miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏 剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，约占全部脑肿瘤的35-60%。尽管近30年 来国内外针对胶质瘤的研宄投入巨大，但收效有限，其复发、死亡率仍居高不下。目前认为 手术结合放化疗的综合治疗是治疗胶质瘤的最佳方案，放疗因此成为脑胶质瘤综合治疗的 重要环节之一。
[0003] 国内外大量的实验研宄证明在人胶质瘤实体以及体外长期培养的胶质瘤细胞系 中均存在具有肿瘤干细胞性质的细胞，它们可能对肿瘤的起源、发展、转移、复发以及对放 化疗敏感性方面起着至关重要的作用。
[0004] microRNA(miRNA)是一类新近发现的长度约为21~23个核苷酸的非编码单链小 分子RNA，通过调节靶基因的表达在发育和疾病中参与了增殖、迀移、分化和凋亡等生理性 和病理性过程。越来越多的证据显示不同类型的miRNA参与了调控肿瘤的发生、发展及放 化疗抗性。miRNA的表达和胶质瘤干细胞生物学行为之间的关系还需要进一步深入研宄。
[0005] 目前而言，胶质瘤干细胞在放射治疗中的抵抗作用已受到广泛关注，其机制涉 及：
[0006] (1)细胞周期检查点激活：有研宄发现，代表胶质瘤干细胞的CD133+胶质瘤细 胞在照射后的比例明显增加，且接受过照射的CD133+胶质瘤细胞形成移植瘤的效率与未 接受照射的细胞一致。在接受相同剂量的照射时，CD133+胶质瘤细胞的存活率显著高于 CD133-细胞，提示胶质瘤干细胞对放射线有明显的抗拒性，可能是脑胶质瘤放射治疗后复 发的根源。进一步研宄发现，与⑶133^细胞相比，⑶133+胶质瘤细胞受照后可以更有效地 激活DNA损伤检查点Chkl和Chk2,使细胞周期停滞，提高DNA损伤修复效率。
[0007] (2)细胞凋亡：研宄发现，与⑶1331田胞相比，⑶133 +胶质瘤细胞表达更高水平的 抗凋亡基因 FLIP、BCL-2、BCL-XL 以及 IAPs 家族成员 XIAP、cIAPl、cIAP2、NAIP、survivin、 MELK。
[0008] (3)细胞自噬：研宄发现，照射后，⑶133+胶质瘤细胞比⑶133 _细胞自噬少，用 mTOR阻滞剂雷帕霉素作用于CD133+细胞后，发现其产生分化，放射敏感性增强，提示减少 自噬有助于CSC维持干性和相对静止的状态，造成辐射抵抗，而增强自噬可能引导CSC的分 化，增强放射治疗的效果。
[0009] 目前，肿瘤放射治疗常用的放射线作用特点主要是以间接作用为主，该作用方式 首先是放射线与细胞中的水分子相互作用，产生活性氧基团（Reactive oxygen species， ROS)，随后由这些ROS对DNA造成损伤，此过程同时伴有这些ROS的清除和非致死性DNA损 伤的修复，其最终结果决定了细胞的存活和损伤程度。研宄发现，肿瘤干细胞（CSC)常位于 血管周围，提示CSC在接受照射后会产生更多的活性氧自由基（ROS)，而在活性氧增加的情 况下要保存自身，必须有很强的氧化清除能力。此外还有人发现乳腺癌MCF-7细胞中CSC 细胞活性氧自由基水平比未分离CSC的MCF-7低，给予IOGy照射后，MCF-7细胞系中的ROS 水平明显增高，但从MCF-7中分离的CSC却未见明显改变，提示CSC自身可能有很强的氧化 清除系统，因此在经照射后CSC比普通的肿瘤细胞更容易在ROS引起的损伤中存活。还有 研宄人员在乳腺癌中分离CSC后予以ROS清除物抑制剂，发现CSC的增殖能力减弱，放射敏 感性增加。上述研宄表明，肿瘤干细胞具有较强的ROS清除能力，受照后使ROS处于较低水 平，DNA的初始损伤明显少于非肿瘤干细胞，从而导致肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞相比更具 放射抗拒性。然而，在胶质瘤干细胞中是否存在ROS清除能力增强介导的放射抗拒性尚未 见文献报道。
【发明内容】
[0010] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种miRNA-153 (即miR-153)在制备 胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用，其首次提出miR-153通过调节Nrf-2/GPxl/ROS信号通 路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分 子机制开辟新途径；过表达miR-153可有效克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发一种新 的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供实验依据。
