功能的皮肤和毛发，该皮肤和毛发模型有很广泛的应用比如用于对人皮肤和毛 发疾病的研究，皮肤药物的筛选和开发治疗创伤和秃顶的临床产品。
【权利要求】
1.一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括:(1)获取多功能表皮和真皮细胞；(2)多功能表皮和真皮细胞体外增殖；(3)培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液转移到半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并进行孵育，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性；(4)移植到受体的方法。
2.如权利要求1所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述步骤(1)为选自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的多功能表皮和真皮细胞；另外来自任何组织的S0X2基因表达的间质细胞和来自任何组织样本有能力形成单克隆的表皮细胞以及冰冻融化后仍可以有能力形成人皮肤的细胞。
3.如权利要求2所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本； (2)将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶于低温4°C过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分； (3)将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出真皮细胞； (4)从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞用任何可供细胞自然生长的培养基培养；所述表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10 μ M Rock蛋白激酶抑制剂来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境接近人体生理环境； (5)真皮细胞培养每5天换一次培`养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1:3-6比例传代，传2-6代；表皮细胞按1:2-4的比例传代，传2-4代； (6)培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞:真皮细胞为1-10:1的数量比在DMEM/F12培养液中混合制成混合细胞悬浮液；然后将混合细胞悬浮液转移到带有3.0 μ m透气孔径的半渗透性聚合物或硅胶膜底物上，并于37°C环境中孵育1-2个小时，使细胞完全附着膜上同时也形成细胞聚合群来维持细胞的多功能性； (7)移植细胞到受体:先在受体上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口 ；然后将附着有真皮细胞和表皮混合细胞液的底物覆盖在整个伤口上，细胞面接触伤口，底物面朝上；并将底物与皮肤缝合，包扎。
4.如权利要求2所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)采集源自胎儿头皮、新生儿包皮或成人的头皮的含有多功能表皮和真皮细胞的组织样本； (2)将采集的新鲜的组织样本用组织消化酶于低温4°C过夜进行消化，第二天用机械法分开表皮和真皮部分；(3)将表皮部分剪碎后培育在胰蛋白酶中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离表皮细胞；将真皮部分剪碎后培育在胶原蛋白酶中37°C水浴箱30分钟后用40目孔径过滤网来分离出真皮细胞； (4)从组织分离后的表皮细胞和真皮细胞分开培养，表皮细胞和真皮细胞用任何可供细胞自然生长的培养基培养；所述表皮细胞的培养在培养基中另外加入2-10 μ M Rock蛋白激酶抑制剂来维持表皮细胞的多功能性；表皮细胞和真皮细胞的培养环境接近人体生理环境； (5)真皮细胞培养每5天换一次培养液，而表皮细胞每2天换一次培养液；当细胞生长达到在培养器皿80-90%覆盖率就进行传代；真皮细胞按1:3-6比例传代，可传2-6代；表皮细胞按1:2-4的比例传代，可传2-4代； (6)培养增殖后的多功能表皮细胞和真皮细胞分别消化形成单个细胞，然后以表皮细胞:真皮细胞为1-10:1的数量比在DMEM/F12培养液中混合制成混合细胞悬浮液； (7)然后将混合细胞悬浮液直接注入皮肤或毛发需要的再生部位，形成毛发。
5.如权利要求3或4所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述步骤(4)的培养基为含谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基，并加入纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、B27生长因子和PC-1补充液中的一种或几种；所述混合细胞悬浮液中加入功能性细胞黑色素细胞和/或内皮细胞；所述步骤(4)的Rock蛋白激酶抑制剂为Y-27632。
6.如权利要求3或4所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述步骤(7)进行移植时使用局部免疫抑制剂来配合细胞的移植。
7.如权利要求6所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述免疫抑制剂为转化生长因子β?抗体和β 2抗体、促肾上腺皮质激素、促黑细胞激素α抗体、环孢霉素A或者雷帕霉素。
8.如权利要求3所述的一种用体外培养的细胞再生人类完整皮肤组织的方法，其特征是，所述步骤(6)的半渗透性聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜。
9.权利要求3或4所制备的皮肤和毛发模型。
10.权利要求9所制备的皮肤和毛发模型在对人皮肤和毛发疾病的研究，皮肤药物的筛选和开发治疗创伤和秃顶的临床产品方面的应用。
【文档编号】A61L27/60GK103785064SQ201310376116
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】吴训伟, 布莱恩·马歇尔 申请人:济南磐升生物技术有限公司