用于培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的合成表面的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请号为PCT/US2009/032425,国际申请日为2009年1月29日的 PCT国际申请进入中国国家阶段后的申请，申请号为200980103921. 8，发明名称为"用于培 养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的合成表面"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 优先权
[0003] 本申请要求2008年1月30日提交的美国临时申请61/063,010的优先权，其内容 作为整体在本文中引用作为参考。
技术领域
[0004] 本发明设及细胞培养制品及其使用方法，更具体地说，设及适于支持干细胞衍生 的少突胶质细胞前体细胞的培养的制品。
【背景技术】
[0005] 多能干细胞如人类胚胎干细胞化ESC)具有分化为Ξ种胚层中的任一种的能力， 在人体中形成任何成人细胞类型。运种独特的性能提供了用于开发对于大量严重的细胞退 化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、屯、脏病等的新治疗方法的潜力。例如，脊髓损伤通常是不可逆 的（使用现有的治疗方法），致使约250000美国人处于破坏性的位置。但是，随着干细胞研 究的发展，对于患有脊髓损伤的人而言唤起了新的令人激动的可能性。研究人员使用ES细 胞衍生的神经细胞来治疗动物试样的神经系统失常。在早先的工作中，研究人员示出了老 鼠ES细胞能被刺激W分化为神经细胞（当移植入具有神经失常的老鼠中时），从而有助于 回复正常功能。
[0006] 但是，在开发运种基于hESC的治疗方法的过程中存在阻碍。运些阻碍包括在组织 培养中获得并保持适量的未分化的hESC并控制其分化W产生特定的细胞类型。干细胞培 养，如hES细胞培养通常用少量的来自细胞银行或细胞库的细胞做种，然后在未分化的状 态下扩增直至分化对于给定的治疗用途是所需的。为了达到运点，hESC或其分化的细胞目 前在含有动物衍生的成分的表面或介质（如滋养层、牛胎儿血清或MATR!GEL'、K〇存在 下培养。运些用于培养环境的动物衍生的添加物将细胞暴露于潜在有害的病毒或其它传染 性试剂下，运些有害的病毒或其它传染性试剂会转移到患者上或损害hESC的一般性培养 和维持。另外，运些生物产品具有批变异、免疫响应和存储寿命有限的缺点。
[0007] 已经采取一些步骤来在不含动物衍生的成分的介质中或表面上培养hESC。但是， hESC或其分化的衍生物的响应能W预测，因为表面或培养介质的成分改变。当然也有一 些优点。例如，已经在不含限定的血清的介质中培养hESC衍生的少突胶质细胞前体细胞 (0PC)。虽然运种培养体系不是完全排外的培养体系（当使用的基体含有动物衍生的成分 如动物胶和MTRIG化时），但是其确实提供了朝向hESC衍生的少突胶质细胞前体细胞最终 临床应用的步骤。作为进一步的例子，一些合成表面被证明能够支持人类上皮干细胞分化 为上皮细胞。但是，使用的体系依赖用于细胞培养的血清介质，其仍然会潜在地导致上述对 于所有生物动物衍生的成分的问题。迄今为止，使用化学限定的介质和合成表面的完全不 含动物的体系并未被证明可用于培养干细胞或延伸自干细胞的细胞。
【发明内容】
[0008] 本发明公开了，尤其是，可用于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的少突胶质 细胞前体细胞的合成表面。
[0009] 在一个实施方式中，提供了用于培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的方 法。该方法包括：在聚合物材料上沉积含有干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的悬浮液， 并在细胞培养介质中培养沉积的干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞。所述聚合物材料包 含选择的一种或多种丙締酸醋单体的均聚物或共聚物。
[0010] 在一个实施方式中，提供了干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的培养物。所述 培养物包括具有置于表面上的聚合物材料的制品。该培养物还包括置于聚合物材料上的干 细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞W及其中培养了干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞 的培养介质。所述聚合物材料包含选择的一种或多种丙締酸醋单体的均聚物或共聚物。
[0011] 在一个实施方式中，提供了用于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的少突胶质 细胞前体细胞的细胞培养制品。所述制品包括具有表面和置于表面上的聚合物材料的基 材。所述聚合物材料包含选择的一种或多种丙締酸醋单体的均聚物或共聚物。
