专利名称：：维持胚胎干细胞多能性的化合物的制作方法维持胚胎干细胞多能性的化合物相关专利的交叉参考发明领域本申请要求于2005年6月10日提交的临时专利申请序号为60/689,359的美国申请的优先权。该申请的全部内容在这里被整体引入作为参考并用于所有目的。发明背景本发明涉及用于培养胚胎干细胞(ES)的方法和组合物。所述方法涉及在无血清条件下、在没有饲养细胞和LIF时，在维持细胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES细胞生长。这些方法部分地促进胚胎干细胞生产中更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。发明背景胚胎干细胞4艮难维持培养，因为它们倾向于自发地分化(即，获得特化的结构和/或功能特点)。干细胞分化是由于许多因素，包括生长因子、细胞外基质的分子和成分、环境应激源以及直接的细胞间相互作用造成的。保持在增殖、未分化阶段的小鼠或人胚胎干细胞的逐代培养，是一个包括将细胞在补充了胎牛血清的生长培养基中和有时在未分裂细胞的詞养层上进行培养的多步骤的过程。如果向培养基中加入细胞因子一一白血病抑制因子(LIF),小鼠的胚胎干细胞可以在体外在没有饲养细胞的情况下生长，但是其仅在中到高细胞密度下有效并且来自单细胞的集落形成需要血清或者饲养层的存在。另外，对于人类胚胎千细胞而言，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。本发明提供了在不使用LIF的无血清的培养条件下使用小分子使胚胎干细胞自我更新的方法。使用本发明的小分子来维持胚胎干细胞的多能性可使胚胎干细胞的生产有更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。发明概述本发明一方面提供了维持多能干细胞的方法，包括在a)基础培养基;和b)式I的化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、受保护的衍生物、单个异构体和异构体混合物、以及可药用的盐和溶剂化物(例如水合物)中使细胞生长的步骤<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R,选自氢、Cw烷基、Qs-6链烯基、Cwo芳基-C(M烷基、<:5_1()杂芳基-(:0.4烷基、Cwo环烷基-Co-4烷基和C3-K)杂环烷基-C(M烷基；其中R，的任何烷基或链烯基任选地被一到三个独立地选自卣素、羟基、Cw烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R,的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被一到三个选自卣素、羟基、氰基、d-6烷基、d-6烷氧基、Cw链烯基、卣代烷基、卤代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(0)NR2R3、-XNR2C(0)XOR2、-XNR2C(0)NR2R3、-XNR2XNR2R3、XC(0)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(=NR2)NR2R3、-XS(O)。2R4、-XNR2C(0)R2、-XNR2C(0)XNR2R3、-XNR2C(0)R4、-XC(0)R4、-XR4、-XC(0)OR3和-XS(0)o-2NR2R3的基团所取代；其中X是键或CL4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、d—6烷基和<:3.12环烷基；且R4是任选地一皮1到3个选自d—6烷基、—XNR2R3、—XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的Cwo杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述o发明详述定义"烷基"作为一个基团和作为其它基团例如囟代烷基和烷氧基的结构元素，可以是直链或支链的。Cw烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卣代烷基包括三氟曱基、五氟乙基等。"芳基，，是指包含6到IO个碳原子的单环或稠合的二环芳环。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。"亚芳基"是指衍生自芳基基团的二价基团。"杂芳基，，被定义为其中一个或多个环原子是杂原子的芳基。例如杂芳基包括吡咬基、吲哚基、p引哇基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并1，3二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧咬基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。"环烷基"是指包含指定环原子数的饱和或部分不饱和的、单环、稠合二环或桥接的多环环系统。例如，QMo环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。杂环烷基是指如本申请中所定义的环烷基，条件是一个或多个所述环碳被选自-O-、-N=、-NR-、-C(O)-、-S-、-8(0)-或-8(0)2-的部分所替代，其中R是氢、Cw烷基或氮保护基团。例如，在本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌咬基、哌啶酮、2-氧代-吡咯-l-基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5〗癸-8-基等。"卣素"(或鹵代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。"治疗"是指减轻或緩解疾病和/或其伴随症状的方法。优选的实施方案的说明本发明涉及培养ES细胞的方法和组合物。所述方法涉及在没有饲养细胞和LIF的无血清条件下，在维持该细胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES细胞生长。