专利名称：用于改善皮肤外观的活细胞的用途的制作方法
技术领域：
本发明关于一种用于改善皮肤老化外观的医药组合物及其应用，尤其关于改善人类脸部皮肤老化外观的医药组合物及其应用。
背景技术：
皮肤老化的途径区分为自然性老化与光老化两种途径(Fisher et al.，2002)， 皮肤的自然性老化主要由染色体来控制，目前医学科技尚无法从改变染色体来阻止其进行，只能由避免已知的恶化因素(如暴露某些有害物质)着手。两种老化途径可由穿衣覆盖部位与阳光经常暴晒部位区别，表现的皮肤老化程度也有所不同。自然性老化可观察到角质干细胞(keratinocyte stem cells)减少的趋势(Bosset et al. , 2003;Kwon etal. , 2008; Webb et al.，2004),而且在显微结构的老化表现例如表皮中天然保湿因子流失，角质层增厚堆积，基底层细胞紊乱，黑色素增加呈现老人斑、色素斑、暗沉；真皮中乳头层平坦、玻尿酸减少(Oh et al.，2011),弹力纤维变性(Braverman et al.，1982),弹力蛋白质排列紊乱，胶原蛋白降低(Scharffetter-Kochanek et al.，2000),皮肤日渐不平坦，张力及弹性丧失，于是皱纹、松弛接踵而至，皮下脂肪变薄，皮脂腺分泌下降，皮脂膜功能趋低，皮肤保护功能以及保水的能力变差(Montagna et al.，1990)。近年来各先进国家推陈出新各种医学美容方式来改善皮肤老化现象，改善皮肤光老化的方法有很多，包括药物治疗、化妆品、外科治疗、剥脱性治疗、注射性治疗、非剥脱性嫩肤治疗等。但药物及部份保养品所含胶原蛋白、弹力素、水解蛋白质、黏多醣、玻尿酸、维他命E等因为分子结构太大，无法经皮吸收进入真皮，只能停留在表皮上扮演保湿的角色；外科治疗、剥脱性治疗及注射性治疗(如果酸换肤、微晶磨皮、激光除斑、激光磨皮、除皱)可以更新老化肤质，达到再生新皮的目的，但会产生创伤，皮肤恢复缓慢、术后并发症多，而胶原蛋白注射只能暂时性填充真皮组织消除皱纹，维持时间不超过九个月；非剥脱性嫩肤治疗的激光及射频容易造成炎症后色素沉着、瘢痕等并发症，并且波长单一适用范围小。细胞治疗是使用干细胞改善受损的器官，于医学领域作为最新的治疗方式。造血干细胞(hematopoiesis stem cell, HSC)是存在骨髓内的多能性干细胞,可分化成单核球、颗粒球、淋巴球、红血球及血小板(Gao et al.，2007)。周边血液干细胞(peripheralbloodstem cells, PBSC)在造血干细胞来源中相对容易取得，对捐赠者物理性伤害较小(Johnson et al.，1999)，并且在医学上有更多论文左证，因此周边血液干细胞的应用科技比其它成人干细胞有更多研究。迄今，此等干细胞未曾被使用作为达成改善皮肤老化的目的用的组合物的活性成分。希望获得一种使用新颖干细胞医药的组合物，该组合物能对皮肤提供改善的美观，特别是提供有效程度的淡化皱纹、更新肤质。更进一步希望获得能有效淡化皱纹、更新肤质，并且其所需之生物性材料浓度最少的组合物
发明内容
本发明之一目的是提供一种用于改善皮肤外观，包含挽救老化的效果的美容用组合物。本发明之另一目的是提供一种用于淡化皮肤皱纹的组合物，该组合物具有活性细胞物，较佳具有活性生物性细胞物。本发明之又一目的是提供一种用于改善外观，特别是藉由淡化皮肤皱纹而改善其外观之组合物，该组合物具有有效量的活性细胞物。本发明之再一目的是提供一种用于改善外观，特别是藉由淡化皮肤皱纹而改善其外观的组合物，该组合物适于局部施用于皮肤上。本发明之尚一步目的是提供一种淡化皮肤皱纹之方法，该方法包含将此等组合物施用于皮肤上。
整体而言，本发明亦提供含有有效量的一种本发明活性成分的局部施用组合物，该组合物用以施用于皮肤，而改善皮肤美观。此等有益效果以下述事项的任一个证明减少毛孔大小；改善皮肤色调、光彩、透明度及/或紧绷度；促进抗氧化剂活性；改良皮肤坚实度、丰满度、柔韧度、及/或柔软度；改善前胶原蛋白及/或胶原蛋白产量；改善皮肤构造及/或促进再组构作用；改善皮肤障蔽修护及/或机能；改善皮肤轮廓外观；恢复皮肤光泽及/或明亮度；补充因老化及/或更年期而衰减之皮肤基本营养素及/或成分；改善皮肤细胞间之传讯作用；增加细胞增殖及/或复制作用；增加因老化及/或更年期而衰减之皮肤代谢作用；改善皮肤湿度；促进及/或加速细胞更新；增强皮肤厚度；降低皮肤敏感度；增加皮肤弹性及/或恢复力。本发明的详细技术及较佳实施态样，将描述于以下内容中，以供本领域技术人员据以明了本发明的特征。