[0011] 本发明的技术方案是：
[0012] 本发明公开了 miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用。
[0013] 本发明公开了 miRNA-153在Nrf-2/GPxl/ROS信号通路中的用途。
[0014] 本发明公开了 miRNA-153调控GPxl的转录调控因子Nrf-2在胶质瘤干细胞中的 蛋白表达，该GPxl的转录调控因子Nrf-2的蛋白表达调控GPxl在胶质瘤干细胞中的蛋白 表达，GPxl在胶质瘤干细胞中的蛋白表达调控胶质瘤干细胞内ROS水平。
[0015] 本发明公开了 miRNA-153 作用于 Nrf-2 3' UTR。
[0016] 本发明公开了 miRNA-153的成熟序列为SEQ ID NO: 1，所述Nrf-2 3'UTR的序列 中含有miRNA-153的靶点序列SEQ ID NO: 2。
[0017] 本发明公开了包括miRNA-153的靶点序列SEQ ID NO: 2在构建过表达miRNA-153 成熟序列慢病毒表达载体中的用途。
[0018] 本发明公开了转染miRNA-153成熟序列使胶质瘤干细胞中Nrf-2和GPxl的蛋白 表达明显下降，胶质瘤干细胞的放射敏感性增强。
[0019] 本发明公开了过表达miR-153导致胶质瘤干细胞肿瘤内干性标志⑶133和nestin 的蛋白表达下降，分化标志GFAP和Tuj-I的蛋白表达增强。
[0020] 本发明公开了过表达miRNA-153使胶质瘤干细胞移植活体平均生存时间延长。
[0021] 本发明公开了所述胶质瘤干细胞的细胞株为U87s和SU-2。
[0022] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明首次提出miR-153通过调节 Nrf-2/GPxl/ROS信号通路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶质瘤干细胞 干性和辐射抗性调控分子机制开辟新途径；且过表达miR-153可有效克服胶质瘤干细胞辐 射耐受性，为开发一种新的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供实验依据。
[0023] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0024] 图1为具体实施例中常氧和乏氧条件下U87s和U87放射敏感性示意图；
[0025] 图2为具体实施例中常氧和乏氧条件下SHG44和SU-2放射敏感性示意图；
[0026] 图3为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记U87s和U87的ROS水 平曲线图，其中η = 3 ;
[0027] 图4为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记SHG44和SU-2的ROS 水平曲线图，其中η = 3 ;
[0028] 图5为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记U87s和U87的ROS水 平柱状图，其中 n = 3,且 *P〈0.01vs U87s.#P〈0.01vs U87;
[0029] 图6为具体实施例中流式细胞仪检测H2DCFH-DA荧光标记SHG44和SU-2的ROS 水平柱状图，其中 η = 3,且 *P〈0.0 lvs SHG44s. #P〈0.0 lvs SHG44 ;
[0030] 图 7 为具体实施例中 Catalase、MnSOD 和 GPxl 在 U87、U87s、SHG44 和 SU-2 中蛋 白表达水平示意图；
[0031] 图8为具体实施例中Catalase在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状示意图， 其中 η = 3, P〈0.0 lvs U87 或 SHG44 ;
[0032] 图9为具体实施例中MnSOD在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状示意图，其 中 η