在一个实施方案中，关于式I的化合物Ri选自氢、Cw烷基、Cw链烯基、Cw()芳基-C()-4烷基、Cwo杂芳基-C(M烷基、C3.H)环烷基-C。.4烷基和C3.n)杂环烷基-Co.4烷基；其中R,的任何烷基或链烯基任选地被一至三个独立地选自闺素、羟基、C"烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R,的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被一至三个选自卤素、羟基、氰基、Cw烷基、d—6烷氧基、<:2.6链烯基、面代烷基、卤代烷氧基、—XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0.2R3、—XC(0)NR2R3、—XNR2C(0)XOR2、-XNR2C(0)NR2R3、-XNR2XNR2R3、—XC(0)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、—XNR2C(=NR2)NR2R3、—XS(O)02R4、—XNR2C(0)R2、-XNR2C(0)XNR2R3、—XNR2C(0)R4、—XC(0)R4、—XR4、—XC(0)0R3和一XS(0)o-2NR2R3的基团取代;其中X是鍵或(^4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、d，6烷基和Cw2环烷基；且R4是任选地净皮1至3个选自Cw烷基、—XNR2R3、—XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的Cwo杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述。在另一个实施方案中，R,选自氢、甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、嘧淀基、3-羟基-l-甲基-丙基、羟基-乙基、苯基、吗啉代、苯甲基1，2，4三唑-4-基、烯丙基、2-曱基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-乙基、哌溱基-乙基、哌唤基-丙基、噻唑基、噁唑基、吡啶基、吡唑基、哌咬基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-甲基、吗啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[l，2，4I三嗪-3-基、[1，3，4噻二唑基；其中任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被l至3个独立地选自甲基、乙基、氰基、羟基、甲氧基、氨基-羰基-氨基、羟基-甲基、曱基-哌嗪基、曱基-哌溱基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌噪基-曱基、吗啉代-磺酰基、曱基-旅唤基-磺酰基、甲基-哌嚷基-羰基-氨基、曱基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羟基-乙基、羟基-甲基-羰基-氨基、曱酰基-氨基、二甲基-氨基、二曱基-氨基-曱基、二曱基-氨基-乙基、异丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、曱基-氨基-乙基、吗啉代-乙基、吗啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟代、吗啉代、二甲基-氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二曱氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-l-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基团所取代。本发明优选的化合物选自N-{3-[7-(2-乙基-2H-吡唑-3-基氨基)-l-甲基-2画氧代-1，4-二氢-211-嘧啶并14，5-(1嘧啶-3-基1-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{4-曱基-3-[1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氢—2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基I-苯基)-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(2，6-二曱基-吡啶-4-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-211-嘧啶并[4，5-(1嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；1\-{3-[7-(3-羟基-苯基氨基)-1-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dj嘧啶-3-基卜4-甲基-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；？H3-[7-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l,4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基卜4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基卜4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-7-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧咬-3-基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-[4-曱基-3-(1-甲基-7-曱氨基-2-氧代-l,4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟曱基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟曱基-苯甲酰胺。