专利名称：心营养素调节干细胞增殖的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞治疗剂领域，具体涉及调节干细胞增殖的方法。
背景技术：
干细胞是未分化的或未成熟的细胞，能产生多种特化细胞类型并最终产生终末分化的细胞。与任何其它细胞不同，它们能够自我更新，使得当需要时可以产生基本上无限供应的成熟细胞类型。由于这种自我更新能力，干细胞可治疗性的用于再生和修复组织。
干细胞具有向多种临床状况提供益处的潜力。很多潜在应用的限制是获得足量靶细胞并刺激这些干细胞终末分化成成熟组织特异性细胞。
成年骨髓和很多其它身体组织被认为含有多能干细胞群体，它们可以分化成多种表型的细胞。例如，最近已报道成年小鼠心脏内的多能干细胞样群体(SP)(Hierlihy，A.M.et al.，(2002)FEBS Letters，530239-243)。在减缓生长的条件下，这些细胞被激活并分化成心肌细胞。最近已描述(美国专利申请20030054973)通过施用来源于心脏或其它组织的成体干细胞和细胞因子来修复或再生损伤心肌的方法，这些细胞因子如干细胞因子(SCF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基质细胞来源因子-1(stromal cell-derived factor-1)、steel因子、血管内皮细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因子或白介素-3。
已知细胞因子在机体内的细胞间通讯中起关键作用，并充当能够调节生长和分化的细胞介质。已经描述了细胞因子促进干细胞分化的用途。例如美国专利申请20030027330描述了通过将干细胞和发育中或发育后异体或异种细胞、任选的和细胞因子、生长因子或趋化因子共培养，从干细胞产生分化的乳腺细胞或组织的方法；美国专利申请20030103951描述了通过施用间充质干细胞而再生心脏肌肉的方法，所述干细胞可以被遗传修饰以产生对分化重要的蛋白质，如细胞因子、生长因子、生肌因子和转录因子；美国专利申请20020142457描述了使用多种细胞因子和转录因子使具有分化成心肌细胞潜力的细胞增殖并调节它们分化成心肌细胞的方法。
心营养素-1(cardiotrophin)(CT-1)是IL-6细胞因子家族的成员，并以相对心脏限制性方式表达。已克隆编码人和小鼠CT-1的基因(Pennica，D.，et al.，(1996)Cytokine，8183-189；Pennica，D.，et al.，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921142-1146)。开始被称为心脏肥大因子(cardiac hypertrophy factor，CHF)，CT-1已经表明可诱导心脏肥大，并且已经描述CT-1及其拮抗剂用于心衰、心律不齐或影响收缩的疾病或周围神经病(见美国专利NO.5,534,615；5,571,675；5,571,893；5,624,806和5,679,545)，以及在诊断和治疗癌症中的用途(美国专利申请20020146707)。也已经报道在缺血前施用CT-1可保护成年大鼠心脏免受损伤(Liao，Z.，et al.，(2002)Cardiovasc.Res.，53902-910)。
提供这些背景信息的目的是准备本申请人认为与本发明可能相关的已知信息。不必然意味着、也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
本发明的一个目的是克服现有技术的缺点。
主权利要求的组合实现了上述目的，从属权利要求进一步公开了本发明的有利
发明内容
本发明涉及干细胞治疗剂领域，具体涉及调节干细胞增殖的方法。
根据本发明提供促进干细胞增殖的方法，包括将所述干细胞与含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸接触。
在不以任何方式限制本发明的替代实施方案中，提供抑制干细胞增殖的方法，包括将所述干细胞与一种或更多种心营养素-1抑制剂接触。
根据本发明的另一方面，提供促进干细胞增值和分化的方法，包括将所述干细胞与含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸与一种或多种干细胞调节剂接触，其中所述一种或多种干细胞调节剂是多肽或编码多肽的多核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供分离的多肽、编码所述多肽的多核苷酸以及含所述多核苷酸的载体，所述多肽是心营养素-1的类似物、衍生物、变体或活性片段，其中所述多肽能促进干细胞增殖。
根据本发明的另一方面，提供促进哺乳动物中心脏干细胞增殖的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段，或编码所述多肽的多核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供抑制哺乳动物中心脏干细胞增殖的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的心营养素-1抑制剂。
根据本发明的另一方面，提供修复或再生哺乳动物中心脏组织的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽能促进心脏干细胞增殖。
该发明简述不必一定要描述本发明的所有必要特征，但本发明也可以位于所描述特征的子组合中。
参考以下附图，下面的描述将可以使本发明的这些和其它特征更明显图1表示本发明使用的腺病毒构建体ad-CT-1的示意图。
图2A和2B表示经注射盐水或心营养素-1处理、随后用Hoechst 33342染料染色的心脏细胞悬液的FACS分析。图2C是证明在感染H9C2细胞中CT-1腺病毒表达的Western印迹。印迹中示出了约24.5kDa的CT-1蛋白。图2D表示对照注射后24小时心脏细胞FACS分析获得的对照结果。图2E表示注射腺病毒后24小时心脏细胞FACS分析的对照结果。
图3A和B表示在注射ad-CT-1后t＝24、48、72和96小时时ad-CT-1对小鼠心脏的作用的时程结果。
图4的结果表示心脏内注射后4天恢复期间在AdCT-1处理心脏中发现的SP细胞相对数目。这些数据相对于每个时间点从对照注射心脏获得的数据进行标准化。由相当Ad载体组成的对照注射不编码CT-1。
图5A、B和C表示心内施用ad-CT-1在时间点24小时、48小时、72小时和96小时对来自骨骼肌(图5a)、骨髓(图5b)和肝脏(图5c)的SP细胞的结果。
图6表示对照和CT-1注射小鼠心脏后3周、4个月和1年时间点的FACS分析结果，提示CT-1对所述小鼠心脏可能的年龄依赖作用。
图7表示的结果提示CT-1加速成年心脏干细胞的分化。表达组成型表达的GFP转基因的小鼠注射CT-1。24小时后收集心脏，将来自这些心脏的分离SP细胞与正常原代心肌细胞共培养。结果证实了标记GFP的SP细胞向连接蛋白-43阳性心肌细胞的明显(robust)转变。
图8用图解说明确认心内注射Ad-CT-1是否能影响受损骨骼肌修复所遵照的试验程序。
图9的结果表示对照注射、心脏毒素(ctx)注射或同时注射心脏毒素和Ad-CT-1之后约6天的损伤程度。在这些试验中，向1月龄小鼠后肢的右胫骨前肌(TA)注射10微摩尔心脏毒素。对侧腿用作对照。另一组小鼠中，心内注射心脏毒素之后施用CT-1。6天后，解剖TA肌并冷冻用于切片。用苏木精/伊红染色肌肉切片，以显示膜和结构成分。
图10表示用α-辅肌动蛋白抗体染色肌肉切片的结果。所述抗体染骨骼肌的肌节z-带，并且是肌肉肌节完整性的公认指标。
具体实施例方式
以下描述只是以举例方式对优选实施方案的说明，而不是对实施本发明的必要特征组合的限制。
本发明提供通过调节心营养素(CT-1)活性而调节干细胞增殖的方法。因而本发明提供促进干细胞增值、分化或同时促进其增值和分化的方法，包括将所述细胞与CT-1或其类似物、衍生物、变体或活性片段或激活内源性CT-1的化合物接触。本发明也提供抑制干细胞增值、分化或同时抑制其增值和分化的方法，包括将所述细胞与CT-1抑制剂接触。所述促进干细胞增殖的方法还可以包括将所述干细胞与一种或多种干细胞调节剂接触以促进所述干细胞的增殖和/或分化。根据本发明的这个实施方案，所述细胞可以同时接触CT-1(或其类似物、衍生物、变体或活性片段或CT-1激活剂)和一种或多种干细胞调节剂，或所述细胞可以依次与它们接触。
可使用所述方法体外促进干细胞增殖、干细胞分化或同时促进增殖和分化。另外，可使用所述方法体内促进干细胞增殖、干细胞分化或同时促进增殖和分化。本发明也涉及可在体外和体内实施的方法。本发明的治疗性应用不意味着被限制到需要促进干细胞增殖和/或分化的疾病和病症，如替换受损或缺陷组织。此处提供的方法可用作治疗方法或预防方法。本发明方法也可用于抑制干细胞增殖，因而可用于治疗特征是不适当细胞增殖的疾病，例如但不限于心脏肥大。
定义除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员的常规理解有相同含义。
如此处所用，术语“干细胞调节剂”表示能刺激或抑制干细胞增殖、分化、或增殖和分化的化合物。
如此处所用，术语“干细胞”表示能分化成一种或多种分化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能或多能细胞。全能干细胞典型的具有发育成任何细胞类型的能力。全能干细胞通常起源于胚胎细胞。多能细胞典型的是能分化成几种不同的、最终分化细胞类型的干细胞系。多能干细胞可以起源于多种组织或器官系统，包括但不限于血液、神经、心脏和骨骼肌、皮肤、肠、骨、肾脏、肝脏、胰腺、胸腺等。
如此处所用，术语“祖细胞”表示定型为特定细胞谱系的细胞，它经一系列细胞分裂产生具体限定范围的分化细胞类型。祖细胞的实例是成肌细胞，它能分化成仅一种类型细胞，但其自身不完全成熟或完全分化。
此处互换使用于细胞时，术语“增殖”和“扩增”表示通过细胞分裂相同类型细胞数目的增加。
如此处所用，术语“分化”表示细胞被特化成特定功能的发育过程，例如，细胞获得不同于起始细胞类型的一种或多种形态特征和/或功能。术语“分化”包括谱系定型和终末分化过程。例如可以通过使用本领域技术人员已知的免疫组化或其它程序来监测是否存在谱系标志物，从而评价分化。来源于祖细胞的分化子代细胞可以但不必一定属于与所述干细胞来源组织相同的胚层或组织。例如，神经祖细胞和肌肉祖细胞可以分化成造血细胞谱系。
如此处互换使用，术语“谱系定型”和“特化”表示干细胞经历的过程，在此过程中所述干细胞产生祖细胞，所述祖细胞定向形成特定受限范围的分化细胞类型。定型祖细胞经常能自我更新或细胞分裂。
如此处所用，术语“终末分化”表示细胞最终分化成成熟的、完全分化的细胞。例如，神经祖细胞和肌肉祖细胞可以分化成造血细胞谱系，其终末分化导致特定细胞类型的成熟血细胞。通常终末分化与退出细胞周期和停止增殖相关。
