= 3, P〈0.0 lvs U87 或 SHG44 ;
[0033] 图10为具体实施例中GPxl在U87、U87s、SHG44和SU-2中酶活性柱状示意图，其 中 η = 3, P〈0.0 lvs U87 或 SHG44 ;
[0034] 图11为具体实施例中检测敲低GPxl对U87s放射敏感性的影响；
[0035] 图12为具体实施例中检测敲低GPxl对SU-2放射敏感性的影响；
[0036] 图13为具体实施例中Real-time RT-PCR检测GPxlmRNA表达水平，其中*P〈0.0 lvs U87 或 SHG44 ;
[0037] 图14为具体实施例中Western blot检测Nrf-2和Keapl蛋白表达；
[0038] 图15为具体实施例中免疫共沉淀检测Nrf-2与Keapl的相互作用；
[0039] 图16为具体实施例中Real-time PCR检测候选microRNA表达水平变化，其中 *P<0.0 lvs U87；
[0040] 图17为具体实施例中miR-153在Nrf-2 3' UTR上可能的结合位点；
[0041] 图18为具体实施例中miR-153转染对荧光素酶活性的影响，*P〈0.0 lvs Scramble Control ；
[0042] 图19为具体实施例中miR-153转染胶质瘤干细胞株U87s和SU-2的Real-time PCR结果示意图；
[0043] 图20为具体实施例中Western blot法检测miR-153的靶基因 Nrf-2和GPxl的 蛋白表达结果不意图；
[0044] 图21为具体实施例中GPxl在过表达miR-153转染胶质瘤干细胞株U87s和SU-2 活性示意图；
[0045] 图22为具体实施例中GR(谷胱甘肽还原酶）在过表达miR-153胶质瘤干细胞U87s 和SU-2活性示意图；
[0046] 图23为具体实施例中GSH在control、lu-scr、lv-mir-153表达不意图；
[0047] 图24为具体实施例中GSSG在control、lu-scr、lv-mir-153表达不意图；
[0048] 图25为具体实施例中GSH/GSSG比率示意图；
[0049] 图26为具体实施例中Cel 1R0X? De印Red检测胶质瘤干细胞ROS水平示意图；
[0050] 图27为OGy和5Gy X射线照射后lv-scr和lv-miR-153胶质瘤干细胞凋亡情况 示意图；
[0051] 图28为OGy和5Gy X射线照射后lv-scr和lv-miR-153胶质瘤干细胞凋亡百分 比；
[0052] 图29为利用克隆存活实验比较过表达miR-153胶质瘤干细胞与转染随机序列胶 质瘤干细胞放射敏感性的差异结果示意图；
[0053] 图30为利用神经球形成实验检测胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球形成能力中细胞球 直径的电镜图；
[0054] 图31为利用神经球形成实验检测胶质瘤干细胞肿瘤干细胞球形成能力中形成百 分率的变化示意图；
[0055] 图32为利用细胞免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞干性标志⑶133和nestin以及 分化标志GFAP和Tuj-I的蛋白表达电镜图；
[0056] 图33为利用细胞免疫荧光染色检测胶质瘤干细胞干性标志⑶133和nestin以及 分化标志GFAP和Tuj-I的蛋白表达柱状图；
[0057] 图34为过表达miR-153的胶质瘤干细胞移植裸鼠和转染随机序列胶质瘤干细胞 的移植裸鼠的生存时间对比图。
【具体实施方式】
[0058] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0059] 一、克隆存活法检测细胞放射敏感性。
[0060] 首先利用克隆存活法进行试验来比较常氧（21%氧浓度）和乏氧（1%氧浓度）培 养下胶质瘤干细胞株U87s和SU-2与相应的胶质瘤细胞株U87和SHG-44放射敏感性的差 异，其具体做法如下所述：
[0061] 常氧或乏氧培养（1% 〇2, 5% CO2, 94% N2) 72h，收集细胞，在6孔细胞培养板中接 种IXlO3细胞/孔，每组设3个复孔，给予0,2,4,6和8Gy X射线照射，采用德国西门子 PRMUS直线加速器照射，6MV X射线，球靶距100cm，剂量率2Gy/min。照射后继续培养lld， 甲醇固定，Giemsa染色，低倍光学显微镜下计数大于50个细胞的克隆。按下式计算克隆存 活率：克隆存活率（％) = (实验组克隆数/对照组克隆数）X 100%。采用多靶单击模型 拟合细胞存活曲线：S = l-(l-eTD/D°)N，其中，S为存活分数，D为照射剂量，Dtl为平均致死剂 量，N为外推值。
[0062] 根据上述试验发现，发现常氧或乏氧培养下胶质瘤干细胞株辐射抗性均明显强于 胶质瘤细胞株，且OER值较低，即胶质瘤干细胞株放射敏感性受氧效应影响相对较小，提示 胶质瘤干细胞株可能具有较强的ROS清除能力（参见图1、图2和表1)。
[0063] 表1克隆存活实验检测胶质瘤干细胞与胶质瘤细胞放射敏感性差异（η = 3)
[0064]
【主权项】
1. miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：miRNA-153在Nrf-2/GPxl/ROS信号通路 中的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：miRNA-153调控GPxl的转录调控因子 Nrf-2在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，该GPxl的转录调控因子Nrf-2的蛋白表达调控GPxl 在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，GPxl在胶质瘤干细胞中的蛋白表达调控胶质瘤干细胞内 ROS水平。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：miRNA-153作用于Nrf-2 3'UTR。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：miRNA-153的成熟序列为SEQIDNO: 1， 所述Nrf-2 3'UTR的序列中含有miRNA-153的靶点序列SEQIDNO: 2。
6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：包括miRNA-153的靶点序列SEQIDNO: 2 在构建过表达miRNA-153成熟序列慢病毒表达载体中的用途。
7. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：转染miRNA-153成熟序列使胶质瘤干细 胞中Nrf-2和GPxl的蛋白表达明显下降，胶质瘤干细胞的放射敏感性增强。
8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：过表达miR-153导致胶质瘤干细胞肿瘤 内干性标志⑶133和nestin的蛋白表达下降，分化标志GFAP和Tuj-I的蛋白表达增强。
9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：过表达miRNA-153使胶质瘤干细胞移植 活体平均生存时间延长。
10. 根据权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其特征在于：所述胶质瘤干细胞 的细胞株为U87s和SU-2。
【专利摘要】本发明涉及一种miRNA-153在制备胶质瘤干细胞放射增敏剂中的应用，主要为miRNA-153在Nrf-2/GPx1/ROS信号通路中的用途，其中miRNA-153调控GPx1的转录调控因子Nrf-2在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，该GPx1的转录调控因子Nrf-2的蛋白表达调控GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达，GPx1在胶质瘤干细胞中的蛋白表达调控胶质瘤干细胞内ROS水平，本发明首次提出miR-153通过调节Nrf-2/GPx1/ROS信号通路调控胶质瘤干细胞的干性和辐射抗性，为深入阐释胶质瘤干细胞干性和辐射抗性调控分子机制开辟新途径；且过表达miR-153可有效克服胶质瘤干细胞辐射耐受性，为开发一种新的胶质瘤干细胞放射增敏剂提供实验依据。
【IPC分类】C12N15-867, A61K31-7088, A61K48-00, A61P35-00
【公开号】CN104840974
【申请号】CN201510200581
【发明人】杨巍, 孙婷
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月24日