另外优选的式I化合物详见于以下实施例和表1。用途ES细胞来源于植入前的胚胎并保留了胎儿的生成细胞的发育潜能，能够在体外和体内产生所有三个胚层的细胞和组织类型。ES细胞可被视为每次分裂时必须在自我更新(多能性)或可选择的分化之间进行选择的细胞。控制选择分化路径的信号由细胞微环境中的生长因子提供。生长因子可来自血清或由饲养细胞产生。鉴别这些生长因子和限定它们各自的输入是了解由干细胞介导的组织增殖、转化、修复的发育和生理学上调控的关键。而且，将这些知识扩展到控制离体干细^1的扩增和分化上可保持在再生医学和生物制药发明中的应用前景。小鼠ES细胞最初分离并联合培养在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。成纤维细胞饲养层的必要功能是提供细胞因子一一白血病抑制因子(LIF)。LIF缺失的成纤维细胞在支持自我更新上是有缺陷的且LIF可取代小鼠ES细胞常规增殖与重新诱导中对饲养细胞的需求。LIF与连接gpl30受体的相关细胞因子提供了唯一的在分子水平上限定的维持小鼠ES细胞长期自我更新性的途径，该ES细胞保留了未分化表型、多能性和胚胎增殖能力的基本特性。ES细胞可在添加LIF的商品化的血清代用品中增殖，但是这仅在中至高细胞密度时有效且从单细胞到集落形成需要血清或祠养层存在。而且，对于人ES细胞，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。本发明的方法支持了在无饲养细胞和LIF的无血清条件下培养多能干细胞。本发明的化合物通过它们与ERK1和RasGAP间的相互作用影响小鼠ES细胞的自我更新。例如，持续的ERK1/2活化导致神经元分化，同时抑制RasGAP可激活通过Ras或Ras类的GTP酶信号通路，其可依次通过P13K或其它信号通路增强自我更新。骨形态生成蛋白(BMP)作为包含在血清中的或由饲养层提供的因子也被涉及，其协同LIF在体外维持未分化的小鼠ES细胞。目前的研究表明BMP可通过激活Smad通路和诱导Id基因的表达而替代ES细胞培养中对血清和饲养细胞的需求，Id基因是一种Smad信号通路的共有靶点，其通过负调节碱性的螺旋-环_螺旋蛋白质阻断分化。尽管BMP促进ES细胞的自我更新性的确切机制尚未确定，最近的研究表明它也可能抑制不依赖Smads的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。重要的是，对p38MAPK的抑制促进缺乏Alk-3(BMPRIA)的胚泡产生ES细胞，且ES细胞可以从缺乏Smad4(所有Smad的共同配偶体)的胚泡中产生，支持了BMP通过基于存在或不存在血清或饲养细胞的不同机制来起作用的假说。考虑到血清和饲养细胞提供细胞存活信号(其表现为生长因子与细胞因子)的可能性和外部的存活信号在低细胞密度环境中(此时来自自分泌和旁分泌因子的刺激作用最小)尤为重要，ES细胞在较差的培养条件下(即，在无血清和饲养细胞条件下)有可能出现细胞凋亡。在低细胞密度下，ES细胞很少产生多能性的集落。为分析单个细胞因子、生长因子以及其它分子对ES细胞自我更新和分化的作用，最好能够保护细胞免于在无血清和无伺养细胞条件下细胞凋亡。虽然使用添加了N2和B27的培养基在无血清和无饲养条件下扩增ES细胞改善了生存力，并因此使其甚至在低细胞密度条件下存活，但LIF加上这些添加物仍不能支持ES细胞的自我更新，除非培养基更进一步地补充BMP。因为N2和B27添加物包含激素(皮质酮、黄体酮和T3)与视黄醇乙酸酯(视黄酸的前体)并且这些组分中的部分用于ES细胞分化方案，它们的存在使对单个细胞因子、生长因子以及其它分子对ES细胞自我更新和分化作用的分析复杂化。因此，开发在无血清培养条件下用于ES细胞自我更新的小分子，如本发明所述，将使ES细胞的生产具有更强的一致性，提供了在研究领域和再生医学领域中的ES细胞实际应用的新途径。另外，开发在无血清培养条件下用于ES细胞自我更新的小分子，如本发明所述，对于限定ES细胞培养环境从而提供自我更新或分化的信号输入的限定和控制是必要的。多能性的机制也可有助于我们对肿瘤发生的理解(多能干细胞可在体内形成肿瘤，而且在"sternness"基因上的分子改变也可导致肿瘤)。此夕卜，有越来越多的证据表明干细胞与肿瘤细胞间的近亲关系正常干细胞与肿瘤细胞自我更新的机制相似；涉及干细胞自我更新的发育信号通路的失控与肿瘤生成有关；肿瘤包括可能源自正常干细胞的"癌症干细胞"。制备本发明化合物的方法本发明也包括制备本发明化合物的方法。在所述的反应中，保护活性官能团是必需的，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基基团，在希望其存在于终产物的情况下，避免它们不必要地参与反应。常规的保护基团可以按照标准规程使用，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wutsin"有机化学中的保护基团"，JohnWileyandSons,1991。式I化合物可按下述反应方案I的程序制备其中W如发明概述中式I所定义。式I化合物可通过4吏用合适的酰基活化剂(例如，HATU)在合适的碱(例如DIEA等)和适宜溶剂(例如，DMF)存在下将式2化合物与式3化合物偶合来制备，反应可能需3小时完成。式I化合物可按下述反应方案II的程序制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中A如发明概述中式I所定义。式I化合物可通过将式4化合物与合适的胺在不存在或存在适宜溶剂(例如，AcOH-水)的条件下反应来制备。式I化合物也可通过将式4化合z-c物与合适的胺在升高的温度下于加有对-曱苯磺酸的合适溶剂(例如，l-丁醇)中进行反应来制备。或者，式I化合物可通过将式4化合物与式RiH的化合物按三种反应方法进行制备。对于杂芳基胺或芳基胺，反应在适当的催化剂(例如Pd(II)盐等)与适当的溶剂(例如，1，4-二噍烷，或其类似物)存在下、在温度约80至约150'C之间进行，可能需约20小时完成。