如此处所用，术语“天然存在的”用于多肽或多核苷酸时，表示所述多肽或多核苷酸可以在自然界发现的这种事实。例如，可从天然来源分离的生物中存在、并且尚未在实验室中人为修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
用心营养素-1(CT-1)调节干细胞增殖的方法本发明提供用CT-1促进干细胞增殖、分化或同时促进增殖和分化的方法。CT-1可单独使用，或与一种或多种干细胞调节剂组合使用，以促进所述干细胞的增殖和/或分化。CT-1和任选的一种或多种干细胞调节剂可直接提供给所述干细胞，或可以间接提供它们，例如，但不限于，通过与能表达CT-1和/或一种或多种调节剂的细胞共培养。本发明方法也涉及可在干细胞或与干细胞共培养的细胞中激活内源性CT-1的化合物的用途。
本发明还提供用一种或多种CT-1抑制剂抑制干细胞增殖的方法。所述CT-1抑制剂可直接提供给所述干细胞，或可以间接提供它们，例如，但不限于，通过与能表达并优选分泌所述一种或多种抑制剂的其它细胞共培养。
胚胎和成体干细胞或其组合可用于本发明的方法中。所述干细胞可以是具有发育成任何细胞类型能力的全能干细胞，或可以是来源于特定组织或器官的多能干细胞，例如来源于血液、神经、骨骼肌、心肌、骨髓、皮肤、肠、骨、肾脏、肝脏、胰腺、胸腺等。
在一个实施方案中，本发明方法应用于成体干细胞。在另一个实施方案中，本发明方法使用心肌干细胞、骨骼肌干细胞或二者。
1.CT-1根据本发明，CT-1表示哺乳动物CT-1(也称心脏肥大因子或CHF)。本领域已知多种心营养素蛋白，例如但不限于小鼠CT-1(Pennica，D.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921142-1146)和人CT-1(Pennica，D.，et al.，(1996).Cytokine，8183-189)。
CT-1可以提供为多肽或编码并能表达所述多肽的多核苷酸。多种CT-1蛋白的序列在本领域已知并可以用作制备CT-1多肽的基础，例如，所述CT-1多肽是以上参考文献和GenBank Accession No.AAC52173和NP 031821(小鼠)；AAD12173和AAA85229(人)提供的那些。
本发明也涉及天然存在(野生型)形式CT-1的多肽类似物、衍生物和变体，以及CT-1的活性肽片段和所述肽片段的类似物、变体和肽模拟形式。
活性片段是所述天然存在(或野生型)蛋白的片段，它基本保留与所述野生型蛋白相同的活性。片段典型是至少约20个氨基酸长。在本发明的一个实施方案中，所述片段是至少约50个氨基酸长。在另一个实施方案中，所述片段是至少约70个氨基酸长。在另一个实施方案中，所述片段是至少约100个氨基酸长。在另一个实施方案中，所述片段是至少约150个氨基酸长。术语“片段”也包括对应所述野生型蛋白的多肽，其中从所述野生型序列的N端、C端或从N端和C端缺失1到约50个氨基酸。候选片段可以选自从所述天然存在蛋白产生的随机片段或者可以专门设计。测试所述片段的活性并与所述野生型蛋白比较，选择具有与所述天然存在蛋白基本相同活性的片段。产生多肽片段的方法在本领域公知，包括酶促、化学或机械切割所述野生型蛋白或其重组形式，表达编码这些片段的核酸等。
如本领域所知，多肽的类似物和衍生物、以及肽模拟化合物具有超过所述天然存在形式的显著优点，例如包括更高化学稳定性、对蛋白裂解性降解的更高抗性、更强的药理学特性(如半寿期、吸收、效力和疗效)、改变的特异性(例如广谱生物活性)和/或降低的抗原性。
“衍生物”是含有正常情况下不是天然存在序列的一部分的其它化学或生化结构的多肽或肽。衍生物包括氨基端和/或羧基端和/或一个或多个氨基酸侧链已经用合适的化学取代基团衍生化的多肽和肽，以及环状、双和多聚多肽和肽，与其它蛋白质或载体融合的多肽和肽，糖基化或磷酸化多肽和肽，与亲脂性结构(如己酰基、月桂基、硬脂酰基)偶联的多肽和肽，和与抗体或其它生物配体偶联的多肽和肽。
可用于衍生化多肽和肽的化学取代基团的实例包括但不限于烷基、环烷基和芳基基团；酰基基团，包括烷酰基和芳酰基；酯；酰胺；卤素；羟基；氨甲酰基等。所述取代基团也可以是封闭基团，如Fmoc(芴甲基-O-CO-)、苄酯基(苯甲基-O-CO-)、单甲氧琥珀酰基、萘基-NH-CO-、乙酰氨基-己酰基和金刚烷基-NH-CO-。其它衍生物包括C端羟甲基衍生物、0-修饰衍生物(如C端羟甲基苯甲基醚)和N端修饰衍生物，包括取代酰胺如烷酰胺和酰肼。
术语“环状”多肽或肽表示多肽或肽的环状衍生物，例如两个或更多附加的适于环化的氨基酸残基已经被添加到多肽或肽上。这些附加氨基酸可以加在羧基端和氨基端，或可以加在内部位置。作为替代方案，环状多肽/肽可利用氨基酸序列中天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键，从而环化所述多肽/肽。环状多肽/肽可含有分子内二硫键，即-S-S-；所述两个添加残基之间的分子内酰胺键，即-CONH-或-NHCO-；或分子内S-烷基键，即-S-(CH2)-CONH-或-NH-CO(CH2)nS-，其中n是1、2或更多。
含有分子内二硫键的环状多肽/肽可以通过常规固相合成制备，常规固相合成的同时在选用于环化的位置掺入合适的S受保护的半胱氨酸或高半胱氨酸残基(例如见Sahm et al.，1996，J.Pharm.Pharmacol.48197)。完成链装配后，可这样进行环化选择性去除所述S-保护基团，导致游离的对应SH官能团的载体上氧化，从而形成S--S键，然后从载体上常规去除所述产物并适当纯化；或者从载体上去除所述多肽/肽，同时侧链完全去保护，然后在高度稀释的水溶液中氧化所述游离SH官能团。与之相似，含分子内酰胺键的环状衍生物可以通过常规固相合成制备，常规固相合成的同时在选用于环化的位置掺入合适的氨基和羧基侧链保护的氨基酸衍生物；含分子内-S-烷基键的环状多肽/肽可通过常规固相合成制备，常规固相合成的同时在选用于环化的位置掺入具有合适的氨基保护侧链的氨基酸残基和合适的S受保护的半胱氨酸或高半胱氨酸。
双重多肽/肽由互相共价连接的两个相同或两个不同多肽/肽组成，二者直接连接，或者通过间隔物连接，所述间隔物如丙氨酸残基短链或假想的蛋白质水解位点(例如见美国专利5,126,249和欧洲专利495,049)。多聚体是由多个相同或不同多肽/肽或其衍生物形成的多聚分子。用合适的多聚化试剂如0.1％戊二醛进行所述多聚化(例如见Audibert et al.，1981，Nature 289593)。
“类似物”是含一个或多个非天然存在氨基酸的多肽/肽。例如，本发明多肽/肽类似物可以有用对应D-氨基酸残基或另一个非天然存在氨基酸替换的一个或多个氨基酸残基。非天然存在氨基酸的实例包括但不限于N-α-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-甲基氨基酸、(β-丙氨酸(β-Ala))、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(orn)、羟脯氨酸(Hyp)、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸(cysteic acid)、环己基丙氨酸、α-氨基异丁酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)、苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸(2-Nal)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)、甲硫氨酸亚砜(MSO)和高精氨酸(Har)。
如本领域已知，全部用D-氨基酸替换肽内的全部L-氨基酸可得到“反转(inverso)”肽或“逆反转(retro-inverso)”肽(见Goodman et al.″Perspectives in PeptideChemistry″pp.283-294(1981)；美国专利No.4,522,752)，在本发明中两者都被认为是类似物。“反转”肽是序列中所有L-氨基酸替换成D-氨基酸的肽，“逆反转”肽是氨基酸序列被颠倒(“逆”)并且所有L-氨基酸已被替换成D-氨基酸的肽。例如，如果母肽是Thr-Ala-Tyr，逆形式是Tyr-Ala-Thr，反转形式是thr-ala-tyr，而逆反转形式是tyr-ala-thr(小写字母表示D-氨基酸)。与母肽比较，逆反转肽具有逆向骨架而基本保留侧链的原始空间构像，得到拓扑结构与母肽紧密相似的异构体。
肽模拟物是结构与多肽/肽相似、含有模拟本发明多肽或肽功能的化学结构的化合物。例如，如果多肽含有两个有功能活性的带电化学结构，模拟物将两个带电化学结构放置在空间定向和限制结构中，使得所述带电化学功能维持在三维空间中。因此术语肽模拟物的意思包括等排体(isostere)。如此处所用，术语“等排体”表示能替换多肽或肽的化学结构，因为所述化学结构的立体构象与所述肽或多肽相似。例如，所述结构匹配对所述多肽或肽特异的结合位点。肽模拟物的实例包括含一个或多个骨架修饰的肽(即酰胺键模拟物)，这在本领域公知。酰胺键模拟物的实例包括但不限于-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-(例如见，Spatola，Vega Data Vol.1，Issue 3，(1983)；Spatola，in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins，Weinstein，ed.，Marcel Dekker，NewYork，p.267(1983)；Morley，J.S.，Trends Pharm.Sci.pp.463-468(1980)，Hudson et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.14177-185(1979)；Spatola et al.，Life Sci.381243-1249(1986)；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I307-314(1982)；Almquist et al.，J.Med.Chem.231392-1398(1980)；Jennings-White et al.，Tetrahedron Lett.232533(1982)；Szelke etal.，EP 45665(1982)；Holladay et al.，Tetrahedron Lett.244401-4404(1983)；和Hruby，Life Sci.31189-199(1982))。肽模拟物的其它实例包括由一个或多个苯并二氮(benzodiazepine)分子取代的肽(例如见，James，G.L.et al.(1993)Science2601937-1942)和含交联形成内酰胺或其它环状结构的骨架的肽。
