免疫偶联物剂型的制作方法

专利名称：：免疫偶联物剂型的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于制备稳定的免疫偶联物剂型的方法，该免疫偶联物是由抗体和一个或几个共价键连接的药物分子所构成的药物化合物。
背景技术：
：免疫偶联物作为用于治疗癌症和其他条件的高药效、特异性的试剂而得到开发。免疫偶联物包括特异性地识别靶细胞抗原比如肿瘤细胞抗原的抗体、和一个或几个共价键连接的药物分子，该药物分子尤其是指细胞毒素类药物比如美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉院、或CC-1065类似物。该免疫偶联物的另一名称是抗体-药物偶联物。免疫偶联物在循环期间是无活性的，但当其被细胞内在化后，会结合在靶细胞表面上。通过尚未被完全了解的机制，药物随后从抗体上释放出来，从而能发挥它们的药理学效果。细胞毒素类药物向靶细胞比如构成癌组织的细胞的靶向释放可能会提高细胞毒素类药物的治疗指数。典型地，用作免疫偶联物的细胞毒素类药物的药效是常规化疗药物的药效的1001000倍以上。该免疫偶联物的例子在国际(PCT)专利申请WO00/02587、02/060955、和02/092127、美国专利No.5，475,092、6,340,701、6,171,586、6,706,708B2、和6,756,397B2、以及Chari等，CancerRes.，52，127-131(1992)中被公开。药物化合物比如免疫偶联物通常与一种或多种药学可接受的载体、赋形剂、和/或稳定剂结合以提供可用于病人给药和可用于储运药物化合物的药物组合物。类似于其他蛋白药物，免疫偶联物易于降解比如氧化、脱酰胺、以及形成颗粒和聚集物等(Manning等，Pharm.Res.6，903-918(1989);Ahern禾卩Manning,StabilityofProteinPharmaceuticals:PartA，蛋白降解的化学和物理途径，Plenum,NewYork,(1992);以及Cleland等，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.10，307-377(1993))。在蛋白药物中形成颗粒尤其能使药物化合物不稳定，从而使剂型药效更低或甚至对临床使用是有害的。例如，注射药物剂型中的颗粒能对静脉产生显著的损害或延长病人的静脉郁血。此外，形成聚集物是蛋白药物降解的主要途径(Chari等，PharmRes.20,1325-1336(2003))，从而导致不良效果比如免疫原性。通常是疏水性的小分子药物、尤其是细胞毒素类药物与亲水性单克隆抗体的结合向免疫偶联物中引入了额外的不稳定性。表现出可归因于免疫偶联物中抗体组分的性能对于形成稳定的液态或冻干药物剂型是很苛刻的。为此，WO2004/004639A2和美国专利申请No.2004/0,241，174A1描述了免疫偶联物组合物。然而，这些组合物不能充分地处理免疫偶联物药物组合物中形成的颗粒和聚集物。因此，人们仍需要基本上没有颗粒和/或聚集物、以及在储运期间基本保持没有颗粒和/或聚集物的免疫偶联物药物组合物。本发明提供了基本上没有颗粒和/或聚集物、并在储存和/或运输期间防止颗粒和/或聚集物形成的免疫偶联物药物组合物。还提供了该药物组合物的应用方法。由在此处提供的本发明说明书可见，本发明的这些优点及其他优点、以及额外的发明特征是显而易见的。
发明内容本发明基于如下发现，即免疫偶联物药物组合物中颗粒和聚集物的形成能通过使用某些赋形剂而受到抑制。对于药物化合物而言，新剂型具有更大的稳定性和实质上更长的有效期，从而确保病人的安全。本发明一方面提供了一种基本上没有颗粒的免疫偶联物剂型，该免疫偶联物剂型包括免疫偶联物和一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由蔗糖、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、环糊精、葡萄糖、甘油、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、和氨基酸所构成的组，其中该剂型是pH为4.57.6的缓冲水溶液。本发明的第二方面提供了一种基本上没有聚集物的免疫偶联物剂型，该免疫偶联物剂型包括免疫偶联物和一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由组氨酸、蔗糖、甘氨酸和氯化钠所构成的组，其中该剂型是pH为4.57.6的缓冲水溶液。本发明还提供了一种基本上没有颗粒和聚集物的免疫偶联物剂型。具体实施方式本发明提供了基本上没有颗粒和/或聚集物、并在长期储存和运输期间基本保持没有颗粒和/或聚集物形成的稳定的免疫偶联物中的药物组合物。本发明基于如下发现，即免疫偶联物药物组合物中颗粒和/或聚集物的形成能通过使用某些赋形剂而受到抑制。对于药物化合物而言，新剂型具有更大的稳定性和实质上更长的有效期，从而确保病人的安全。通过包含可抑制或减少可见(大于5(Hun)颗粒和次可见(大于5pm)颗粒形成的赋形剂来制备这样的剂型。在此使用的基本上没有颗粒的组合物将通过美国药典(USP)测试法<788>，该测试要求尺寸超过10pm的颗粒应低于6000个/容器并且尺寸超过25pm的颗粒应低于600个/容器。