烷基胺取代的反应条件包括在适当的溶剂(例如，DMSO、DMF等)中将式4化合物与5-10当量的胺进行加热。对于式4化合物与芳基胺的缩合，这些反应在酸(例如TsOH、HOAc、HCl等)存在下于合适溶剂(例如DMSO、DMF、乙醇等)中进行。式I化合物合成的详细实例可见于下文的实施例。制备本发明化合物的其它方法本发明的化合物可通过将游离碱形式的化合物与可药用的无机或有机酸反应制备成可药用的酸加成盐。或者，本发明化合物的可药用的碱加成盐可通过将该化合物的游离酸形式与可药用的无机或有机碱反应制备。或者，本发明化合物的盐形式可用原料或中间体的盐制备。本发明化合物的游离酸或游离碱形式可分别从相应的碱加成盐或酸加成盐制备。例如酸加成盐形式的本发明化合物通过用适当的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠，等等)处理可转化为相应的游离碱。本发明化合物的碱加成盐形式通过用适当的酸(例如，盐酸等)处理可转化为相应的游离酸。本发明化合物的非氧化形式可在0至80°C下于合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二喁烷水溶液等)中通过用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、氢硼化锂、氢化硼钠、三氯化磷、三溴化物，等等)处理本发明化合物的N-氧化物来制备。本发明化合物的前体药物衍生物可通过本领域普通技术人员所知方法(例如，对于更多的细节可参见Saulnier等人(1994)，BioorganicandMedicinalChemistryLetters,Vol.4，p.1985)进行制备。例如，适宜的前体药物可通过将非衍生的本发明的化合物与合适的氨基曱酰化试剂(例如，l，l-酰氧基烷基碳酰氯(l，l-acyloxyalkylcarbanochloridate)、对-硝基苯基碳酸酯，等等)反应来制备。本发明化合物受保护的衍生物可通过本领域普通技术人员所知方法进行制备。适用于产生和去除保护基团的技术的详细说明可见于T.W.Greene,"有机化学中的保护基团"，第3版，JohnWileyandSons,Inc.,1999。如水合物)。本发明化合物的水合物可通过从水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备，所用有机溶剂如二悉英、四氢呋喃或曱醇。反应形成一对非对映异构的化合物、分离该非对映异构体并且回收光学纯的对映异构体体制备成其单个立体异构体。当对映异构体的拆分可使用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来实现时，优选易分离的混合物(例如，结晶的非对映异构体的盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并可通过利用这些差异而容易地分离。非对映异构体可通过色镨，或优选地，通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离。随后通过任何不会导致消旋作用的操作方法将光学纯的对映异构体与拆分试剂一起进行回收。适用于从其外消旋混合物中拆分立体异构体的4支术的更详细i兌明可见于JeanJacques,AndreCollet,SamuelH.Wilen，"对映异构体，外消旋物和拆分"，JohnWileyAndSons,Inc.,1981.概括地说，式I化合物可通过下述方法进行制备，其包括(a)反应方案I和II的那些反应；和(b)任选地将本发明的化合物转化为可药用盐；(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；(d)任选地将本发明化合物的非氧化形式转化为可药用的N-氧化物；(e)任选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化为其非氧化形式；(f)任选地从本发明化合物异构体的混合物中拆分单个异构体；(g)任选地将本发明的非衍生化合物转化为可药用的前体药物衍生物；和(h)任选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化为其非衍生形式。在没有明确描述原料的制备的情况下，所述化合物为已知或可通过本领域类似的已知方法或如下文实施例中所公开的方法进行制备。本领域的技术人员应当理解上述转化仅仅是本发明化合物制备方法的代表，可类似地使用其它熟知方法。通过下述实例进一步例证本发明的式I化合物的制备(实施例)，但并不限制本发明的范围。实施例1N誦(3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟甲基-苯曱酰胺将5-溴-2，4-二氯-嘧啶(2.41g，10.6mmol)在约-20。C下用甲胺(8M在乙醇中，3.3mL)在四氢呋喃(15mL)中緩慢地进行处理。在约-20。C下搅拌30分钟后，将反应混合物分配在CHCl3和饱和NaHC03之间。水层用另外的CHCl3萃取两次并将合并的有机层用MgS04干燥，过滤和浓缩。粗产物经柱色镨法(Si02，乙酸乙酯/己烷=3/7)纯化以得到1.76g(75。/o)白色固体状的(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺。将(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺(3.75g，16.9mmo1)、三(二苯亚甲基丙酮)二把(0)(388mg，0.4mmol)和三-2-呋喃基膦(777mg，3.3mmol)在DMF中的混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入三丁基乙烯基锡(5.93mL,实施例20.3mmol)。在大约65"C搅拌16小时后，将反应混合物冷却至室温并与10%氟化钾水溶液(800mL)和乙醚(600mL)—起搅拌1小时，之后通过一层Celite过滤。用另外一部分乙醚(200mL)冲洗Celite。分离水层并用CHC13萃取。