第IA图所示为；兰屿公猪全血细胞抹片。第IB图所示为；兰屿公猪施打GCSF之后全血细胞抹片。第IC图所示为；兰屿公猪全血液之白血球含量。第ID图所示为；兰屿公猪施打GCSF后全血液的白血球含量。第IE图所示为；兰屿公猪施打GCSF后，血液中之中间型细胞(MXD)较施打前增加6. 9 倍。第2A图所示为；兰屿公猪全血细胞进行细胞特性(⑶34)分析，圈选区域(Pl)为中间型细胞。第2B图所示为；兰屿公猪施打GCSF后全血细胞进行细胞特性(⑶34)分析，圈选区域(PD为中间型细胞。第2C图所示为；为图2A的分析结果，表示CD34干细胞占所有中间型细胞的20%。第2D图所示为；为图2B的分析结果，表示⑶34干细胞占所有中间型细胞的37%，显示施打GCSF后能增加17%⑶34干细胞比例。第3图所示为；干细胞施行方式示意图。进针角度与表皮呈15度，进针深度为0. 3公分，施打部位为真皮层组织。第4A图所示为；兰屿公猪施打GCSF后，中间型细胞以荧光染剂进行标定。左图为可见光视野下的细胞型态，右图为荧光显微镜下的细胞型态。弟4B图所不为；图4A之标定细胞以图3的方式打入90月龄的兰ill与母猪，一周后取下组织以荧光显微镜观察(右图)并比较组织型态(左图)，显示施打后一周，细胞聚集在毛囊并散布于真皮层。弟4C图所不为；图4A之标定细胞以图3之方式打入90月龄的兰ill与母猪，_■周后取下组织以荧光显微镜观察(右图)并比较组织型态(左图)，显示施打后二周，细胞聚集在毛囊及表皮层并散布于真皮层。第5A图所示为；比较施打前后90月龄的兰屿母猪皮肤结构变化。施打前的皮肤(图中)，表皮层皱折明显，皮肤结构松散排列不均。施打后(图右)，表皮层细致，皮肤坚实度与丰满度获得改善。5月龄的小猪皮肤(图左)，作为年轻肤质对照组。第5B图所示为；图5A各皮层量化的结果。*#:p〈0. 001第6A图所示为；免疫组织化学染色分析施打前后90月龄的兰屿母猪皮肤。利用特定抗原分析胶原蛋白(Collagen)、皮肤弹性(Elastin)、皮肤保水性(Polysaccharides)、消除疤痕(HA，⑶44)等能力。第6B图所示为；图6A的量化结果。显示施打干细胞后的90月龄兰屿母猪皮肤，显著改善a)胶原蛋白耗损；b)改善皮肤坚实度/丰满度；c)改善皮肤保水性；d)减少/预防线纹及皱纹。
具体实施例方式现以下列具体实施态样以进一步例示说明本发明。其中该些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明之范畴。[实施例I]如下文般进行实验设计以拉丁方格设计(Latin square design)实验法(Kirk, 1995),规划实验群组。以对抗平衡(counterbalancing)原理来进行处理实验顺序的问题(表一)。[实施例2]如下文般进行猪种圈养总共购置一只兰屿公猪(五个月龄)、三只兰屿母猪(年龄分别为六年、七年、九年)。每只猪皆附有血统登录证明书与生产履历，圈养的猪皆为个别饲养提供猪足够的活动空间，区分饲料、休息、粪便三区，猪舍水泥地面上有高架式条状地板，墙边富有自动给水装置。圈养棚内没有尖锐的突出物，属于非密闭式饲养空间，让猪可看、闻、听和接触外界。全采用最少病原等级之试验动物管理方式饲养，每日提供两次限量饲料，每月广2次轮替药 品给予清洁消毒。[实施例3]如下文般进行周边血液干细胞收集周边血液干细胞是经由血液分离机取得。在分离前五天起，于耳静脉注射一剂白血球生长激素(GCSF) 300 ii g/0. 7ml (Filgrastim M300)，直到最后收集日的前一天为止，将骨髓中的造血干细胞快速释放于周边血液中以便收集。采用颈静脉抽血，缓慢摇晃与抗凝剂混匀，以1800g离心15分钟后，以700g离心5分钟，分离出富含白血球的白血球层细胞(buffy coat)。