[0012] 本文中提供的各种实施方式中的一种或多种提供了一种或多种相比用于培养干 细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的现有表面的优点。例如，所述合成表面减少了与具有 得自或衍生自动物源的成分的表面相关的污染组织。运些表面还可提供相比具有生物成分 的那些表面改善的存储寿命。在化学限定的介质中培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细 胞的能力还减少了潜在的污染组织。另外，在合成表面或化学限定的介质的能力下，批与批 之间的变异会更少，导致培养结果和预期的再现性改善。在结合附图阅读了本文后，运些及 其它优点将从下述具体描述中容易明白。
【附图说明】
[0013] 图1A-B是合成聚合物层涂覆的制品的侧视图。
[0014] 图2A-C是具有井的细胞抬养制品的截面不意图。未涂覆的（2A);涂覆的表面 (2B) 及涂覆的表面和侧壁（2C)。
[001引图3A-C是在丙締酸醋涂层表面123-2 (A)和95-2度），W及正控制表面Matrigel(C)上重新涂覆28-35天后的免疫性污染的hES细胞衍生0PC的巧光图像。对衍 生自人类ES细胞的0PC免疫性污染用于0PC标记，Olig1 (绿）和nestin(红）。
[0016] 图44-(：是在丙締酸醋涂层表面123-2(4)、122-3度）、^及1曰付1邑61了"(〇上重新 涂覆28-35天W及35-42天后的免疫性污染的hES细胞衍生0PC的巧光图像。对衍生自人 类ES细胞的0PC免疫性污染用于0PC标记，Olig1 (绿）和nestin(红）。
[0017] 图 5A-F是Matrigel? (A)上W及丙締酸醋涂层表面 22-2 度）、22-3 (C)、133-4 (D)、 24-10似和72-2 (F)上的hES细胞衍生0PC的巧光图像。
[001引所述附图无需按比例绘制。图中使用的相同数字表示相同的成分、步骤等。但是， 应明白，在给定的图中使用数字来指代成分并不意味着限制另一张图中标有相同数字的成 分。另外，使用不同的数字指代成分并不意味着标有不同数字的成分不能是相同的或类似 的。
【具体实施方式】
[0019] 在W下的详细描述中，对附图的参照构成其一部分，并且通过装置、体系和方法的 若干【具体实施方式】进行说明。要理解，其它实施方式也是可期待的，并且可在不偏离本发明 的范围或精神的前提下作出。因此，下述详细描述并非是限制性的。
[0020] 本文中使用的所有科学和技术术语具有本领域使用的普通含义，除非另有说明。 本文中提供定义有助于理解本文中经常出现的某些术语，并不意味着限制本发明的范围。
[0021] 如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式"一"、"一种"和"该"包括复 数形式的实施方式，除非文本中清楚地另有说明。如本说明书和所附权利要求书中所使用 的，术语"或"通常包括"和/或"，除非文本中清楚地另有说明。
[0022] 除非另有说明，组合物（如溶液）中化合物的比例基于体积比。
[0023] 如本文中使用的具有"、"包括"、"包含"等W其开放的形式使用，通常是指"包 括，但不限于"。
[0024] 本发明公开了，尤其是，具有用于培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的合 成表面的制品W及用于在该表面上培养干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞的方法。在一 些实施方式中，所述合成表面与化学限定的介质结合使用W培养干细胞衍生的少突胶质细 胞前体细胞。所述表面可用于将干细胞如hESC分化为少突胶质细胞前体细胞或用于增殖 该干细胞衍生的少突胶质细胞前体细胞。
[00巧]1.细胞培养制品
[0026] 参看图1，不出了用于抬养细胞的制品100。该制品100包括具有表面15的基底 材料基材10。合成聚合物涂层20置于基底材料基材10的表面15上。尽管未示出，要理 解，合成聚合物涂层20可置于基底材料基材10的一部分上。基底材料10可W是任何适于 培养细胞的材料，包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它们的任意组合，或者材料 之间的涂层。所述基底材料10包括玻璃材料，如钢巧玻璃、耐火玻璃、高棚娃酸耐热玻璃、 石英玻璃；娃；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物如聚（氯乙締）、聚（乙締醇）、聚（甲基丙 締酸甲醋）、聚（乙酸乙締醋-马来酸酢）、聚（二甲基硅氧烷）单甲基丙締酸醋、环締控聚 合物、氣碳聚合物、聚苯乙締、聚丙締、聚乙締亚胺；共聚物如聚（乙酸乙締醋-合-马来酸 酢）、聚（苯乙締-合-马来酸酢）、聚（乙締-合-丙締酸）或者它们的衍生物等。
[0027] 适于细胞培养的制品100的例子包括单井和多井板，如6、12、96、384和1536井 板、罐、培养皿、烧瓶、烧杯、板、滚瓶、载玻片如有室的和多室的培养载玻片、试管、盖玻片、 杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器、CellSTACKs电和发酵桶。
[0028] 合成聚合物涂层20提供了其上可培养细胞的表面25。所述合成聚合物涂层20包 括聚合的丙締酸醋单体，选自下表1中提供的一组单体。其它材料（未示出）如肤可加入 或结合入合成聚合物表面W产生仿生表面。
[0029] 表1:丙締酸醋单体列表
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 表1中列举的丙締酸醋可通过现有技术中已知的方式合成或得自供货商如 聚合科学股份有限公司（P〇lysciences，Inc.)、西格玛阿帝奇股份有限公司（Sigma A1化ich,Inc.)和斯托默股份有限公司（Sartomer,