本领域技术人员将知道并非肽或多肽中的所有氨基酸需要被修饰。与之相似，并非所有氨基酸需要以相同方式修饰。本发明的多肽/肽衍生物、类似物和肽模拟物因此包括嵌合型分子，其中含有两个或更多化学上不同的区域，每个区域包含至少一个氨基酸或其修饰形式。
多肽或肽变体是，对于出现在所述天然存在蛋白氨基酸序列中的氨基酸，其中一个或多个氨基酸残基已经被缺失、添加或替换的多肽或肽。在本发明中，变体也基本保留与所述天然存在蛋白相同的活性。典型的，当变体包含一个或多个氨基酸替换时，它们是“保守性”替换。保守性替换涉及一个氨基酸残基被替换成具有相似侧链特性的另一个残基。如本领域所知，20个天然存在氨基酸可根据侧链的理化特性分类。合适的类别包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性、不带电侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)与赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。氨基酸的另一类别是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香侧链)。保守性替换涉及一个氨基酸替换为同类的另一个氨基酸。
根据本发明，与天然存在的CT-1蛋白比较，类似物、衍生物、变体或活性片段具有基本相同或更高活性。术语“基本相同的活性”表示天然存在CT-1蛋白活性的约50％活性。在一个实施方案中，基本相同的活性表示天然存在CT-1蛋白活性的约60％活性。在另一个实施方案中，它表示天然存在CT-1蛋白活性的约75％活性。在另一个实施方案中，与天然存在的CT-1蛋白优选人CT-1蛋白比较，类似物、衍生物、变体或活性片段表现增强的(更高)活性。例如可以通过测定CT-1促进干细胞增殖的能力来测定其活性。在本发明的一个实施方案中，CT-1活性表示其促进心脏干细胞增殖的能力。测定干细胞增殖增加的方法在本领域已知，包括此处提供的那些。
本发明的多肽可通过本领域已知方法制备，如从细胞提取物中纯化或使用重组技术。较短序列也可以用本领域已知方法化学合成，所述方法包括但不限于完全固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶液合成(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.852149；Merrifield(1986)Science 232341)。本发明的多肽可用标准技术纯化，如层析(如离子交换、亲合或大小分离柱层析或高效液相层析)、离心、差异溶解度，或用本领域技术人员熟悉的其它技术纯化。
所述多肽也可用重组技术制备。典型的，这涉及用含编码所述蛋白或多肽的多核苷酸的表达载体转化(包括转染、转导或感染)合适的宿主细胞。多种CT-1基因的核酸序列在本领域已知(例如见，Pennica et al.Ibid.，美国专利No.5,723,585；5,679,545；5,627,073(小鼠)和GenBank Accession No.Q16619和NM001330(人))，可以用作本发明多核苷酸的基础。
所述多核苷酸可以通过标准技术来源于合适来源或从中纯化。所述多核苷酸可以是基因组DNA或RNA，或它们可以是从分离mRNA制备的cDNA。另外，已知序列可用于制备探针，以使用标准技术从多种来源中获得编码CT-1多肽的其它核酸序列。获得所述核酸的合适来源是已知表达本发明蛋白的细胞，如心肌细胞，以及骨骼肌组织和有可测定CT-1转录本的其它组织。
通过用标准技术如定点突变技术删除、添加和/或替换编码序列内的一个或多个核苷酸，可以构建编码所述天然存在CT-1蛋白片段或变体的多核苷酸。
本发明的多肽和肽也可以制备成融合蛋白。这些融合蛋白的一种用途是改进所述多肽或肽的纯化或检测。例如，多肽或肽可以融合到免疫球蛋白Fc结构域，所得融合蛋白可容易的用蛋白A柱纯化。融合蛋白的其它实例包括与组氨酸标签(允许用Nie+树脂柱纯化)、谷胱甘肽-S-转移酶(允许用谷胱甘肽柱纯化)或生物素(允许用链亲合素柱或链亲合素标记的磁珠纯化)融合的多肽或肽。所述融合蛋白纯化后，可以用本领域已知的化学或酶促方法经位点特异性切割去除标签。
有效翻译克隆的多核苷酸可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和临近序列。在包括其自身起始密码子和临近序列的完整野生型基因或cDNA被插入适当表达载体的情况下，可能不需要另外的翻译调控信号。在其它情况下，必须提供外源翻译调控信号，可能必须提供ATG起始密码子。另外，起始密码子必须与预期编码序列的读码框适应，以确保翻译完整的插入物。所述外源翻译调控信号和起始密码子可以是天然或合成的。通过包括适当的转录增强元件和/或转录终止子可以增强表达效率(Bittner et al.，(1987)Methods in Enzymol.153，516)。
用于本发明核酸序列的合适表达载体包括但不限于质粒、噬粒、病毒颗粒和载体、噬菌体等。对昆虫细胞来说，杆状病毒表达载体是合适的。对于植物细胞来说，病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒)和质粒表达载体(如Ti质粒)是合适的。完整表达载体或其部分可以整合到宿主细胞基因组中。在有些情况下，希望使用本领域已知的诱导型表达载体。
分子生物学领域的技术人员将明白，广泛的表达系统可用于提供所述重组多肽或肽。所用的具体宿主细胞对本发明不重要。所述多肽或肽可以在原核宿主(如大肠杆菌或枯草杆菌)或真核宿主(如酿酒酵母或毕赤酵母)中制备。转化或转染方法以及表达载体选择取决于所选宿主系统，可以由本领域技术人员容易的确定。例如，转化和转染方法已经描述于Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York中；多种表达载体例如可以从Cloning VectorsALaboratory Manual(Pouwels et al.，1985，Supp.1987)和很多商业供应商提供的那些中选择。
此外，可以选择以特异性、希望的方式调节插入序列表达或修饰并加工所述基因产物的宿主细胞。蛋白质产物的这些修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对所述蛋白质的活性很重要。对于蛋白质和基因产物的所述翻译后加工和修饰，不同宿主细胞具有特征性和特异性机制。本领域技术人员可以选择适当细胞系或宿主系统以确保所表达异源蛋白的正确修饰和加工。
携带所述表达载体的宿主细胞可以培养于常规营养基中，并根据需要调整培养基，以便根据已知程序激活选定基因、阻遏选定基因、选择15个转化体或扩增选定基因。
II.激活CT-1的化合物本发明也涉及用激活CT-1并导致内源性CT-1增加或内源性CT-1活性增加的化合物而促进干细胞增殖的方法。CT-1激活剂可以是多肽或编码多肽的基因，所述多肽在体内作用于CT-1上游从而上调CT-1表达或活性，或者它们可以是小分子激活剂。CT-1激活剂可以作用于基因水平，例如上调编码CT-1的基因的表达，或者它们可以作用于蛋白质水平而增加CT-1多肽的活性或降低CT-1抑制剂的活性。CT-1激活剂例如可以是多肽和肽(或上述对应多肽的类似物、衍生物、变体或肽模拟化合物)、多核苷酸、寡核苷酸、抗体或抗体片段，或有机或无机小分子。
可以使用本领域已知的多种筛选方法来鉴定候选激活剂。例如，可以通过监测用所述候选激活剂处理的细胞中靶基因表达的增加或降低，鉴定上调或下调靶基因的激活剂。可用于此目的的方法如Northern印迹分析、定量RT-PCR或微阵列分析。另外，例如可以通过Western印迹分析来监测相应蛋白质水平的增加或降低，。
对于结合特定蛋白质的多肽或肽激活剂(或与所述多肽对应的类似物、衍生物、变体或肽模拟化合物)，可用本领域已知的多种结合测试之一来确定结合能力(例如见Coligan et al.，(eds.)Current Protocols in Protein Science，J.Wiley&Sons，New York，NY)。
对于抗体或抗体片段激活剂，可使用多种免疫测试。本领域公知很多竞争性结合或放射性测定免疫测试的方案，其中使用具有明确特异性的多克隆或单克隆抗体。这些免疫测试典型的涉及测定靶蛋白和其特异性抗体之间的复合体形成。这些技术的实例包括ELISA、放射免疫测试(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。作为替代方案，用对两个非干扰表位有活性的单克隆抗体的两位点、单克隆基免疫测试或竞争性免疫测试可以使用(见Maddox，D.E.et al.(1983)J.Exp.Med.1581211-1216)。这些测试在本领域公知(例如见Hampton，R.et al.(1990)Serological Methods.A LaboratoryManual，APS Press，St Paul，Minn.，Section IV；Coligan，J.E.et al.(1997，and periodicsupplements)Current Protocols in Immunology，Wiley&Sons，New York，N.Y.；Maddox，D.E.et al.(1983)J.Exp.Med.1581211-1216)。
III.CT-1抑制剂本发明也涉及用抑制CT-1并导致内源性CT-1降低或内源性CT-1活性降低的化合物而抑制干细胞增殖的方法。CT-1抑制剂可以是多肽或编码多肽的基因，所述多肽在体内作用于CT-1上游从而下调CT-1表达或活性，或者它们可以是小分子抑制剂。CT-1抑制剂可以作用于基因水平，例如下调编码CT-1的基因的表达，或者它们可以作用于蛋白质水平而降低CT-1多肽的活性。CT-1抑制剂例如可以是多肽和肽，包括干扰野生型蛋白活性的CT-1无活性片段(或上述对应多肽的类似物、衍生物、变体或肽模拟化合物)、多核苷酸、寡核苷酸、抗体或抗体片段，或有机或无机小分子。
本领域已知的上述鉴定CT-1激活剂的各种方法也可以用来鉴定候选抑制剂。
IV干细胞调节剂除了CT-1(或CT-1激活剂)以外，本发明方法也涉及一种或多种干细胞调节剂的用途。干细胞调节剂可以促进干细胞增殖和/或分化。因此，调节剂可用于提高CT-1活性并增加干细胞群体的增殖，或它可以用于促进预先用CT-1处理而扩增的干细胞群体的分化。促进干细胞分化的调节剂可以刺激所述细胞的谱系定型，或它们可以刺激定型祖细胞的终末分化。