合并的有机萃取物用MgS04干燥并减压浓缩以产生粗的油状物，其通过快速柱色i普(Si02,乙酸乙酯/己烷=1/4)纯化以提供白色固体状的(2-氯-5誦乙烯基-嗜啶-4-基)-曱胺(2.63g，92%)。将(2-氯-5-乙烯基-嘧啶-4-基)-甲胺(2,50g，14.7mmol)在CHCl3/MeOH(15mL/15mL)中的溶液用臭氧鼓泡30分钟，然后在-78'C下通过氩气流3分钟。使反应混合物加温至室温并用二甲基硫醚(3.24mL，44.1mmol)处理。反应混合物减压浓缩得到无色油，其通过快速柱色谱(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/3)经硅胶纯化得到白色固体状的2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-曱醛(2.40g，95%)。将2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-曱醛(1.08g,6.3mmol)和7V-(3-氨基-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基苯甲酰胺(2.04g，6.9mmol)在甲醇(70mL)中的溶液在45。C下搅拌2小时，然后先后用氰基硼氢化钠(1.19g，18.9mmol)和醋酸(1mL)处理。在室温下搅拌2小时后，反应混合物用CHCl3稀释并用饱和NaHC03洗涤。有机层用MgS04干燥并减压浓缩。残余物用快速柱色谱(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/2)纯化得到白色固体状的A43-[(2-氯-4-曱氨基嘧吱-5-基甲基)氨基j-4-曱基苯基l3-三氟曱基苯甲酰胺(1.80g，64%)。在O'C下向搅拌的A43-[(2-氯-4-甲氨基嘧啶-5-基甲基)氨基-4-甲基苯基)-3-三氟曱基苯曱酰胺(559mg，1.24mmol)和三乙胺(693jiL，4.97mmol)在四氢吹喃(15mL)的溶液中加入三光气(147mg，0.49mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌30分钟。滤出沉淀物并将滤液在110。C下搅拌3小时。然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用饱和NaHC03洗涤。有机层用MgS04干燥并在减压下浓缩得到粗的油状物，其通过快速柱色谱(Si02，乙酸乙酯/己烷=1/2)纯化得到白色固体状的7V-[3-(7-氯-2-氧代一l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-曱苯基]-3-三氟曱基苯曱酰胺(420mg，71%)。将iV-[3-(7-氯-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基)-4-甲基苯基-3-三氟甲基苯甲酰胺(35.0mg，73.6mmol)和苯二胺(79.5mg，736mmo1)的混合物在IOO'C搅拌1小时。将混合物冷却至室温并混悬于甲醇中。收集沉淀物并用甲醇洗涤得到白色固体状的A^3-[7-(3-氨基-苯氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基l-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基-苯曱酰胺(34mg,84%);&NMR400MHz(DMSO陽^j)69.22(s，1H),8.29(s，1H)，8.25(d,1H),8.10(s，1H)，7.95(d，1H)，7.78-7.76(m，2H)，7.62(dd，1H)，7.30(d，1H)，7.05(d，1H)，6.88(d,1H),6.87(s,1H),6.17(dd，1H)，4.92(s，2H)，4.67(d，1H)，4.49(d,1H)，3.33(s，3H),2.12(s，3H);MSm/z548.3(M+1)。实施例27V-[4-曱基-3-(1-甲基-7-曱氨基-2，4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟曱基-苯甲酰胺在0。C下将7NNH3(13.9mL)在曱醇中的溶液加入4-氯-2-曱硫基-5-嘧啶曱酸乙酯(4.50g，19.4mmol)在甲醇中的搅拌的溶液中，并将混合物在室温搅拌2小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释并用饱和NaHC03溶液洗涤。有机层通过MgS04干燥，过滤和浓缩。粗产物从乙酸乙酯与己烷的混合溶剂中结晶得到2.90g(66%)白色固体状的4-氨基-2-曱硫基-5-嘧啶甲酸乙酉旨。向搅拌的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸乙酯(2.79g，13.1mmol)的溶液中加入4NNaOH(3.9mL)并将混合物在60。C搅拌3小时。浓缩反应混合物可定量地得到钠盐形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸盐。向钠盐形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸(1.28g，6.2mmol)、7V-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯曱酰胺(1.82g,6.2mmol)和DIEA(3.22mL，18.5mmol)在DMF的溶液中加入HATU(2.82g,7.42mmo1)，并将混合物在室温下搅拌1小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释并用5%Na2S203的水溶液、饱和NaHC03的水溶液和盐水洗涤。有机层通过MgS04干燥并减压浓缩。粗产物从甲醇中结晶得到白色固体状的4-氨基-2-曱硫基-嘧啶-5-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯曱酰基氨基)-苯基卜酰胺(l.79g，61%)。在0。