参见美国药典委员会(Rockville，马里兰州)于2004年编写的USP28，Chapter788"注射剂中的颗粒物质"。此处使用的"基本没有聚集物"的组合物在储运期间将保持没有聚集物，从而使得免疫偶联物单体水平在组合物的有效期内保持高于95%。本发明的免疫偶联物组合物在4'C下的典型有效期为约15年，优选为14年，进一步优选为24年。本发明的基本上没有颗粒的免疫偶联物剂型包括免疫偶联物和一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由蔗糖、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、环糊精、葡萄糖、甘油、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、和氨基酸所构成的组，其中该剂型是pH为4.57.6的缓冲水溶液。该剂型可以包括一种或多种选自于由如下物质所构成的组的赋形剂(i)0.1-12%的蔗糖、(ii)0.005-1.0%的聚山梨酸酯20、(iii)0.5-2%的p-环糊精、(iv)2-8%的甘油、(v)1-5%的PEG6000、(vi)2-8%的甘露糖醇、(vii)0.005-1.0%的聚山梨酸酯80、(viii)5-20mM的组氨酸、(ix)100-300mM的甘氨酸、以及(x)50-300mM的氯化钠。在某些优选实施方式中，本发明的基本没有颗粒的剂型优选包括一种或多种选自于由如下物质所构成的组的赋形剂(i)5-10%的庶糖、(ii)0.005-0.2%的聚山梨酸酯20、(iii)0.5-1%的p-环糊精、(iv)2-5%的甘油、(v)2-3%的PEG6000、(vi)3-5%的甘露糖醇、(vii)0.005-0.2%的聚山梨酸酯80、(viii)10-15mM的组氨酸、(ix)130-250mM的甘氨酸、以及(x)100-200mM的氯化钠。在优选实施方式中，缓冲水溶液可以包含组氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、和醋酸盐中的一种或多种，并且其pH优选为5.07.0。该剂型的pH进一步优选为5.06.0。在本发明的某些实施方式中，剂型中的免疫偶联物包括选自于由huMy9-6、huC242、huN901、DS6、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、和美罗华所构成的组的人源化抗体；并且/或者该免疫偶联物包括选自于由美登木素生物碱、紫杉烷、和CC-1065所构成的组的细胞毒素类药物。在本发明的剂型中的免疫偶联物的浓度可以为约0.520.0mg/ml。优选免疫偶联物的浓度为0.510mg/ml。本发明的基本上没有聚集物的免疫偶联物剂型包括免疫偶联物；一种或多种选自于由组氨酸、蔗糖、甘氨酸和氯化钠所构成的组的赋形剂，其中该剂型是pH为4.57.6的缓冲水溶液。优选免疫偶联物剂型包括一种或多种选自于5-200mM组氨酸、100-200mM甘氨酸、和2-8%蔗糖的赋形剂。在某些优选实施方式中，赋形剂是5-100mM的组氨酸或100-150mM的甘氨酸，或者剂型包含2-8%的蔗糖和100-150mM的甘氨酸。在某些其它的优选实施方式中，剂型包含10mM的组氨酸、5%的蔗糖和130mM的甘氨酸。在优选实施方式中，缓冲液水溶液可以包含组氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、和醋酸盐中的一种或多种，并且其pH优选为5.07.0。剂型的pH进一步优选为5.06.0。在本发明的另一方式中，基本上没有聚集物的剂型还包括聚山梨酸酯20和/或聚山梨酸酯80，这使得剂型也基本上没有颗粒。在本发明的某些实施方式中，剂型中的免疫偶联物包括选自于由huMy9-6、huC242、huN901、DS6、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、和美罗华所构成的组的人源化抗体；并且/或者该免疫偶联物包括选自于由美登木素生物碱、紫杉垸、和CC-1065所构成的组的细胞毒素类药物。在本发明的剂型中免疫偶联物的浓度可以为约0.520.0mg/ml。优选免疫偶联物的浓度为0.510mg/ml。在本发明的某些优选实施方式中，免疫偶联物剂型基本上没有聚集物和颗粒。例如，本发明提供了一种免疫偶联物剂型，该免疫偶联物剂型主要由如下物质组成浓度为0.5-10mg/ml的huN卯l-DMl、5-15mM的组氨酸和/或5-15mM的琥珀酸盐、0.1-10%的蔗糖和/或100-300mM的甘氨酸、0.005-0.2%的聚山梨酸酯80和/或0.005-0.2%的聚山梨酸酯20，其中该剂型是pH为5-6的缓冲水溶液。可以任选地添加额外的成分，只要剂型基本保持没有聚集物和颗粒即可。在另一例子中，免疫偶联物剂型主要由如下物质组成(a)浓度为0.5-10mg/ml的huC242-DM4免疫偶联物、5-15mM的组氨酸、0.1-10%的蔗糖和/或100-300mM的甘氨酸、0.005-0.2%的聚山梨酸酯80和/或0.005-0.2%的聚山梨酸酯20，其中该剂型是pH为5-6的缓冲水溶液。可以任选地添加额外的成分，只要剂型基本保持没有聚集物和颗粒即可。