可以用于本发明方法的调节剂实例包括但不限于Wnt多肽家族成员(包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt7b，和小鼠Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt3b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt12)和Pax7。也可以单独一种或多种转录因子，或与Wnt、Pax7或两者一起组合使用，以促进终末分化，所述转录因子例如但不限于Pax7、NKX2.5、GATA4、5或6、MEF2C、Hand1和Hand2(对于心肌干细胞)和MyoD、成肌蛋白、MRF4和Myf5(对于骨骼肌干细胞)。
所述调节剂可以作为全长多肽或作为其活性片段或变体(如上述)提供，或它们可以作为编码并能表达所述全长多肽、活性片段或变体的多核苷酸提供。多种Wnt蛋白、Pax7和很多转录因子的氨基酸和核酸序列在本领域已知(例如GenBankAccession No.NM 002584和NP 002575(Pax7))。
在本发明一个实施方案中，所述调节剂促进干细胞分化。在另一个实施方案中，所述干细胞调节剂是Wnt多肽或编码Wnt多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述干细胞调节剂是Wnt11多肽或编码Wnt11多肽的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述干细胞调节剂是Pax7多肽或编码Pax7多肽的多核苷酸。
测试干细胞增殖CT-1、其类似物、衍生物、变体和活性片段、或CT-1激活剂单独使用或与干细胞调节剂组合时促进干细胞增殖的能力可以用标准技术进行体外和体内测试，所述标准技术包括但不限于此处描述的那些。也可以进行体外或体内测定一种或多种CT-1抑制剂对干细胞增殖的抑制。
I.体外测试典型的，在存在和缺乏所述测试化合物条件下培养干细胞，随后监测细胞中至少一种增殖指标，以确定暴露于所述测试化合物的那些细胞中增殖是否已经被刺激或抑制。作为替代方案，干细胞群体可以与“教育(educator)”细胞共培养，所述教育细胞暴露于所述测试化合物并随后监测所述干细胞中的至少一种增殖指标。可以在共培养之前或期间将教育细胞暴露于所述测试化合物。可以使用来源于多种组织的成体干细胞或祖细胞。实例包括但不限于来源于心肌或骨骼肌、胰腺组织、神经组织、肝组织或骨髓、造血细胞、成肌细胞、肝细胞、胸腺细胞、心肌细胞等的干细胞。也可以使用胚胎干细胞。
维持干细胞培养的方法在本领域已知(例如见，Madlambayan，G.J.，et al.，(2001)J.Hematother.Stem Cell Res.10，481-492；Hierlihy，A.M.，et al.，(2002)FEBS Lett.530，239-243；Asakura，A.，et al.，(2002)J Cell Biol.159，123-134)。所述干细胞可以作为单培养物而单独培养，或者可以与教育细胞共培养。另外的步骤可以包括在所述筛选方法中所述培养期间之前、之中或之后，如鉴定或分离细胞群体或有助于成功测试的步骤。例如，可使用生长因子或其它化合物来分离和扩增所述干细胞群体。EGF和FGF已被用于神经干细胞的此目的，如Gritti等人所述(J.Neurosci.(1999)193287-3297)，Bcl-2已被用于分离“肌肉干细胞”群体(见美国专利No.6,337,184)。
一般来说，在典型约1000倍范围的一定浓度范围测试化合物，合适的暴露方案可以容易的由本领域技术人员确定。使用共培养物时，干细胞暴露于化合物可以发生在所述干细胞初次暴露于所述教育细胞之前、之中或之后。作为替代方案，当所述测试化合物是多核苷酸或由多核苷酸编码的化合物如多肽或肽时，可以用此处和其它地方描述的标准方法用所述核酸或含所述多核苷酸的表达载体转染所述干细胞，使得所述测试化合物被内源性产生。作为替代方案，可通过共培养所述干细胞和转染了所述多核苷酸或含所述多核苷酸的表达载体、表达所述测试化合物的另一种细胞系，使所述干细胞暴露于测试化合物。
如上所指，还涉及所述干细胞可以不直接暴露于所述化合物。例如可以首先用所述化合物处理教育细胞或第三种细胞类型，然后与所述干细胞共培养。作为替代方案，可以通过加入已经用这种细胞群体调节的培养基使所述干细胞间接暴露，所述细胞群体并不包括在所述共培养物中。此外，还涉及所述干细胞可以暴露于已经掺入到非液体培养基的化合物，所述非液体培养基例如固体、凝胶或半固体生长支持物，如琼脂、聚合物骨架、基质或其它构造。
可以定性或定量监测的干细胞增殖指标例如包括整体形态变化、总细胞数、组织学、组织化学或免疫组织化学、或特异性细胞标志物的存在、缺失或相对水平(如作为增殖标志物的细胞周期蛋白D1、磷酸化组蛋白H1和H3、E2F和PCNA)。
例如可以通过用适当染料(如所述Hoescht染料之一)、BrdU掺入的FACS分析或通过氚化胸腺嘧啶掺入，监测形态变化和/或总细胞数。例如可以通过组织化学技术、免疫学技术、电泳、Western印迹分析、FACS分析、流式细胞术等，分析细胞标志物的存在、缺失或相对水平。作为替代方案，例如可以用PCR技术、Northern印迹分析、使用合适的寡核苷酸探针等，检测编码所述细胞标志物蛋白的基因所表达mRNA的存在。
对于同时用CT-1(或CT-1激活剂)和干细胞调节剂处理的细胞，也可以在用所述调节剂处理后监测所述干细胞群体中的一种或多种分化指标。典型的，如上述通过整体形态变化监测分化，或通过谱系特异性细胞标志物的存在，它们可以用如上述多种标准技术分析。
可以监测的合适谱系特异性细胞标志物在本领域中已知。例如，可通过监测心肌细胞特异性标志物如连接蛋白-43、MEF2C和肌球蛋白重链的出现来确定心肌干细胞的分化诱导；可通过检测细胞表达一种或多种心肌细胞标志蛋白如肌球蛋白重链、低磷酸化MyoD、成肌蛋白、Myf5和肌钙蛋白T(troponin T)来测定肌肉来源干细胞的分化诱导；可通过监测GFAP、MAP2和β-III微管蛋白表达确定作为神经球或作为SP细胞组分来源的神经干细胞的分化诱导(例如见，Hitoshi，S.，et al.，(2002)Genes&Dev.16，846-858)。
II.体内测试作为替代方案，可以在适当实验动物中驻留的干细胞群体上体内测试CT-1、其类似物、衍生物、变体和活性片段、或CT-1激活剂促进干细胞增殖和/或分化的能力，例如但不限于当与一种或多种干细胞调节剂组合使用时。与之相似，可以体内测试CT-1抑制剂抑制干细胞增殖的能力。典型的，例如通过注射直接将所述测试化合物施用被研究组织。合适时间后，从所述动物收获细胞并如上述分析所述干细胞群体。如果必要，可通过使驻留的干细胞群体与刺激增殖的化合物以及所述CT-1抑制剂接触来测试抑制剂，从而确定所述抑制剂防止或降低增殖的能力。可同时提供所述化合物和所述抑制剂给所述干细胞，或者可以在所述抑制剂之前或之后提供所述化合物。
在本发明一个实施方案中，所述化合物促进干细胞增殖的能力可以在小鼠心脏组织中体内测试。监测从处理小鼠中分离的心脏干细胞样群体(SP)的增加，并与未处理或用安慰剂如缓冲液或盐水溶液处理的对照小鼠中的进行比较。根据本发明的这个实施方案，当所述SP增加至少约2倍时认为化合物促进干细胞增殖。在至少24小时期间、更典型在至少96小时期间测定SP增加。
可以在合适动物模型中测试CT-1、其类似物、衍生物、变体和活性片段、或CT-1激活剂修复损伤组织的能力。例如，可以通过将所述化合物施用于具有冠状动脉结扎诱导心脏损伤的小鼠并监测损伤心肌修复，从而测试所述化合物修复损伤心肌组织的能力(见Guo et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9611507)。与之相似，可以在经冷冻破碎(freeze crush)或施用心脏毒素诱导产生肌肉损伤的动物中确定所述化合物修复骨骼肌损伤的能力(见Megeney et al.，(1996)Genes Dev.，101173-1183；Asakura etal.，(2000)J.Cell Biol.，159123-134)。
应用本发明提供通过将所述细胞直接或间接与CT-1、其类似物、衍生物、变体和活性片段、或CT-1激活剂接触从而促进干细胞增殖的方法。本发明还提供通过将所述细胞直接或间接与CT-1(或其类似物、衍生物、变体和活性片段或CT-1激活剂)以及一种或多种干细胞调节剂接触从而促进干细胞增殖和分化的方法。抑制干细胞增殖的方法包括将所述细胞直接或间接与一种或多种CT-1抑制剂接触。本发明提供的所述方法有多种应用。例如，所述方法可用于体外促进干细胞增殖，其中所述细胞已决定用于进一步体外应用，例如用于研究目的。所述方法可用于维持体外干细胞培养物，还有在开发新的药物测试体外模型的潜在应用。
另外，所述促进增殖和/或分化的方法可用于刺激干细胞的离体(ex vivo)扩增和/或分化，从而提供适于移植或施用于对其需要的患者的细胞群体。干细胞的离体扩增具有治疗很多疾病状况的治疗指证。
所述促进增殖和/或分化的方法也可用于体内促进驻留于组织中的干细胞的增殖和/或分化，从而有助于替换或修复被破坏的组织，这种破坏是所述疾病或病症、或手术或损伤后的结果。
与之相似，所述使用一种或多种CT-1抑制剂抑制增殖的方法可用于抑制体内干细胞增殖，从而防止组织中的不适当细胞增殖或使之降至最低。
也涉及促进干细胞增殖和之后分化的序贯法。例如，通过将所述细胞直接或间接与CT-1或CT-1激活剂接触，可以离体扩增干细胞群体。所扩增的细胞群体随后施用于患者，并用促进干细胞原位分化的一种或多种干细胞调节剂体内处理。作为替代方案，可以在将所述细胞施用患者之前离体进行以上两个步骤。
对于体内和离体方法，所述干细胞可以是自体、异体或异种的。
所述促进干细胞增殖(和任选的分化)方法的治疗应用典型的涉及需要替换损失或破坏组织的情况，例如化疗或放疗之后、肌肉损伤之后、或治疗或护理疾病和病症过程中。例如，所述方法可与骨骼肌干细胞一起用于治疗、护理或预防退行性肌肉障碍、肌营养不良、神经肌肉退行性疾病、HIV感染等；可与神经干细胞一起用于治疗、护理或预防神经退行性疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病，以及与心肌细胞一起用于治疗、护理或预防退行性或缺血性心脏病、动脉硬化症、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、先天性心血管缺陷、动脉炎症和动脉、小动脉和毛细血管的其它疾病，用于再生瓣膜、传导组织或血管平滑肌，和用于预防接受冠状动脉搭桥移植物患者的进一步疾病。可用本发明所述方法治疗或预防的其它疾病或病症可以包括但不限于退行性肝病，包括硬化和肝炎和糖尿病。
所述抑制干细胞增殖方法的治疗应用典型的但不总是涉及需要预防或最小化不适当细胞增殖的情况，例如治疗或预防心脏肥大。
在本发明一个实施方案中，所述方法应用于心脏干细胞。在另一个实施方案中，所述方法应用于成体心脏干细胞。在另一个实施方案中，并非有以任何方式限制的含义，所述方法应用于骨骼肌干细胞。