C下向搅拌的4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-曱酸[2-甲基-5-(3-三氟曱基-苯甲酰基氨基)-苯基卜酰胺(286mg，0.62mmol)和二异丙基乙胺(864jiL，4.96mmol)在二嗜、烷(10mL)中的溶液中加入三光气(184mg，0.62mmol)的二、嗯烷溶液(2mL)，并将混合物在100。C搅拌12小时。反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用饱和NaHC03溶液洗涤。将有机层用MgS04干燥，过滤，减压浓缩，从曱醇中结晶得到白色固体状的iV-[4-甲基-3-(7-曱硫基-2，4-二氧代-1，4-二氢-211-嘧啶并4，5-(11嘧啶-3-基)-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺(166mg，55%)。在0°C下将7V-[4-曱基-3-(7-曱巯基-2，4-二氧-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧咬-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(218mg，0.45mmol)加入NaH(在矿物油中60%的分散液，19.7mg，0.49mmol)在DMF的混悬液中。当停止产生Bb时，加入碘曱烷(84ftl，1.35mmol)并将反应混合物在室温下搅拌3小时。混合物用乙酸乙酯稀释，并用5%的Na2S203水溶液洗涤以除去DMF。有机层用MgS04干燥并减压浓缩。粗产物从曱醇中结晶得到白色固体状的7V-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲硫基-2，4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧咬-3-基)-苯基]-3-三氟曱基-苯曱酰胺(184mg，82%)。将间氯过氧苯甲酸(最高77%，97mg，44mmol)加入搅拌的7V-[4-甲基-3-(l-甲基-7-甲硫基-2,4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dj嘧啶-3-基)-苯基-3-三氟甲基-苯曱酰胺(184mg，0.37mmol)在DMF(4mL)和氯仿(4mL)的混合溶剂中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌1小时。混合物用氯仿稀释，并用5%的Na2S203水溶液和饱和NaHC03溶液洗涤。有机层用MgS04干燥并减压浓缩得到A43-(7-甲基亚磺酰基-l-甲基-2，4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基l-3-三氟曱基-苯甲酰胺(167mg，88%)。将Aq3-(7-甲基亚磺酰基-l-甲基-2，4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并4，5-d嘧咬-3-基)-4-曱基-苯基-3-三氟甲基-苯曱酰胺(30mg,58jimol)溶解于在四氢呋喃中的2M甲胺溶液(lmL)中，并将混合物在60。C搅拌1小时。将反应混合物浓缩，溶于DMSO中，并通过制备型LCMS纯化得到A^4-曱基-3-(l-曱基-7-甲氨基-2，4-二氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基j-3-三氟曱基-苯甲酰胺(20mg，71%);&NMR400MHz(DMSO-^)S10.70(s，1H)，8.95(s，0.33H，8.85(s，0.66H),8.39(m,3H)，8.11(d，1H)，7.93(t，1H)，7.84(m，2H)，7.49(d，1H)，3.65(d，2H)，3.58(s，1H)，3.08(m，3H)，2.17(s，3H);MSw/z485.3(M+l)。通过重复上述实施例所描述的方法，使用适宜的原料，获得了如表1所鉴定的以下的式I化合物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>结构式物理数据力画R400MHz(DMSO-rf6)和/或MS(m/z)匪R400MHz(DMSO画rf"89.64(s，lH)，9.60(d，lH)，8.29(s，lH)，8.21(d，1H),8.14(s，1H)，7.95(d，1H)，7.78(m，3H)，7.63(d，1H)，7.42(d，1H),7.31(d，1H)，7.20(t，1H)，6.77(d，lH)，4.68(d，lH)，4.53(d，lH)，3.35(s，3H)，2.97(s，3H)，2.13(s，3H);MSm/z626.3(M+l)。_醒R400MHz(DMSOO69.22(s，lH)，8,29(s,m)，8.25(d,1H)，8.10(s，1H),7.95(d，1H),7.78-7,76(m，2H)，7.62(dd，lH),7.30(d，1H)，7.05(d，1H)，6.88(d，1H)，6.87(s，1H)，6.17(dd，m)，4.92(s，2H)，4.67(d，1H)，4.49(d，1H)，3.33(s，3H)，2.12(s，3H);MSwa/z548.3(M+1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>使用饲养细胞依赖性的小鼠ES细胞系(其使用Oct4-GFP报告基因结构进行了基因工程操作并在未分化的多能性阶段表达绿色荧光蛋白(GFP)),对化合物在无饲养细胞和LIF条件下维持ES细胞未分化状态的能力进行篩选。本发明化合物在不需要LIF和饲养细胞下维持了小鼠ES细胞超过10次传代的未分化状态。多能ES细胞表达Oct4、Nanog、ALP、SSEA-1并形成致密的集落。通it^^:的集落与扁平的和/或鵝卵石样细胞的存在来指示分化。通过本发明化合物扩增的小鼠ES细胞保留了多潜能细胞的多种标记物，包括Oct-4、nanog、SSEA-1和ALP,可在体外分化为功能性的神经元和心肌细胞并且可在体内供给健康的嵌合体小鼠。通过所述的TOPflash报告基因检测法还发现本发明化合物不能激活Wnt通路,而且通过免疫印迹法发现其不能激活JAK-STAT通路。'