干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗烧伤皮肤的干细胞制 剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 有研究报道，严重创伤，大面积烧伤、整形术后的创面覆盖已经成为了一个十分重 要的问题，除了患者自体植皮外，人们采用过同种异体植皮，以及其他相关修复材料来覆盖 创面，但是无论自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。亟待寻找一 种理想的无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的天然药物。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可 以从人体大多数组织获取。大量实验研究显示，间充质干细胞具有表皮细胞分化潜能，可促 进受创皮肤的愈合。骨髓源性间充质干细胞由于存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增 长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。
[0004] 而来源于脂肪组织间质的脂肪间充质干细胞（Adipose-derivedstem cells，ADSCs)，其不仅具有MSCs的相关特性，还具有较强的旁分泌功能，加之其取材方便 易分离、对机体损伤小，易于培养扩增等优点而更受研究者的青睐。ADSCs的相关特点使其 在促进损伤组织的修复、调节炎症反应及免疫学疾病等方面具有强大的潜在应用价值和优 势。
【发明内容】
[0005] 本发明需解决的技术问题是提供一种促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间的干 细胞制剂。
[0006] 为解决上述的技术问题，本发明设计了一种干细胞制剂，其包括混合在一起的明 胶制剂和脂肪间充质干细胞悬液，所述明胶制剂和干细胞悬液的体积比为1~3 : 1~2。
[0007] 作为本发明进一步改进，所述明胶制剂和干细胞悬液的体积比为2 : 1。
[0008] 本发明还提供了一种上述干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0009] 制备明胶制剂的步骤，其包括：称取10g明胶，lg聚赖氨酸和lg梭甲基纤维素于 100-140°C高温下灭菌10-20分钟后，再加入到含10%WT的DMS0(防冻剂）和5%WT的丙 二醇（保湿剂）的l〇〇ml的无血清DMEM或DF12培养基中，制成明胶制剂；
[0010] 制备脂肪间充质干细胞悬液的步骤，其包括：取第3代人脂肪间充质干细胞以 1X106个/mL的密度接种至培养瓶中，置于37 °C、饱和湿度、体积分数为5 %的C0 2培养箱 中常规培养，24h后轻轻弃去培养液，去除未贴壁的细胞，无菌PBS轻微冲洗1次，更换完全 培养液，以后每隔1天更换培养液1次，待细胞生长至80 %融合时，弃去培养液，无菌PBS冲 洗2遍，加入无血清DMEM约15ml，于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中常规 培养，培养48h后，于生物安全柜内收集培养上清液，置于无菌10mL离心管内，于室温下离 心半径为16cm的高速离心机上，以3000rpm/min离心lOmin，轻柔的吸取收集上清液，除去 下层沉淀，以0. 22μm的滤膜过滤，收集细胞悬液，S卩脂肪间充质干细胞悬液；
[0011] 配制所述干细胞制剂的步骤，其包括：将所述明胶制剂逐滴添加到所述脂肪间充 质干细胞悬液细胞中，边添加，边进行混合，至所述明胶制剂与所述脂肪间充质干细胞悬液 的体积比为1~3 :1~2;混合均匀后，分装到预充注射器中，放到-80°c冰箱中冻存。
[0012] 作为本发明进一步改进，所述制备脂肪间充质干细胞悬液的步骤中，还包括：每次 换液时于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况的步骤。
[0013] 作为本发明进一步改进，所述配制所述干细胞制剂的步骤中，边添加，边进行混合 时，至所述明胶制剂与所述脂肪间充质干细胞悬液的体积比为2 : 1。
[0014] 本发明将明胶制剂高分子材料添加到脂肪间充质干细胞活细胞悬液中，可以提高 细胞活率，延长细胞存活时间，达到长时间促进表皮细胞生长，缩短创口愈合时间，促进经 久不愈的溃疡愈合等作用。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实 施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式 仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
[0016] 本发明提供一种干细胞制剂，用于治疗烧伤后皮肤的创伤，促进皮肤愈合。该干细 胞制剂包括混合在一起的明胶制剂和脂肪间充质干细胞悬液，所述明胶制剂和干细胞悬液 的体积比为1~3 : 1~2。更优的是，所述明胶制剂和干细胞悬液的体积比为2 : 1。
[0017] 本发明还提供了上述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0018] 制备明胶制剂：
[0019] 称取10g明胶，lg聚赖氨酸和lg梭甲基纤维素于100-140°C高温下灭菌10-20分 钟后，再加入到含10% WT的DMS0(防冻剂）和5% WT的丙二醇（保湿剂）的100ml的无 血清DMEM或DF12培养基中，制成明胶制剂；
[0020] 制备脂肪间充质干细胞悬液：
[0021 ] 取第3代人脂肪间充质干细胞以1X106个/mL的密度接种至培养瓶中，置于37°C、 饱和湿度、体积分数为5%的C02培养箱中常规培养，24h后轻轻弃去培养液，去除未贴壁的 细胞，无菌PBS轻微冲洗1次，更换完全培养液，以后每隔1天更换培养液1次，每次换液时 于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况的步骤，待细胞生长至80%融合时，弃去培养液， 无菌PBS冲洗2遍，加入无血清DMEM约15ml，于37°C、饱和湿度、体积分数为5 %的0)2培 养箱中常规培养，培养48h后，于生物安全柜内收集培养上清液，置于无菌10mL离心管内， 于室温下离心半径为16cm的高速离心机上，以3000rpm/min离心lOmin，轻柔的吸取收集上 清液，除去下层沉淀，以0. 22μm的滤膜过滤，收集细胞悬液，S卩脂肪间充质干细胞悬液；
[0022] 配制所述干细胞制剂：
[0023] 将所述明胶制剂逐滴添加到所述脂肪间充