本发明还提供药物组合物，其包含CT-1、其类似物、衍生物、变体或活性片段、CT-1激活剂或CT-1抑制剂、以及制药接受的稀释剂或赋形剂。所述药物组合物任选的还可以包含一种或多种干细胞调节剂、一种或多种干细胞，或其组合。药物组合物和制备药物组合物的方法在本领域已知，例如描述于“RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy”(前称“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(2000)。
施用所述药物组合物可经过多种途径，取决于是希望局部还是系统性治疗，还取决于待治疗区域。典型的，局部施用所述组合物到待治疗区域。给药可以是外用(包括眼部和包括阴道和直肠的粘膜递送)、经肺部(如经吸入或吹入粉末或气溶胶，包括经喷雾器)、气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠道外。胃肠道外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射，例如但不限于心脏内注射或灌输、或颅内如鞘内或心室内给药。
本发明组合物与制药接受的载体组合递送。优选的是，这种载体将增强稳定性和/或递送特性。实例包括脂质体、微颗粒或微胶囊。在本发明的多种实施方案中，这些载体的应用可能对实现所述活性成分的持续释放有益。
当配制成胃肠道外注射剂时，所述药物组合物优选使用无菌溶液形式，其中含有其它溶剂，例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖。
对于经吸入或吹入给药，所述药物组合物可以配制成水性或部分水性溶液，然后可以使用气溶胶形式。对于外用，所述调节剂或含所述调节剂的药物组合物可以配制成制药接受载体中的散粉(dusting powder)、乳膏或洗液，它们涂覆于皮肤的受影响部分。
所述药物组合物的剂量要求随所用具体组合物、给药途径和待治疗的具体患者而变化。剂量要求可通过本领域技术人员已知的标准临床技术来确定。治疗一般从小于每种化合物最佳剂量的小剂量开始。然后增加剂量直到达到所述情况下的最佳效果。一般来说，施用所述药物组合物的浓度一般将提供有效结果而不引起任何有害或有毒的副作用。可以单个单位剂量给药，或者如果希望，所述剂量可分成适于在全天的合适时间给药的方便亚单位。
当使用处理所述干细胞的离外方法时，可通过多种程序将所述干细胞施用于患者。典型的，局部施用所述干细胞。可以作为制药接受液体介质中的细胞悬液经注射施用所述干细胞。作为替代方案，可以在生物相容性介质中施用所述干细胞，所述介质原位变成半固体，或固体基质。例如，所述基质可以是在组织破坏部位形成半固体凝胶的注射液，如含胶原和/或其衍生物、聚乳酸或聚乙醇酸，或者它可以含一层或多层柔性、固体基质，并以其最终形式如浸渍纤维基质植入。这些基质在本领域已知(例如，由Upjohn，Kalamazoo，Mich.可得的Gelform)，具有在损伤部位支持细胞的功能，从而增强所施用细胞增殖和分化的概率。
基因治疗本发明也涉及通过本领域已知的多种“基因治疗”方法施用编码CT-1(或其变体或活性片段，或CT-1激活剂)和任选的干细胞调节剂的多核苷酸，所述多核苷酸在体内表达所编码产物。施用CT-1的方法在本领域已知。例如，CT-1已经用在腺病毒中来治疗运动神经元退化(Lesbordes et al.，(2003)，Hum.Molec.Gen.12，1223-1229)。基因治疗包括体外和体内技术。因此，宿主细胞可以离体用多核苷酸遗传工程化，然后将工程化细胞提供给上述待治疗患者。
作为替代实施方案，可用本领域已知技术施用多核苷酸在体内工程化细胞。例如，直接注射“裸”多核苷酸(Feigner and Rhodes，(1991)Nature 349351-352；U.S.Patent No.5,679,647)，或与辅助细胞吸收多核苷酸的一种或多种其它物质配成组合物的多核苷酸，所述其它物质如皂素(例如见美国专利No.5,739,118)或阳离子聚胺(例如见美国专利No.5,837,533)；微颗粒轰击(例如通过使用“基因枪”；Biolistic，Dupont)；使用脂质、细胞表面受体或转染剂包被所述多核苷酸；将所述多核苷酸包封在脂质体、微颗粒或微胶囊中；施用与已知进入核的肽连接的多核苷酸；或施用与配体连接的所述多核苷酸，所述配体参与受体介导的细胞内吞(例如见Wu and Wu，(1987)J.Biol.Chem.2624429-4432)，这可用于靶向特异性表达所述受体的细胞类型。
作为替代方案，可以形成多核苷酸-配体复合体，其中所述配体包含可破坏内体的促融合病毒肽，使所述多核苷酸免受溶酶体降解；或者通过靶向特异性受体而靶向所述多核苷酸，以便细胞特异性摄入和体内表达(例如见国际专利申请WO92/06180，WO 92/22635，W092/20316，W093/14188和WO 93/20221)。本发明也涉及细胞内引入所述多核苷酸，并随后经同源重组掺入宿主细胞DNA中以供表达(例如见Koller and Smithies(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra et al.(1989)Nature 342435-438)。
所述多核苷酸也可引入合适表达载体中。本领域已知适于基因治疗应用的多种载体(例如见Viral VectorsBasic Science and Gene Therapy，Eaton Publishing Co.(2000))。
所述表达载体可以是质粒载体。产生和纯化质粒DNA的方法是快速而简单的。此外，质粒DNA通常不整合入宿主细胞基因组中，而是作为分离的实体维持在附加体位置，从而消除染色体整合可能带来的基因毒性问题。
如今容易从商业途径获得多种质粒，包括来源于大肠杆菌和枯草杆菌的质粒，其中很多专门设计用于哺乳动物系统。可用于本发明的质粒的实例包括但不限于真核表达载体pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1(Invitrogen)、pAd/CMV和pAd/TR5/GFPq(Massie et al.，(1998)Cytotechnology 2853-64)。在一个示例性实施方案中，所述质粒是pRc/CMV、pRc/CMV2(Invitrogen)、pAdCMV5(IRB-NRC)、pcDNA3(Invitrogen)、pAdMLP5(IRB-NRC)或pVAX(Invitrogen)。
作为替代方案，所述表达载体可以是基于病毒的表达载体。基于病毒的表达载体的实例包括但不限于来源于复制缺陷型逆病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体。逆病毒载体和腺相关病毒载体是当前选用于体内转移外源基因尤其是进入人体的重组基因递送系统。这些载体提供基因向细胞的有效递送，并且转移的多核苷酸稳定整合入宿主染色体DNA。使用逆病毒的主要条件是确保使用的安全性，尤其是有关野生型病毒传播到细胞群体中的可能性。用于衍生逆病毒载体的逆病毒包括但不限于莫洛尼小鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓组织增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒。具体的逆病毒包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们是本领域技术人员公知的。
所述多核苷酸通常引入所述载体中合适启动子的控制下，从而允许体内表达所编码多肽。可用的合适启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子、E1A启动子、主要晚期启动子(MLP)和相关前导序列或E3启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞体病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆病毒LTR；组蛋白、pol III和(β-肌动蛋白启动子；B19细小病毒启动子；SV40启动子；和人生长激素启动子。所述启动子也可以是感兴趣基因的天然启动子。合适启动子的选择将取决于载体、宿主细胞和所编码蛋白，并且在本领域技术人员的普通技术范围内。
开发只产生复制缺陷型逆病毒的专门细胞系(称为“包装细胞”)增加了逆病毒用于基因治疗的效用，并且缺陷型逆病毒已被很好表征用于基因治疗目的的基因转移(综述见Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。因此，可以构建重组逆病毒，其中部分逆病毒编码序列(gag、pol、env)已经被待用多核苷酸替换，使逆病毒具有复制缺陷性。然后使用辅助病毒经标准技术将所述复制缺陷型逆病毒包装成能用于感染靶细胞的毒粒。制备重组逆病毒和用这些病毒体外或体内感染细胞的操作方案可在CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)，J.Wiley & Sons，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它标准实验手册中查到。用于制备亲嗜性和兼嗜性逆病毒系统的合适包装病毒株实例包括Crip、Cre、2和Am。包装细胞的其它实例包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN细胞系，如下文描述Miller，Human Gene Therapy，Vol.1，pgs.5-14(1990)。
另外，已经表明可以通过修饰病毒颗粒表面上的病毒包装蛋白来限制逆病毒及随后逆病毒基载体的感染谱(例如见PCT公开WO93/25234和WO94/06920)。例如，修饰逆病毒载体感染谱的策略包括将细胞表面抗原特异性抗体与病毒env蛋白偶联(Roux et al.(1989)PNAS 869079-9083；Julan et al.(1992)J.Gen Virol 733251-3255；和Goud et al.(1983)Virology 163251-254)；或将细胞表面受体的配体与病毒env蛋白偶联(Neda et al.(1991)J Biol Chem 26614143-14146)。偶联可以是与蛋白或其它多种物质(例如将env蛋白转变成脱唾液酸糖蛋白的乳糖)的化学交联形式，以及通过产生融合蛋白(例如单链抗体/env融合蛋白)。这种技术当用于限制或指导感染某种组织类型时，也可用于将亲嗜性载体转变成兼嗜性载体。
此外，通过使用组织或细胞特异性转录调节序列可进一步增强逆病毒基因递送的用途，所述转录调节序列控制载体中所含多核苷酸的表达。