H匪R400MHz(DMSO-A)S10.51(s，lH)，9.43(s，lH)，9.22(s，lH)，8.29(s，1H)，8，25(d,1H)，8.12(s，1H)，7.96(d,1H),7.80-7.77(m，2H)，7.62(dd，lH)，7.297.31(m，2H)，7.13(d，lH),7.02(t，lH)，6.34(d,1H)，4.68(d，lH),4.51(d，lH)，3.34(s，3H),2.12(s，3H);MSm/z549.2(M+l)'维持小鼠胚胎干细胞(mES)的自我更新在涂覆了明胶的细胞培养板上在GM中用伺养细胞维持小鼠ES细胞。小鼠ES细胞每三天用0.05Q/。胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)传代。最佳分传比是l:6。维持ES细胞及下文所述实施例4和5所用的材料包括Oct4-GFPmES细胞(饲养层依赖性的细胞)；mESRl细胞(非飼养层依赖性的细胞)；DMEM(GIBCO，11965-084);用于基因敲除的DMEM(KODMEM)(GIBCO,10829-018);DMEM/F12(GIBCO，11330-032);胎牛血清(FBS)(GIBCO，26140-079);用于基因敲除的血清替代品(KO-SR)，(GIBCO，10828-028);B-27无血清添加剂(50X)，(GIBCO17504-044);N-2添加剂(100X)(GIBCO，17502-048);LIF(106个单位)(Chemicon，ESG1106);L画谷氨酰胺(GIBCO，25030-081);非必需氨基酸(GIBCO，11140-050);2-巯基乙醇(1000X),(GIBCO，21985-023);0.05%胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，25300-054);0.1%明胶溶液(Stemcelltech.，07903);基础培养基(BM):KODMEM、15%KO-SR、IXL-谷氨酰胺、1X非必须氨基酸、IX2-巯基乙醇；以及生长培养基(GM):基础培养基+103单位的LIF。鉴定本发明化合物的筛选方法384孔板在37'C下用0.1%明胶溶液涂覆过夜。吸去明胶溶液。将Oct4-GFP小鼠ES(祠养层依赖性的)细胞在涂覆过明胶的板子上以1000个细胞/50nlGM/孔接种。培养过夜后，将培养基更换为BM并将5pM的化合物加入各孔。培养3天后，更换培养基并再次添加化合物。再过3天后，固定细胞并用荧光成像读板系统(FLIPR)进行检测。其中细胞保持GFP表达的孔被选为基础采样信号。基础采样信号经小鼠ES细胞集落形态学进行进一步验证。使用这种方法，确认本发明化合物可在无饲养层条件下维持小鼠ES细胞的自我更新。实施例3小鼠ES细胞在分化培养基O)M)中保持多能性。通过视黄酸(RA)诱导的DM:BM+0.3|iiMRA，通过FBS裔导的DM:DMEM、20%FBS。将96孔板在37tl下用0.1%的明胶溶液涂覆过夜。吸去明胶溶液。将小鼠ES细胞在涂覆过明胶的板上以104个细胞/50^11GM/孔接种。培养过夜后，将培养基更换为DM并将3|iiM的本发明化合物加入各孔。培养三天后，将培养基更换为新鲜的培养基和化合物。再培养3天后，固定细胞并利用多能性标记的表达和集落形态学进行检测。有效浓度通过GFP表达的维持和集落形态学进行测定。本发明不同化合物的有效浓度的列表^^开于下表3。实施例4无饲养层的多次传代的培养条件将六孔板用每孔0.1%的明胶lml涂覆并在37。C下孵育过夜。在除去明胶溶液后，小鼠ES细胞在每孔中以2xl05个细胞/2ml培养基进行接种。细胞每三天用0，05。/o胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)传代。最佳分传比依赖于不同的培养基(表2)。表2显示了不同的无祠养层培养条件的实例，其中本发明化合物是N-{4-甲基-3-[1-曱基-7-(2-曱基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d嘧啶-3-基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(化合物213，表l)。表2:不同的无伺养层的培养条件<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>应当理解，实施例和本文所述的实施方案仅用于说明性的目的，在此基础上，本领域技术人员可以进行各种修饰或改变并且这些修饰和改变包含于本申请的主旨和范围以及所附权利要求的范围之内。所有在此处引用的公开物、专利和专利申请均引入本文作为参考。权利要求1.一种维持多能干细胞的方法，其包括在a)基础培养基；和b)式I的化合物及其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体中使细胞生长的步骤其中R1选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-10环烷基-C0-4烷基和C3-10杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任何烷基或链烯基可任选地被一到三个独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R1的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可任选地被一到三个选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6链烯基、卤代烷基、卤代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(O)NR2R3、-XNR2C(O)XOR2、-XNR2C(O)NR2R3、-XNR2XNR2R3、-XC(O)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(＝NR2)NR2R3、-XS(O)0-2R4、-XNR2C(O)R2、-XNR2C(O)XNR2R3、-XNR2C(O)R4、-XC(O)R4、-XR4、-XC(O)OR3和-XS(O)0-2NR2R3的基团所取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基；且R4任选地被1到3个选自C1-6烷基、-XNR2R3、-XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的C3-10杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述。