[实施例4]如下文般进行流式细胞仪分析采用颈静脉抽血,取一管血液(BD Vacuta iner CPTTM Tube)缓慢摇晃与抗凝剂混合均匀，以1800g离心15分钟后，以700g离心5分钟后，以IOOg离心10分钟三次，分离出富含白血球的白血球层细胞，以4°C IX PBS稀释成I X 106个细胞后，取100 ill细胞液；加入2 u I anti-CD34Ab，放置4°C冰箱30分钟；以4°C IX PBS清洗三次，每次以400g离心5分钟;加入I ii I突光标记的二级抗体(AlexaFllior 546nm donkey anti-rabbitIgG, invitrogen)溶于 200 u I 3%BSA/PBS,存放于 4°C冰箱 30 分钟；以 4°C IX PBS 清洗三次，每次以400g离心5分钟；取出离心后的细胞存放于4°C冰箱并且要避光；上机(BDLSRTM II flow cytometer)分析血液内 CD 34 表现量。[实施例5]如下文般进行皮肤组织处理及切片取样部位先用电动剃毛刀将皮肤毛发剃除，再以75%酒精消毒手术部位，轻轻用 解剖刀割取约I公分大小正方的皮肤组织，深度约8mm，可见脂肪层为主。将取样后之样品以10%福马林(neutral buffered formal in; Surgipath)作为固定液浸泡组织，使组织的蛋白质凝固保持原始状态，移至组织脱水机(Leica TP1020)进行脱水。首先将含有组织的包埋盒(casette)，放入组织脱水机中依序将组织作固定、脱水、清洗及浸润(灌蜡)之处理，处理后组织中的水份将会被石蜡(paraffin)所取代。其处理之过程为10%福马林I小时(固定)，二次水30分中(浸洗)，80%酒精I小时(脱水)，95%酒精I小时(脱水)，95%酒精I小时(脱水)，100%酒精I小时(脱水)，100%酒精I小时(脱水)，100%酒精2小时(脱水)，二甲苯(Xylene)I小时(清洗)，二甲苯2小时(清洗)，石蜡I小时(浸润)，石蜡2小时(浸润)。将脱水完成的组织进行石腊包埋(tissue block system TBS 88;Medite)成石腊块(paraffin block)后，以手摇式石腊切片机(Shandon AS325; Leica, Germany)进行组织切片，每片厚度为3飞ym。[实施例6]如下文般进行皮肤组织染色 5. I 苏木紫及伊红染色(Hema toxylin-eosin Stain)核酸带负电，与带正电碱性染料(苏木紫染液)的亲和力较强，而细胞浆则相反，含有碱性物质因而与带正电酸性染料(伊红染液)的亲和力较大。因此，细胞核被染成紫蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维等染成不同程度的红色，红细胞则呈橙红色。染色步骤如下将皮肤组织切片(5 y m/section)，放置55°C烤30分钟，二甲苯脱蜡后以酒精使组织回水(rehydration)，以 hematoxylin solution (Sigma, MS-16)染色 2 分钟，再以水流冲洗15分钟。接着以eosin Y(Sigma, E4382)染色I分钟，再以水流冲洗15分钟。最后以酒精脱水后以封片胶封片。于抽风柜干燥一天后在显微镜下观察结果并以CCD数位照相统(OLYMPUS, DP70)照相存盘。5. 2梅生三色染色/胶质纤维染色(Masson ' s trichrome Stain)组织化学染色的一种，主要用以区别胶原纤维。在酸性环境，对胶原纤维、肌肉纤维有选择性染色。胶原纤维经酸处理后使Biobrich Scarlet由胶原渗出而被苯胺蓝(aniline blue)染色,呈现蓝色。染色步骤如下将皮肤组织切片(5 ii m/section),放55°C烤30分钟,Xylene脱腊后以酒精使组织回水(rehydration),以媒染剂(Mordant)浸泡30分钟，再以Carrazi ' s hematoxylin solution染色40分钟。