用于基因治疗技术的另一种病毒载体是腺病毒来源的载体。可以操作腺病毒基因组使得它编码并表达感兴趣基因产物，但其在正常溶胞病毒生活史中复制的能力被灭活。例如见Berkner et al.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld et al.(1991)Science252431-434；和Rosenfeld et al.(1992)Cell 68143-155。来源于腺病毒株Ad 5型d1324(Ad type 5d1324)或其它腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Adz等)的合适腺病毒载体对本领域技术人员公知。重组腺病毒在某些情况下可具有优势，因为它们能用于感染包括周围神经细胞的各种细胞类型。另外，所述病毒颗粒相对稳定并可以纯化和浓缩，并且如上所述，可以被修饰以影响感染谱。另外，导入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不整合入宿主细胞基因组，而保持附加体形式，从而避免当所导入的DNA整合入宿主基因组中时(如逆病毒DNA)作为插入突变结果可能发生的潜在问题。另外，相对于其它基因递送载体，腺病毒基因组携带外源DNA的能力较大(最高为8kb)(Berkner et al.同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。当前使用且本发明涉及的多数复制缺陷型腺病毒载体中删除了全部或部分的病毒E2和E3基因，但保留约80％腺病毒遗传物质(例如见Jones et al.(1979)Cell 16683；Berkner et al.，同上；和Graham et al.in Methods in Molecular Biology，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，N.J.，1991)vol.7.pp.109-127)。
产生和扩增复制缺陷型人腺病毒载体要求独特的辅助细胞系。辅助细胞系可以来源于人细胞，如人胚肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其它人胚胎间充质细胞或上皮细胞。作为替代方案，所述辅助细胞可以来源于对人腺病毒允许的其它哺乳动物物种细胞，即提供允许复制缺陷型病毒复制的必要序列。这些细胞例如包括293细胞、Vero细胞或其它猴胚间充质或上皮细胞。也涉及使用非人腺病毒载体如猪或牛腺病毒载体。适当病毒载体和辅助细胞系的选择在本领域技术人员的普通技术范围内。
在本发明一个实施方案中，所述基因治疗载体是腺病毒来源的载体。
试剂盒本发明还提供治疗试剂盒，其含有位于药物组合物中的CT-1、其类似物、衍生物、变体或活性片段、或CT-1激活剂和任选的一种或多种干细胞调节剂。还提供了在药物组合物中含一种或多种CT-1抑制剂的试剂盒。所述试剂盒的单个成分分别包装在独立容器中，并且与这些容器相关的可以是规范药物或生物制品的生产、使用和销售的政府机构批准形式的公告，该公告反映经生产、使用或销售的机构批准用于人类。
当所述试剂盒的成分以一种或多种液体溶液提供时，所述液体溶液可以是水性溶液，例如无菌水性溶液。在此情况下所述容器本身可以是吸入器、注射器、移液器、滴眼器或其它类似装置，所述组合物可以从中施用于患者。
所述试剂盒中的成分也可以干燥或冻干形式提供，并且所述试剂盒还可以含有合适溶剂，以便重构冻干成分。与容器的数目或类型无关，本发明试剂盒也可包含辅助将所述组合物施用于患者的装置。这种装置可以是吸入器、注射器、移液器、镊子、量匙、滴眼器或任何类似的医学上允许的递送载体。
结果从转化了合适核苷酸构建体的细胞中产生并分泌的CT-1促进干细胞增殖和/或分化。现在参考图3和4，其中的时间曲线结果表明心脏内注射24、48、72和96小时后CT-1对小鼠心脏细胞的影响。数据提示SP细胞响应CT-1处理而增殖。因此，本发明提供了促进患者中干细胞增殖的方法，包括将含CT-1的组合物或能产生CT-1的组合物施用于患者。
在上述方法的实施方案中，所述干细胞包含心脏细胞，更优选心脏SP细胞。然而，所述干细胞也可以包含来源于其它体液、组织和/或器官的干细胞，例如但不限于骨骼肌干细胞、骨髓干细胞或肝干细胞等。在本发明另一个实施方案中，并非具有以任何方式限制的含义，所述干细胞可以包含骨骼肌干细胞。优选所述干细胞是人干细胞。
包含或编码CT-1的组合物可通过本领域已知的任何途径施用于患者，例如但不限于经注射或灌输。不希望以任何方式限制，这些注射途径包括但不限于肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或动脉内注射等。在本发明一个实施方案中，所述组合物经肌肉注射施用。在本发明另一个实施方案中，经心脏内注射或灌输施用所述组合物。
如上所述，图3和4表示的结果表明CT-1促进受治疗患者中的细胞增殖，例如但不限于干细胞的增殖。尽管表达并分泌CT-1的细胞使得大致连续地将CT-1施用于患者，此处所得结果表明连续施用CT-1后SP细胞群体有短暂增加。另外，结果表明，与对照比较，CT-1处理后经约24小时到约96小时的时间，SP细胞总数增加。这些结果提示应该以多剂量施用CT-1从而避免干细胞不对CT-1处理作应答的时间段。另外，与单剂量或连续剂量CT-1比较，多剂量CT-1可以促进干细胞更大增殖和/或分化。另外，与多剂量递送比较，此处所述的间隔一定时间、例如间隔约24小时的多剂量可以促进干细胞更大程度的增殖和/或分化。
本发明提供促进患者中干细胞增殖的方法，包括将两个或多个含CT-1的组合物施用于所述患者。优选的，施用于所述患者的第一和第二个剂量间的时间段、任选的任意两个CT-1剂量之间的时间段大于约24小时，更优选至少约48小时，更优选至少约72小时，更优选至少约96小时，或更长。本发明也包括将两个或多个剂量的CT-1施用于患者，其中任意两个剂量间的时间段是约2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、28天、1月、2月、3月、6月、1年，或之间的任意时间。所述两个或多个剂量例如在CT-1量、配方、组合物中成分或其任意组合方面可以相同或不同。本发明也包括将三个、四个、五个、六个、七个或更多含CT-1的组合物施用于患者。
本发明也提供筛选增加被试者中细胞增殖的化合物的方法，包括a)将化合物施用于属于测试组的一个或多个被试者；b)从所述一个或多个被试者的至少一种体液、组织或器官中分离多个细胞；c)将所述多个细胞进行FACS分析并定量含有一种或多种明确特征的细胞数目；d)将具有所述一种或多种明确特征的细胞数目与从一个或多个对照被试者中获得的结果作比较。
所述细胞可以包含单种类型细胞或很多类型细胞的组合。在一个实施方案中，所述细胞包含干细胞。在一个替代实施方案中，所述细胞包含心脏细胞或骨骼肌细胞。在另一个替代实施方案中，所述细胞包含心脏干细胞。在另一个替代实施方案中，所述细胞包含心脏SP细胞。
也涉及分析步骤(步骤c)进一步包括分离所述细胞。
在一个替代实施方案中，施用步骤(步骤a)可以包括施用一种或多种化合物，其中至少一种化合物是CT-1多肽或基本表现与CT-1多肽相同生物活性的化合物，并且其中所述一种或多种化合物还包含至少一种干细胞调节剂，例如但不限于一种或多种信号传递分子，如但不限于一种或多种Wnt多肽、Pax7，或同时包含二者。
在一个替代实施方案中，提供了筛选增加被试者中细胞增殖的化合物的方法，包括a)从一个或多个被试者的至少一种体液、组织或器官中分离多个细胞，和任选的纯化所述多个细胞，以富集一种或多种特定细胞群体；b)用化合物处理所述多个细胞或所述一种或多种富集的细胞群体；c)培养所述细胞或细胞群体一段时间，使之足以允许所述细胞或细胞群体增殖和/或分化；和d)将从培养步骤得到的集落细胞数目与从一个或多个对照中获得的结果作比较。
比较步骤(步骤d)还可以包括将所述细胞进行FACS分析以鉴定一种或多种特定细胞群体，例如但不限于SP细胞。
以上描述并非要以任何方式限制要求保护的本发明，而且，所讨论的特征组合并非对本发明解决方案绝对必要。
本发明将在以下实施例中进一步说明。然而应该理解这些实施例只是用于说明目的，而不应用来以任何方式限制本发明范围。
实施例实施例1心营养素-1增加心脏干细胞样群体(SP)构建含由通用RSV启动子驱动的全长CT-1的腺病毒构建体(ad-CT-1)(图1)。将CT-1与所述神经生长信号融合，以促进CT-1从所述细胞分泌。将7.5×107PFU的ad-CT-1注射进2月龄小鼠心脏。同时使用50μL无菌PBS进行平行对照试验。注射后72小时分离细胞并进行FACS分析。图2是用Hoechst 33342染料染色并根据theHoechst 33342HSC Staining and Stem Cell Purification Protocol(见Goodell，M.，et al.(1996)J Exp Med 183，1797-806，引入此处作为参考)分析的所述心脏细胞悬液的FACS分析。从三个心脏收集细胞。注射盐水的心脏表现约0.93％的SP群体(图2A)而注射心营养素的心脏表现约3.61％的群体(图2B)。
图2C提供CT-1腺病毒在受感染H9C2细胞中表达的证据。细胞用腺病毒处理，72小时后收集这些细胞的培养基以及未处理对照H9C2细胞培养基，用抗CT-1抗体进行Western印迹分析。印迹膜上显示约24.5kDa的CT-1蛋白。
图2D是对照注射24小时后心脏细胞FACS分析获得的结果。图2E是对照腺病毒注射24小时后心脏细胞FACS分析获得的结果。维拉帕米是可用于限定所述SP群体的药物(通道阻断剂)。例如，用维拉帕米处理的细胞排斥Hoechst染料并且不再能通过FACS分析检测到SP群体。用对照腺病毒处理后维拉帕米敏感的SP群体没有变化。
显示t＝24、48、72和96小时的时候ad-CT-1对小鼠心脏影响的时间曲线在图3A中给出。显示t＝24小时、48小时、72小时和96小时的时候CT-1对心脏细胞影响的第二个时间曲线在图3B中给出。用Hoechst 33342染料染色心脏细胞悬液并进行FACS分析。以前使用多种组织来源的研究已经确定Hoechst染料染色的细胞悬液显示出Hoechst流出的亚群体细胞(副群体或SP细胞)。这些细胞具有干细胞样活性，分化标志物减少或缺乏，并且也具有对维拉帕米存在敏感的特征，维拉帕米是多药抗性样蛋白的抑制剂[Goodell et al.(1997)，Nat.Med.3，1337-1343；Jackson et al.(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，14482-14486.]。因此，为评价驻留心肌干细胞群体的存在，成熟小鼠(约2月)的心脏被酶促解离成单细胞悬液，并进行FACS分析。使用装备双激光器的DakoCytomation MoFlo流式细胞仪进行FACS分析。在两个波长处测量荧光。在488nm(Spectraphysic氩激光器)处测量前向和侧向散射。Hoechst染料在350nm被激发(I90C UV激光器，来自Coherent)。在424nm(424/44带通滤光器)测量蓝色发光，在675nm(675AGLP宽带滤光器)以上测量红色发光。使用510DLP分色镜分开这两个波长。心肌细胞悬液的FACS分析显示来自小鼠心脏组织的排斥Hoechst染料的明显(robust)SP群体。所有细胞从2月龄小鼠心脏中分离，这些小鼠经直接心内注射接受7.5×107PFU ad-CT-1或lacZ腺病毒。
