修复皮肤溃疡的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗皮肤溃瘍的干细胞制 剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 慢性皮肤溃瘍又称难治性皮肤溃瘍，是一种常见的难治性疾病，具有病因复杂、病 程长和反复发作特点，可引起皮肤表皮和部分真皮甚至皮下脂肪缺损。致病因素包括糖尿 病、外伤、压迫和感染等，其中糖尿病为主要原因。目前，我国糖尿病患者约9200万，15%~ 25%患者在其疾病过程中将发生足溃瘍。
[0003] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是中胚层来源的成体干细胞，由 于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，W及可W逃避免疫识别和抑制免疫反应等其 它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。近来有研究报道，在骨髓、软骨和脂 肪组织之外的厮带血和厮带等胎儿附属组织中发现了 MSCs。
[0004] 间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，具有自我复制和定向 分化潜能特点，由于其可通过旁分泌效应和向类皮细胞分化参与创伤愈合的各个阶段，具 有治疗皮肤溃瘍的潜在价值。
[0005] 目前，尚无慢性皮肤溃瘍治疗指南，临床上多采用清创术、负压疗法、抗感染药物 及敷料处理，运些方法都达不到兼具促进创面愈合和保护创面的作用，治疗效果不尽人意。
【发明内容】
[0006] 本发明需解决的技术问题是提供一种可有效促进创伤愈合的修复皮肤溃瘍的干 细胞制剂。
[0007] 为解决上述的技术问题，本发明设计了一种修复皮肤溃瘍的干细胞制剂，其包括 浓度为4~6 X 107个/ml的间充质干细胞和体积分数为5 %-20 %的血小板血浆裂解液。
[000引作为本发明进一步改进，所述修复皮肤溃瘍的干细胞制剂还包括30~50mg/ml的 人血清蛋白、0.1~0.3mol/L的NaCl溶液和5~15皿ol/L法舒地尔。
[0009] 作为本发明进一步改进，所述修复皮肤溃瘍的干细胞制剂还包括6~lOU/mL的强 力霉素。
[0010] 本发明还提供了上述修复皮肤溃瘍的干细胞制剂的制备方法，其包括W下步骤： [001 U SI:制备间充质干细胞的步骤，包括：
[0012] Sll:获得人厮带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
[0013] S12:利用胶原酶n对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤 液；
[0014] S13:将所述滤液离屯、，弃上清，将离屯、沉淀下来的细胞用含10%WT的FBS(胎牛血 清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
[0015] S14:当细胞达融合后，用膜蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第=代后 用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；
[0016] S2:制备血小板血浆裂解液的步骤，包括：
[0017] S21:获取骨髓，离屯、，吸取上层及中间的有核细胞；
[001引S22:再离屯、，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；
[0019] S23:对所述细胞悬液离屯、，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液；
[0020] S3:配制所述修复皮肤溃瘍的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液添加到所述间充 质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。
[0021] 创伤愈合是细胞因子与效应细胞相互作用的结果，外源性细胞因子的局部使用可 有效促进创伤愈合，本发明将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合， 制成干细胞制剂，互相作用可有效促进皮肤溃瘍创伤的愈合。
【具体实施方式】
[0022] 为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实 施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式 仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
[0023] 本发明提供一种干细胞制剂，用于治疗皮肤溃瘍，促进创伤的愈合。该干细胞制剂 将外源性的细胞因子血小板血浆裂解液与间充质干细胞混合，即外源性细胞因子(血小板 血浆裂解液)和效应细胞(间充质干细胞)相互作用，可有效地促进创伤愈合。
[0024] 在本发明实施方式中，间充质干细胞的浓度为4~6 X IO7个/ml和血小板血浆裂解 液的体积分数为5%-20%。在其中，还包括有30~50mg/ml的人血清蛋白、0.1~0.3mol/L的 NaCl溶液、5~15皿ol/L的法舒地尔和6~lOU/mL的强力霉素。
[0025] 本发明还提供了上述干细胞制剂的制备方法，包括W下步骤：
[00%] SI:制备间充质干细胞：
[0027] Sll:获得人厮带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
[00%] S12:利用胶原酶n对所述组织块消化，再加入DMEM/F12进行培养，过滤，收集滤 液；
[0029] S13:将所述滤液离屯、，弃上清，将离屯、沉淀下来的细胞用含10%FBS(胎牛血清）的 DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中进行培养；
[0030] S14:当细胞达融合后，用膜蛋白酶溶液不完全消化进行传代纯化，传至第=代后 用完全消化进行传代，得到间充质干细胞悬液；
[0031] S2:制备血小板血浆裂解液：
[0032] S21:获取骨髓，离屯、，吸取上层及中间的有核细胞；
[00削 S22:再离屯、，弃上清液，加入DMEM培养液于培养箱中原代培养，得细胞悬液；
[0034] S23:对所述细胞悬液离屯、，吸取上层血清和下层红细胞，获得血小板血浆裂解液； 在之后，还对所述血小板血浆裂解液进行冻存，再解冻，反复冻存解冻至少3次W上。
[0035] S3:配制所述修复皮肤溃瘍的干细胞制剂，将血小板血浆裂解液、30~50mg/ml的 人血清蛋白、0.1~0.3mo 1 /L的化C1溶液和5~15皿01 /L法舒地尔W及6~1 OU/mL添加的步 骤添加到所述间充质干细胞悬液中，边添加，边混合均匀。
[0036] 下面结合具体的实施例对本发明进一步详细说明
[0037] 实施例一：
[0038] 制备间充质干细胞悬液
[0039] 取足月剖宫产胎儿的厮带约4~6cm长，在无菌条件下抽净厮带血，将约4~6cm长 厮带放入超净台中，去除动静脉及外膜，PBS进行初次漂洗几次，剪成Icm小段，再用PBS多次 漂洗W尽可能去除血液，最后剪成肉糜状。将肉糜状人厮带组织块移入50mL离屯、管，加入 SmL的、经37°C预热的、质量分数为0.1 %的胶原酶n (100mL PBS缓冲液溶解0.1 g胶原酶）， 放入37°C水浴摇床中振荡消化ISOmin，再加入30mL的DMEM/F12培养，反复吹打，细胞筛过 滤，收集滤液。该滤液用1000转/min离屯、lOmin，弃上清，将离屯、沉淀下来的细胞按IX IO6/ mL的密度用含10%WT的FBS(胎牛血清）的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养箱中