2.如权利要求l所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。3.如权利要求l所述的方法，其中所述细胞是人胚胎干细胞。4.如权利要求4所述的化合物，其中A选自氢、甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、嘧t基、3-羟基-l-甲基-丙基、羟基-乙基、苯基、吗啉代、苯甲基、[1，2，41三唑-4-基、烯丙基、2-甲基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-l-基)-乙基、哌溱基-乙基、哌溱基-丙基、噻唑基、噁唑基、吡咬基、吡唑基、哌咬基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-曱基、吗啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[l，2，4j三嗪-3-基、[1，3，4噻二唑基；其中任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环坑基任选地被1至3个独立地选自甲基、乙基、氰基、羟基、曱氧基、氨基-羰基-氨基、羟基-甲基、曱基-哌溱基、甲基-哌溱基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-曱基、吗啉代-磺酰基、甲基-哌嗪基-磺酰基、甲基-旅，秦基-羰基-氨基、曱基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羟基-乙基、羟基-甲基-羰基-氨基、曱酰基-氨基、二甲基-氨基、二甲基-氨基-曱基、二曱基-氨基-乙基、异丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、曱基-氨基-乙基、吗啉代-乙基、吗啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟、吗啉代、二甲基曙氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二曱氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-l-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基团所取代。5.如权利要求4所述的化合物，其选自]\-{3-[7-(2-乙基-211-处峻-3-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基I-4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-{4-曱基-3-1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基-苯基卜3-三氟甲基-苯曱酰胺；N-(3-[7-(2，6-二甲基-吡啶-4-基氨基)-l-甲基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-(1嘧啶-3-基1-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯曱酰胺；N-(3-[7-(3-羟基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基卜4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-P-[7-(3-氨基-苯基氨基)小曱基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4,5-d嘧啶-3-基-4-曱基-苯基)-3-三氟曱基-苯曱酰胺；N-{3-7-(3-曱磺酰基氨基-苯基氨基)-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基-4-甲基-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-(3-[7-(2，5-二甲基-211-吡唑-3-基氨基)-1-曱基-2-氧代-1，4-二氢-211-嘧啶并[4，5-^嘧啶-3-基]-4-曱基-苯基}-3-三氟曱基-苯甲酰胺；N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲基氨基-2-氧代-l,4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-dl嘧啶-3-基)-苯基卜3-三氟甲基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-l-曱基-2-氧代-l，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d嘧啶-3-基)-4-曱基-苯基-3-三氟甲基-苯甲酰胺。全文摘要本发明涉及用于培养胚胎干细胞(ES)的方法和组合物。所述方法涉及在无血清条件下、在没有饲养细胞和LIF时，在维持细胞的多能性/自我更新的式(I)的小分子存在下使ES细胞生长。这些方法部分地促进胚胎干细胞生产中更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。文档编号C07D487/04GK101238129SQ200680028606公开日2008年8月6日申请日期2006年6月8日优先权日2005年6月10日发明者P·G·舒尔茨,胜丁,凤闫,陈水冰申请人:Irm责任有限公司;斯克里普斯研究所