参考图4，其中的结果表示心内注射后4天恢复期间在AdCT-1处理的心脏中发现的SP细胞相对数目。对每个时间点而言，所述数据用对照注射心脏获得的数据进行标准化。数据表明心脏SP细胞随时间推移有约3倍增加，在较短时间内，例如在约48h到约72h的时候看到大的增加。
参考表2，其中表示，与对照比较，用CT-1处理的被试者的心脏质量与身体质量的比值。
表2用CT-1处理的被试者的心脏质量/身体质量比值的比较
统计分析指出对照组和CT-1处理组所得比值之间没有显著差异存在(p＞0.05)。这些结果提示CT-1可施用于患者预防或治疗多种病症或疾病，例如但不限于心脏病或疾病，而不促进所述患者的心脏肥大。
心脏内施用ad-CT-1对骨骼肌、骨髓和肝脏在24小时、48小时、72小时和96小时时间点的影响表示于图5A-C。结果表明心脏内注射ad-CT-1提供选择性促进患者中心脏干细胞增殖的合适方式。与之相似但不希望以任何方式限制，在患者的特定肌肉中肌肉注射CT-1或能产生CT-1的组合物可以导致干细胞在那块肌肉中的选择性增殖，而不是在另外区域，例如但不限于心脏和其它肌肉或组织。作为比较，但不希望限制，通过使得CT-1接触多种组织或器官系统的一种或多种途径向患者施用CT-1或能产生CT-1的组合物，可以导致干细胞在一种或多种组织或器官系统中的非选择性增殖，例如但不限于心脏和骨骼肌组织。这些结论由Methocult测试的结果支持，所述测试使用含促进集落形成所必需的因子的甲基纤维素或凝胶样介质。该测试可用于确认干细胞群体是否在其生活周期中经受某种程度的激活。简单的说，通过在时间＝注射后24、48、72或96小时以约10,000细胞/板将注射adCT-1或adLacZ的小鼠细胞铺板，根据制造商说明进行所述实验(StemCell Technologies，Catalog#28405，Version 3，February 2004)。来自心脏、骨骼肌和骨髓的副群体(SP)和主群体(MP)组分都被检测。培养细胞两周，随后计数集落数并对包括造血标志物的多种细胞标志物染色。体内施用Ad-CT-1载体导致一种或多种骨骼肌干细胞群体的增殖增加。例如，尽管暴露于Ad-CT-1的骨骼肌中SP增加小，与对照处理的培养物比较，来源于骨骼肌并生长于允许条件(即methocult培养基)下的原代细胞培养物导致造血集落数目约10倍增加。
参考图6，其中结果提示施用CT-1促进大于约3周龄的小鼠被试者中细胞增殖。因此本发明涉及此处及全文中定义的方法，其中所述被试者大于约3周龄，优选2月龄。在一个实施方案中，其中所述被试者是人，本发明涉及此处和全文中定义的方法，其中所述被试者大于约1月，优选大于约2月，更优选大于约6月，更优选大于约1年。在另一个实施方案中，所述被试者是成年人被试者。
参考图7，其中结果提示CT-1加速成体心脏干细胞的分化。表达组成型表达GFP转基因的小鼠注射CT-1。24小时后收集心脏，并且将从这些心脏分离的SP细胞与正常原代心肌细胞共培养。结果表明GFP标记的SP细胞明显转变成连接蛋白-43阳性的心肌细胞。所述结果提供了CT-1可用于促进被试者中心脏干细胞的增殖和/或分化证据。进而，基于从所述试验获得的结果，本发明也提供筛选调节心脏干细胞增殖、分化或增殖和分化的化合物的方法，包括下列步骤a)从被试者分离含心脏干细胞的多个细胞；b)用一种或多种化合物处理所述细胞；c)将步骤b处理的细胞与一种或多种正常原代心肌细胞一起培养一段时间，使得足以允许所述细胞经历增殖、分化或二者兼有，和；d)测顶增殖细胞、分化细胞、或增殖和分化细胞的数目。处理步骤可以包括将所述细胞与CT-1、或其片段或衍生物、CT-1活性调节剂、wnt多肽、或表现wnt活性的其片段或衍生物、Pax7、或以上的任意组合接触。也可以使用其它信号转导分子。也涉及在分离步骤之前用CT-1处理被试者以促进一种或多种干细胞群体的增殖。在另一个实施方案中，所述含心脏干细胞的多个细胞可以包含使它们与正常原代心肌细胞区分的标志物等。例如，含心脏干细胞的多个细胞可以被GFP标记，而所述正常原代心肌细胞不被GFP标记。区分含心脏干细胞的多个细胞和正常心肌细胞的任何方法都可以用于此处所述的方法。
参考图8，其中大体说明了确定心脏内注射Ad-CT-1是否能影响受损骨骼肌修复所应遵照的实验程序。进行所述实验以确认methocult实验的观察结果。在那些试验中，注意到心脏内注射CT-1导致在methocult培养基上形成的来自骨骼肌的“干细胞样”集落的数目增加。这些结果提示CT-1激活骨骼肌中的干细胞样群体，该群体可辅助或增强所述骨骼肌修复过程。为确认这些观察结果，注射蛇毒心脏毒素诱导小鼠后肢破坏。心脏毒素在短时间(约1-2天)内诱导肌肉极度退化。然而已经公知破坏后几天骨骼肌可以充分修复自身。此处，诱导心脏毒素破坏后立即注射CT-1。进而，进行类似试验，其中在心脏毒素注射1-3天后施用CT-1。
参考图9，其中结果表示对照注射、心脏毒素(ctx)注射、或心脏毒素和Ad-CT-1同时注射后约6天的破坏程度。在这些实验中，向1月龄小鼠后肢的右胫骨前肌(TA)注射10微摩尔心脏毒素。对侧腿用作对照。另一组小鼠中，注射心脏毒素后心内施用CT-1。6天后，解剖TA肌肉并冷冻切片。所述肌肉切片用苏木精/伊红染色显示膜和结构组分。当在注射心脏毒素的大概同时施用CT-1时观察到更多肌肉完整性。
参考图10，其中表示如上所述处理并用抗α-辅肌动蛋白抗体染色的肌肉横切片。α-辅肌动蛋白染骨骼肌的肌节z-带，是肌肉肌节完整性的公认指标。结果提示用CT-1处理的肌肉表现出比单独心脏毒素(ctx)处理肌肉更好的α-辅肌动蛋白染色。不希望受理论约束或以任何方式限制，这些结果提示CT-1可以用于增强损伤后骨骼肌恢复，和/或CT-1可以保护肌肉免于损伤后退化。
一般方案骨髓分离取小鼠腿。取小鼠前腿长骨(股骨)，也可以分离后腿以增加骨髓细胞数。
1)去除周围肌肉和其它组织2)尽可能高的程度的切割骨3)去除膝盖周围组织并切断长骨
4)骨游离出后用胰岛素注射器冲洗骨髓到5cm组织培养皿中。
5)用5mL PBS冲洗一根骨，确保冲洗两端。
6)如果需要重复操作。
7)收集骨髓后，用18号针头在皿中磨碎(triturate)。
8)转移细胞到15mL Falcon管。保持于冰上。
9)为进行FACS，从离心下细胞并用DMEM+洗涤的点继续操作方案*不需要消化*用于FACS方案的抗体染色1)按照HOECHST操作方案直到最后洗涤，就在重悬于HBSS+中之前。
2)以1ml/心脏重悬于PBS+2％FBS中。
3)用血细胞计数仪计数细胞公式＝#细胞/mm3×稀释度×10,000(#细胞/mL)4)制作饱和曲线＞用PBS+2％FBS稀释细胞到终浓度3,000,000细胞/mL＞每管100μL加入8个管中(两个对照和6个不同浓度抗体)＞接着稀释抗体溶液(ex制备400μL的5μg/mL溶液，其中起始浓度是100μg/mL)5(400)＝100(x)x＝20μL将20μL抗体加入380μL dH2O中＞取100μL并加入细胞。称此为对照#1，其中含NO 2°抗体。
＞另取100μL并加入细胞，并加NO 2°抗体。
＞将剩余抗体(200μL)加入200μL dH2O中。得到400μL的2.5μg/mL溶液。
＞继续直至完成适当数目的稀释。
＞对照#2将是没有1°抗体的细胞。
5)将细胞与第一抗体在冰上孵育15分钟。
6)离心细胞并去除上清液。
7)用PBS+2％FBS洗涤细胞。
8)重悬于200μLPBS+2％FBS中。
9)加入第二抗体并在冰上孵育15分钟。
10)再次用PBS+2％FBS洗涤细胞。
11)重悬于500μLHBSS+。
12)转移入小圆底Falcon管*用于FACS*13)用1cc胰岛素注射器取出任何细胞团块14)记得取含1mL培养基的15mL管，待用于收集细胞。
15)进行FACSFACS配方维拉帕米(100×)制备100×最终贮液用95％乙醇悬起终浓度50μMHOECHST 33342(200×)制备200×最终贮液用水悬起终浓度1mg/mLDMEM+388mLDMEM8mL FBS4mL 1M Hepes
HBSS+100mL HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)2mL FBS1mL 1M Hepes胶原酶-分散酶在通风橱中制备用5mL 1×PBS溶解整个500mg胶原酶瓶每5mL等份胶原酶-分散酶溶液加入＞4.34mL分散酶2(t.c.冷冻)＞500μL悬起的胶原酶(+4℃冷藏)＞125μL 100mM CaCl2PBS+2％FBS*抗体染色时使用*500mLPBS10mL FBSHoechst 33342干细胞染色和纯化方案1)打开通风橱并在37℃水浴中解冻胶原酶/分散酶。
2)处死小鼠，喷乙醇并解剖出心脏。
3)将心脏放入冷PBS中(保存于4℃的合格PBS)4)用镊子从心脏中挤压出多余血液5)保存于冷PBS中直至准备消化6)在通风橱中，用两个刀片，将心脏切碎。(确保心脏湿润～如果它们变成膏状则加入100μL PBS)7)然后转移切碎的心脏到小组织培养皿中
8)每1到4个心脏加4-5mL胶原酶/分散酶9)上下吹吸至完全混合，并分开细胞团块10)在37℃孵箱中放置35-38分钟11)通过75微米筛网滤器(从网孔板)12)用5mL PBS漂洗滤器并收集在50mL管中。
13)转移50mL管的内容物到15mL管中。
14)在设置1.2离心10分钟，去除上清液，并重悬于8mL冷DMEM+中，并再次在设置1.2离心10分钟。
15)仔细去除上清液，将沉淀重悬于2mLDMEM/心脏(估计细胞数)16)用Hoechst和维拉帕米(都冷冻保存)染色加5μL/mL 200×Hoechst到所有细胞中取1mL Hoechst染色的细胞并放入新15mL管中加15μL/mL 100×维拉帕米17)在37℃孵箱中放置90分钟。确保温度恒定。
18)冰上放置5分钟。
19)在设置1.2离心10分钟，去除上清液，重悬于8mL冷DMEM+中，再次在设置1.2离心10分钟。
20)去除上清液并重悬于HBSS+中(～200μL/心脏)。
21)转移到带盖小管中用于FACS，用1cc胰岛素注射器去除任何细胞团块22)从该点开始保持于冰上(无生物活性的)23)记得取含1mL培养基的15mL管，待用于收集细胞。
24)进行FACS分析ASAP以最小化可能在此期间发生的任何变化。
