用于防止干细胞破碎和聚集的方法和组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，更特定而言，涉及一种用于 防止干细胞破碎和聚集的方法，所述方法能够防止在运输或储存期间细胞破碎或聚集。
【背景技术】
[0002]干细胞是指能够分化成至少两种类型的细胞同时具有自我复制能力的细胞，干细 胞可分为全能干细胞、多能干细胞（pluripotent stem cells)和专能干细胞（multipotent stem cell)。全能干细胞是具有能够发育成一个完整个体的全能性质的细胞，而这些性质 为卵母细胞和精子受精之后直到八细胞期的细胞所拥有。当这些细胞分离并移植到子宫内 时，这些细胞可发育成一个完整的个体。多能干细胞是能够发育成外胚层、中胚层和内胚层 来源的各种细胞和组织的细胞，来源于位于受精4-5天后生成的胚囊内部的内细胞群。这 些细胞被称为"胚胎干细胞"，可以分化成各种其他组织细胞，但不能形成新的活生物体。专 能干细胞是能够分化成仅特异于包含这些细胞的组织和器官的干细胞，专能干细胞不仅参 与胎儿期、新生儿期和成体期的各种组织和器官的生长和发育，还参与成体组织的稳态维 持和组织损伤后诱发再生的功能。组织特异性专能细胞统称为"成体干细胞"。
[0003] 通过收获已经存在于人体各种器官中的细胞以使所述细胞发育成干细胞而获得 的成体干细胞具有仅分化成特异性组织的特征。然而，近来，用于使成体干细胞分化成包括 肝细胞等各种组织的试验取得成功，这成为了热点。特定而言，在再生疗法中，即通过主动 利用用于对具有由疾病或事故导致的、功能紊乱或失调的生物组织和器官进行再生并恢复 功能的细胞来进行的治疗，主要使用了一种方法，包括：采集干细胞、血液来源的单核细胞 或骨髓来源的单核细胞，通过体外培养诱导细胞增殖和/或分化，并通过移植将所选择的 未分化（干细胞和/或组细胞）和/或分化细胞转导到患者体内。预期现有通过经典药物 治疗方法或外科手术方法来治疗疾病的方法将被如上所述的用健康细胞、组织或器官来替 代受损细胞、组织或器官的细胞/组织替代疗法所取代，干细胞的用途将进一步增加。
[0004] 因而，目前，已研宄了干细胞的各种功能。其中，使用间充质干细胞的细胞疗法已 成为热点，并且已开发了一种改良分离自人体的间充质干细胞以便适合于治疗的技术（W0 2006/019357,韩国专利第0795708号和韩国专利第0818214号）。
[0005] 然而，对于制备适合于体内给药并具有优异安全性的干细胞的方法的研宄仍没有 充分地实施。
[0006] 因此，本发明者们证实在将干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液的情况下，可以防止 干细胞的破碎和聚集，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种用于血管内给药的干细胞组合物。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物。
[0010] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，包括将 干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。
[0011] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于血管内给药的干细胞的组合物，其中 干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。
[0012] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物，其 中干细胞悬浮于含阿司匹林的溶液。
【附图说明】
[0013] 图1是通过观察暴露于各种浓度的阿司匹林下24小时的干细胞的聚集程度而获 得的照片。
[0014] 图2是通过观察暴露于各种浓度的阿司匹林下72小时的干细胞的聚集程度而获 得的照片。
【具体实施方式】
[0015] 除非本文中另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属 领域技术人员所理解的含义相同的含义。一般来说，本说明书中使用的名称和以下描述的 实验方法是本领域公知且通用的。
[0016] 如本文所使用，术语"干细胞"是指能够分化成至少两种类型的细胞同时具有自我 复制能力的细胞，而术语"成体干细胞"是指在发育过程进行由此形成胚胎的各个器官的阶 段或者在成体阶段产生的干细胞。
[0017] 如本文所使用，术语"间充质干细胞"是指分离自人或哺乳动物的组织的未分化干 细胞，其可来源于各种组织。特定而言，间充质干细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐 带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源 的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质 干细胞和胎盘来源的间充质干细胞，并且从各组织分离干细胞的技术已为本领域所知。