完成后以水流冲片冲洗10分钟，0.75% Orange Gsolution染色 I 分钟后，以 1%冰醋酸洗两次,Masson B stain solution染色10分钟，以1%冰醋酸洗两次，2. 5%憐钥酸-憐鹤酸(Phosphomolybdic-Phosphotungstic acid) 10分钟，以1%冰醋酸洗两次，以苯胺蓝(anilinblue)染色15分钟，浸泡1%冰醋酸两次后以酒精脱水后以封片胶封片。于抽风柜干燥一天后以显微镜观察并以CCD数位照相统(OLYMPUS，DP70)照相存盘。5. 3 弹性蛋白染色(Elastic Stain (Modified Verhoff' s))用于区别弹性蛋白之染色法，弹性蛋白呈现蓝黑色。染色步骤如下将皮肤组织切片(3 y m/section)，放置55 °C烤30分钟，Xylene脱蜡后以酒精使组织回水(rehydration),以活化的弹性蛋白染色溶液(working elastic stain solution)染色 15分钟，流水冲洗后，以 2%Ferric Chloride Differentiating Solution 染色 20 秒,流水冲洗后，以 5%Sodium Thiosulfate Solution 染色 I 分钟，流水冲洗后，以 Van Gieson ' sSolution染色3分钟，以酒精脱水后以封片胶封片。于抽风柜干燥一天后以显微镜观察并 以CXD数位照相统(OLYMPUS，DP70)照相存档。5. 4 黏液素胭脂红染色(Mucicarmine Stain (Modified Southgate’s))对黏液素(mucine)具专一性之染色法，黏液素由上皮细胞与结缔组织细胞分泌。carmine (胭脂红)与招染媒(氯化招)剂形成carmine-Al,与带负电荷的硫酸基、羧基结合而呈红色。染色步骤如下将皮肤组织切片(5 y m/section)，放置55°C烤片30分钟，Xylene脱腊后以酒精使组织回水(rehydration),以二次水冲洗，以hematoxylin染色3分钟，流水冲洗2分钟，以Bluing Reagent染色30秒,浸泡二次水，以活化的Mucicarminesolution (33%Mucicarmine)染色I小时，快速以流水冲洗后浸泡于二次水，以Tartrazinesolution染色I分钟,快速以流水冲洗后浸泡于二次水，以酒精脱水后以封片胶封片。于抽风柜干燥一天后在显微镜下观察结果并以CCD数位照相统(OLYMPUS，DP70)照相存档。5. 6 免疫组织化学染色(Immunhistochemistry, IHC)主要利用免疫组织突光染色(Immunofluorescence, IF)侦测组织中特殊抗原表现。染色步骤如下将皮肤组织切片(3 u m/section)，放置55°C烤片30分钟，Xylene脱蜡后以酒精使组织回水(rehydration),以 antigen retrieval buffer 加热 121°C 10 分钟，以DAKO pen (厌水笔)将组织区域圈住，取3%双氧水(H202)于IXPBS溶液中室温下浸泡组织10分钟，除去内生性还原酶的活性,清洗液rinse buffer (IX PBS+0. 3%TritonX-100)清洗一次，再以5%FBS于IX PBS中处理组织室温30分钟，阻断抗体非专一性的键结，以清洗液 rinse buffer (IX PBS+0. 05%TritonX-100)清洗一次，加入适当稀释(I: 100 1:200) —级抗体(hyaluronic acid、Q)44; Abeam),于室温下作用2小时或4°C隔夜，以清洗液rinsebuffer (IX PBS+0. 05%TritonX-100)清洗3次；加入适当稀释之二级抗体(1:5000)，于室温下作用I小时，以清洗液rinse buffer (1XPBS+0. 05%TritonX-100)清洗3次；加入DAB呈色剂(3，3’-Diaminobenzidine) (LSAB2 Kit, DAK0, CA, USA)呈色 10 分钟。阳性反应呈红棕色，若未有颜色出现即为阴性(negative)结果，以hematoxyline染I分钟做对比染色(counter stain),洗去过多之hematoxyline,再以自来水浸泡10分钟，以酒精脱水后以封片胶封片。于抽风柜干燥后在显微镜下观察结果并以CCD数位照相统(OLYMPUS，DP70)照相存档。[实施例7]如下文般进行统计分析三只兰屿母猪中，每群组的实验分析结果以平均值土标准差(mean土SD)之形式表示。常态分布之资料采用Student’s t-test分布实验资料相异性的意义；非常态分布的资料采用Mann-Whitney U test分析实验资料的相关性。统计结果之p值〈0. 05视为有统计上的意义。