原代心肌细胞培养基培养基应该临用前新鲜制备，但也可以在冷藏箱中保存约1周。
向50mL DMEM-F12中加入以下成分d-葡萄糖 0.3g
1-谷氨酰胺500μL200mM贮液pen-strep 500μL 5000单位贮液胰岛素250μL 5mg/mL贮液去铁转铁蛋白 100μL50mg/mL贮液孕酮 1μL 1mM贮液腐胺 60μL 8mg/mL贮液硒15μL 100μM贮液两性霉素B 50μL 12.5μg/mL贮液肝素 10μL 10mg/mL贮液用0.2μm滤器过滤培养基。过滤后加入40μL 25μg/mL bFGF贮液。EGF任选。如果使用，以10μL100μg/mL贮液在过滤前加入50mL DMEM-F12培养基中。
分离心肌细胞的配方MEM-JM(500mL)400mLdH2O5.65g MEM-JM1.0g碳酸氢钠用NaOH调节溶液pH到7.3，用H2O补充到终体积500mL，过滤除菌。
2×胶原酶(新鲜制备)30mg胶原酶15mLMEM-JM过滤除菌(注射器)DMEM-10％FBS400mLDMEM45mL FBS
4.5mL pen/strepDMEM-F12+ITS (500mL)半包DMEM-F12(约7.8g)2.5mL pen/strep500μLITS0.6gNaHCO3分离原代心肌细胞准备制备培养基，加30mg胶原酶到15mL JMEM中，过滤除菌并放置于37℃水浴(约20只小于6日龄小鼠)。
解剖心脏1)从小鼠切下心脏，尽量避免心房，放置于含冷DMEM-JM的50mL管中。
2)在JMEM培养基中上下吹吸洗涤心脏。
3)转移心脏到petri培养皿，如果需要用PBS保持湿润。
4)用两个解剖刀片切碎心脏。
胶原酶消化1)用25mL宽口吸管用20mL JMEM轻柔洗涤petri培养皿中的心室组织。几次后用吸管吸打组织和培养基。让组织沉降并只“吸出”组织到洁净50mL管中。丢弃培养基，其中含多数红细胞。
2)用同样的25mL吸管，从50mL管中组织去除任何残余液体，并加入适当体积的JMEM和2×胶原酶。(见表，并考虑所用组织量)
3)以20-30转/分在37℃孵育轻柔旋转15分钟。同时准备2个含10％FBS+DMEM的50mL管。
4)第一次孵育后，用25mL吸管缓慢吹打(triturate)组织和培养基大约3次。等1分钟让组织沉降，缓慢吸出上清液并丢弃(多数BBC和第一次的碎片)。更换成10mL新鲜JMEM。重复洗涤步骤1次。使组织沉降1分钟并丢弃上清液。测量组织量并加入JMEM以调整到适当体积(见表)。加入胶原酶并孵育。
5)随后孵育结束时，用10mL吸管缓慢吸打组织和培养基并吹打2次。等1分钟然后，缓慢吸起上清液并转移到含10mL FBS的50mL管中而终止胶原酶消化。用10mL新鲜JMEM更换宿主组织。重复洗涤步骤1次。使组织沉降1分钟，然后转移上清液到含FBS的同一个50mL管中。测量出组织体积并加入JMEM调整到适当体积，然后加入胶原酶。
6)向所述含FBS和来自两次洗涤上清液的50mL管中，加入足量DMEM以充满管子。在水平转头离心机(airplane)中50g离心5分钟。真空吸出上清液，将沉淀重悬于10mL DMEM-20％FBS。在通风橱中室温保存。
7)再重复步骤4和5两次(或多次)。
8)最后孵育后，用10mL吸管缓慢吹打两次。用10mL新鲜DMEM+10％FBS更换宿主组织，重复洗涤步骤1次。使组织沉降1分钟，转移上清液到同一个含FBS的50mL管中。
9)向含FBS和来自两次洗涤上清液的50mL管中加入足量DMEM+10％FBS以充满管子，并在500g离心5分钟。
预铺板操作程序
1)去除上清液2)重悬于20mL DMEM+10％FBS。
3)放置nytex尼龙滤器在无菌的50mL管上准备过滤。将过滤的悬液均匀分配到一个无菌的150mm petri培养皿中，并在37℃孵育15分钟。(这是第一次铺板)4)孵育后，缓慢吹打并转移上清液(～20mL)到第二个皿中。
5)用10mL新鲜DMEM+10％FBS洗涤旧培养皿，并转移到第二个培养皿中(这是第二次铺板)。在37℃孵育15分钟。
6)用10mL或更少DMEM+10％FBS重悬沉淀。一定记得，较少量的重悬体积意味着越多的细胞用于细胞计数程序并且浓度也比铺板程序使用的最终浓度更高。
7)细胞铺板到含～5mLDMEM+10％FBS的2mm×6mm培养皿中。盖上培养皿孵育20小时。预铺板细胞的第二个板保持于DMEM+10％FBS中。
8)20小时培养后，更换平板培养基为DMEM F12+ITS。
9)生长第一天后，轻柔漂洗平板并转移含漂浮细胞的生长培养基到15mL管中。离心下细胞并重新铺到带盖平板中的新鲜DMEM+10％FBS培养基中。第二次预铺板在DMEM+10％FBS中生长3天。
细胞计数1)在1.5mL eppendorf管中，加200μL细胞悬液到400μL 0.4％台盼蓝溶液和400μL DMEM+10％FBS中。孵育2分钟，然后在血细胞计数仪中计数。分别计数活的心肌细胞和不活的心肌细胞。活肌细胞应该相当大并成核化或多核化。不活的细胞将染蓝色。忽略红细胞和其它小碎片。
2)计数和铺板以后，在37℃预热的DMEM+10％FBS中培养细胞过夜或至少16小时。在含血清培养基中培养24小时是最大值。
本发明如此描述，很明显可以很多方式作相同改变。这些改变不认为偏离本发明的实质和范围，对本领域技术人员而言显而易见的所有这些修改都包括在以下权利要求的范围内。
所有引用内容引入此处作为参考。
已使用优选实施方案描述本发明。然而，对本领域技术人员显而易见的是，可以在不偏离本文所述的本发明范围条件下对本发明进行很多改变和修改。
权利要求
1.促进干细胞群体增殖的方法，包括将所述干细胞与含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸接触。
2.抑制干细胞增殖的方法，包括将所述干细胞与一种或多种心营养素-1抑制剂接触。
3.促进干细胞增殖和分化的方法，包括将所述干细胞与含心营养素-1氨基酸序列的第一种多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述第一种多肽的多核苷酸以及一种或多种干细胞调节剂接触，其中所述一种或多种干细胞调节剂是多肽或编码多肽的多核苷酸。
4.根据权利要求3的方法，其中所述干细胞调节剂是Wnt多肽。
5.根据权利要求3的方法，其中所述干细胞调节剂是Pax7。
6.根据权利要求3的方法，其中所述一种或多种干细胞调节剂包含至少一种Wnt多肽和Pax7。
7.根据权利要求1的方法，其中所述方法在体外实施。
8.根据权利要求1的方法，其中所述方法在体内实施。
9.根据权利要求1的方法，其中所述干细胞是心脏干细胞。
10.促进哺乳动物中心脏干细胞增殖的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸。
11.根据权利要求10的方法，还包括施用诱导所述心脏干细胞增殖和/或分化的一种或多种干细胞调节剂。
12.抑制哺乳动物中心脏干细胞增殖的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的心营养素-1抑制剂。
13.修复或再生哺乳动物中心脏组织的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的含心营养素-1氨基酸序列的多肽或其类似物、衍生物、变体或活性片段或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽能促进心脏干细胞的增殖。
14.促进患者中干细胞群体增殖、分化、或增殖和分化的方法，包括，向所述患者施用至少一种组合物，所述组合物含具有心营养素-1活性的至少一种肽，或能表达具有心营养素-1活性的肽的核苷酸序列。
15.权利要求14的方法，其中所述干细胞包含心脏干细胞或骨骼肌干细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述干细胞包含心脏干细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述干细胞包含骨骼肌干细胞。
18.权利要求14的方法，其中所述施用步骤包括皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或静脉注射。
19.权利要求18的方法，其中所述肌肉注射包括心脏内注射。
20.权利要求14的方法，其中所述核苷酸序列包含病毒核苷酸序列。
21.权利要求20的方法，其中所述病毒核苷酸序列是腺病毒或逆病毒核苷酸序列。
22.权利要求20的方法，其中所述核苷酸序列包含分泌核苷酸序列，所述分泌核苷酸序列促进具有心营养素-1活性的肽从所述患者细胞中分泌。
23.权利要求22的方法，其中所述分泌核苷酸序列包含神经生长信号序列。
24.权利要求14的方法，其中所述施用步骤包括注射两次或多次组合物，每次所述组合物具有心营养素活性，并且其中所述两次或多次注射以至少约96小时的时间间隔分开。
25.组合物，包含a)心营养素-1或编码心营养素-1的核苷酸序列，和；b)至少一种干细胞增殖、分化、或增殖和分化的调节剂，选自i)一种或多种Wnt多肽；ii)编码一种或多种Wnt多肽的一种或多种核苷酸序列；iii)Pax7多肽；iv)编码Pax7多肽的核苷酸序列；或其组合。
26.筛选增加被试者中细胞增殖的化合物的方法，包括；a)向属于测试组的一个或多个被试者施用化合物；b)从所述一个或多个被试者的至少一种体液、组织或器官中分离多个细胞；c)将所述多个细胞进行FACS分析并定量具有一种或多种明确特征的细胞数目；和d)将具有一种或多种明确特征的细胞数目与从一个或多个对照被试者获得的结果作比较。
27.筛选增加被试者中细胞增殖的化合物的方法，包括，a)从一个或多个被试者的至少一种体液、组织或器官中分离多个细胞，和任选的纯化所述多个细胞，以富集一种或多种特定细胞群体；b)用化合物处理所述多个细胞或所述一种或多种富集的细胞群体；c)培养所述细胞或细胞群体一段时间，使得足以允许所述细胞或细胞群体增殖和/或分化；和d)将来自所述培养步骤的集落细胞数目与从一个或多个对照中获得的结果作比较。
全文摘要
提供促进干细胞增殖的方法，包括将所述细胞与心营养素－1(CT－1)接触。所述方法还可以包括将所述干细胞与一种或更多种促进所述干细胞分化的干细胞调节剂接触。也提供抑制干细胞增殖的方法，包括将所述细胞与一种或更多种CT－1抑制剂接触。所述方法可用于体外和体内促进或抑制干细胞增殖。也提供所述方法在替代损伤或缺陷组织或在抑制不适当细胞增殖的治疗性应用。
文档编号C07K14/54GK1812996SQ200480017889
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月25日 优先权日2003年6月25日
发明者林恩·梅吉尼 申请人:渥太华健康研究所