[0018] 如本文所使用，术语"脂肪来源的间充质干细胞"，是一种分离自脂肪组织的未分 化成体干细胞，在本说明书中简称为"脂肪来源的成体干细胞"、"脂肪干细胞"或"脂肪来源 的干细胞"。脂肪来源的间充质干细胞可以通过本领域已知的普通方法获得。其分离方法 的例子如下。即，可以通过以下方法分离脂肪来源的间充质干细胞：培养含悬浮在生理盐水 中通过脂肪抽吸获得的脂肪的悬液，之后用胰蛋白酶处理贴附到诸如烧瓶等培养容器的干 细胞层，然后回收经处理的干细胞，使用刮刀刮取而直接回收悬浮在少量生理盐水中的干 细胞的方法，或类似方法。
[0019] 如本文所使用，术语"运输"是指干细胞本身、填充有含干细胞的溶液的容器等通 过诸如运载体等运输工具来运输，术语"储存"包括低温储存以及室温储存。
[0020] 如本文所使用，术语"防止干细胞破碎和聚集"是指以单个细胞的形式保持干细胞 不被破坏或聚集。举例而言，其是指被运输或储存的干细胞以单个细胞的形式保持而没有 细胞膜破坏或细胞之间的聚集。
[0021] 干细胞可以通过各种方法给药于体内，例如，静脉内给药方法、动脉内给药方法或 腹膜内给药方法等。其中，由于静脉内给药方法可简单且安全地治疗疾病而无外科手术，故 静脉内给药方法是有用的。然而，为使静脉内给药的干细胞实际并稳定地到达靶位点以获 得期望的治疗效果，应当满足各种因素。首先，干细胞需要以单个细胞的形式血管内给药。 可以通过用胰蛋白酶等处理来将干细胞以单个细胞的形式制备用于体内给药，但即使是在 以单个细胞的形式制备干细胞的情况下，运输或储存期间细胞膜也可能被破坏或细胞之间 可能形成聚集。在通过静脉给药等方式将聚集的干细胞而非单个形式的干细胞或者被破 坏的细胞体内给药的情况下，所给药的细胞可能附着于血管内皮细胞、血小板等，从而降低 血液流速或妨碍血液循环，甚至造成微血管、血管等的闭塞（D. Furlani等，Microvasular Research 77(2009)370-376)。因而，在干细胞血管内给药之前，不形成细胞的破碎或聚集 是至关重要的，且在干细胞血管内给药之后，干细胞应当以单个细胞的形式稳定地到达靶 位点而没有细胞的破碎或聚集。进一步地，干细胞应当具有适合于血管内给药的尺寸，使得 血管内给药的干细胞不降低血液流速或形成凝血。此外，干细胞应当以预定的浓度或更高 的浓度给药，以便到达靶位点的干细胞呈现预期的治疗效果。在如上所述的各种因素中，本 发明通过在血管内给药之前防止干细胞破碎和聚集，提供了适合于体内给药并具有优异安 全性的干细胞。
[0022] 本发明提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的方法，包括将干细胞悬浮于含阿 司匹林的溶液。
[0023] 如本文所使用，术语"含阿司匹林的溶液"是指含阿司匹林化合物的溶液，而作为 溶剂，可优选生理盐水。除此之外，可以使用任何溶剂而没有限制，例如Hartman-D溶液、磷 酸盐缓冲液（PBS)等，只要其是本领域通用的。作为阿司匹林，可以使用类阿司匹林化合 物，以及通常市售的阿司匹林产品。在本法明的实施例中，通过向生理盐水中添加乙酰水杨 酸（Sigma ;A5376)、Arthalgyl注射液或阿司匹林赖氨酸（Shinpoong)来制备含阿司匹林的 溶液。在此情况下，优选所添加的阿司匹林的含量在0.0001到〇.〇lmg/ml。在所添加的阿 司匹林的含量高于上述范围的情况下，会降低细胞的存活率，而在含量低于上述范围的情 况下，防止细胞破碎或聚集的效果可能不明显。
[0024] 由于在含阿司匹林的溶液中悬浮干细胞的情况下，运输或储存期间不发生干细胞 的破碎和聚集，故这些干细胞可直接应用于体内给药，使得这些干细胞是有用的。因而，优 选地，在血管内给药时使用的干细胞可在悬浮于含阿司匹林的生理盐水中之后使用。
[0025] 另一方面，本发明提供了一种用于血管内给药的干细胞组合物，其中干细胞悬浮 于含阿司匹林的溶液。
[0026] 另一方面，本发明提供了一种用于防止干细胞破碎和聚集的组合物，其中干细胞 悬浮于含阿司匹林的溶液。
[0027] 作为本发明中使用的干细胞，优选地可以使用成体干细胞。其中，可以使用从脂肪 组织或诸如毛囊、羊膜等的上皮组织获得的成体干细胞。最优选地，可以使用脂肪组织来源 的成体干细胞。可以使用间充质干细胞（MSC)，更特定而言，可以使用脂肪组织来源的间充 质干细胞（AdMSC)。
[0028] 优选地，脂肪组织或上皮组织来源于哺乳动物，更优选地，脂肪组织或上皮组织来 源于人。在本发明的实施例中，使用人脂肪组织来源的间充质干细胞（hAdMSC)。
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