上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺之人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。因此，本发明的权利保护范围应如后述的申请专利范围所列。
权利要求
1.一种用于改善皮肤美观的组合物，其特征在于该组合物包括有效量之至少一种来源的⑶34干细胞所成的组群。
2.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该⑶34干细胞含量为约IO5至约109。
3.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该CD34干细胞含量为以该组合物总量计之约IO4至约IO80
4.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该CD34干细胞含量为以该组合物总量计之约IO3至约IO70
5.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该CD34干细胞含量为以该组合物总量计之约IO2或更少。
6.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该组合物为适于施用在皮肤的局部施用组合物。
7.根据权利要求I所述的组合物，其特征在于该组合物进一步包括美容上可接受的载具。
8.根据权利要求I所述的组合物，其中该组成物进一步包括至少一选自于包括胶原蛋白、玻尿酸以及其混合物。
9.一种淡化皮肤皱纹的方法，包括将有效量的根据权利要求8所述的组合物局部施用于皮肤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该至少一种活性萃取物含量为以该组合物总重量计的约0. 001重量％至约20重量％。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该至少一种活性萃取物含量为以该组合物总重量计的约0. 05重量％至约10重量％。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该至少一种活性萃取物含量为以该组合物总重量计的约0. 5重量％至约5重量％。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该有效量CD34干细胞含量为该组合物量之约IO5至约109，且有效治疗下述之一者或多者之量a)减少/预防线纹及皱纹；b)增加皮肤新陈代谢 '及c)减少皮肤变色作用。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于该有效量为该组合物重量的约0.001重量％至约20重量％，且有效治疗下述的一个或多个的量a)减少或预防胶原蛋白耗损；b)改善皮肤坚实度/丰满度；c)改善皮肤结构；d)减少/预防线纹及皱纹；e)改善皮肤色调； f)增加皮肤新陈代谢。
全文摘要
一种用于改善皮肤老化外观的医药组合物，其包含一有效量的活细胞成分，该活细胞成分选自以下群组具表面抗原CD34的有核细胞，其医药上可来自骨髓、周边血液。
文档编号A61Q19/08GK102743412SQ20121020417
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者林欣荣, 林珀丞, 邱紫文, 韩鸿志 申请人:颖奕生医科技股份有限公司