通常，可用于本发明的合适的赋形剂可以选自于包括但不限于无机盐、有机酸、糖、氨基酸、聚山梨酸酯、聚乙二醇和它们的组合的各种类型。优选赋形剂选自于由无机盐、有机羧酸、糖、氨基酸、聚山梨酸酯、聚乙二醇、白蛋白、甘油、和它们的组合所构成的组。合适的无机盐的例子包括但不限于氯化钠、氯化钙、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、和它们的组合。氯化钠是用于本发明的优选的赋形剂。合适的有机羧酸的例子包括但不限于酒石酸(包括外消旋酒石酸、D-酒石酸和L-酒石酸)、马来酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、葡糖醛酸、和它们的组合。在此使用的"酸"是指酸和任何其的水合物及其盐，即柠檬酸盐和琥珀酸盐。琥珀酸是用于本发明的优选的赋形剂。合适的糖的例子包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、环糊精和它们的组合。蔗糖和环糊精是用于本发明的优选的赋形剂。合适的氨基酸的例子包括但不限于组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸和它们的组合。组氨酸和甘氨酸是用于本发明的优选的赋形剂。合适的白蛋白的例子包括人血清白蛋白。合适的聚乙二醇的例子是分子量约为20020,000Da的聚乙二醇。优选聚乙二醇是PEG4000、PEG5000、PEG6000、PEG8000、和PEG10000。合适的聚山梨酸酯的例子是聚山梨酸酯20(TWEEN-20)和聚山梨酸酯80。合适的环糊精的例子是a-环糊精、(3-环糊精、和？环糊精。根据本发明的指导，本领域的技术人员能较容易地确定出最适于制备基本上没有颗粒和/或聚集物的剂型、即给定的免疫偶联物溶液的赋形剂。优选免疫偶联物剂型的渗透压约为人类血液的渗透压(即等渗透压)。合适的渗透剂的例子是盐、氨基酸、和糖。优选的盐包括单价的钠盐。优选的氨基酸包括组氨酸、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸。最优选甘氨酸。优选的糖包括单糖、二糖、线性低聚糖、和环状低聚糖。优选的二糖是蔗糖。可以将适量的盐、糖、和/或氨基酸添加到本发明的剂型中以获得预期渗透压。药物化合物是免疫偶联物，该免疫偶联物包括特异性地识别靶细胞抗原的抗体、和一个或几个共价键连接的细胞毒素类药物分子，该药物分子比如是美登木素生物碱、紫杉烷、或CC-1065类似物。抗体可以对任何种类的细胞具有特异性，但通常针对将被破坏的靶细胞而言，比如针对肿瘤细胞(尤其是实体瘤细胞)、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自体免疫细胞(产生自身抗体的细胞)、活化细胞(参与移植排斥或移植物不适宿主疾病的那些)、或其他类型的带病细胞或反常细胞。抗体可以是目前已知的、或正变为已知的任何类型抗体，其可以包括能与细胞表面上抗原结合的任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段，比如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、二聚体、和三聚体、或免疫球蛋白嵌合体(例如，其包括互补决定区(CDR))。任何合适的抗体均可以用作细胞结合剂。本领域的普通技术人员乐于看到合适抗体的选择取决于被耙向的细胞群。就这点来说，用特定的细胞群(典型地优选带病细胞群)选择性地表达的细胞表面分子(即抗原)的类型和数目将决定用于本发明组合物的合适抗体的选择。多种细胞群包括肿瘤细胞类的细胞表面表达模式均是已知的，或者，即使未知，也能使用常规的分子生物学和组织化学技术确定。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，但最优选是单克隆抗体。在此使用的"多克隆"抗体是指典型地包含在免疫动物血清中的异质抗体分子群体。"单克隆"抗体是指对抗原具有特异性的同质抗体分子群体。单克隆抗体典型地由B淋巴细胞("B细胞")的单一克隆株制备。单克隆抗体可以使用本领域技术人员已知的包括标准杂交瘤技术的各种技术获得(参见，例如，K6hler和Milstein，Eur.J.Immunol.，5:511-519(1976)，Harlow和Lane编著，Antibodies:ALaboratoryManual,CSHPress(1988)，以及CA.Janeway等编著，Immunobiology，5thEd.，GarlandPublishing,NewYork,NY(2001))。简言之，制备单克隆抗体的杂交瘤方法典型地包括用抗原(即"免疫原")向任何合适的动物，典型地优选为小鼠注射。随后杀死动物，将从其脾中分离出的B细胞与人骨髓瘤细胞融合在一起。于是制得杂交细胞(即"杂交瘤")，该细胞不断增生，并在体外连续分泌出高滴度的具有预期特异性的抗体。可以使用本领域中已知的任何合适的方法来识别产生具有预期特异性的抗体的杂交瘤细胞。该方法包括，例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)、蛋白质印迹分析法(Westernblotanalysis)、和放射免疫分析法。筛选杂交瘤种群以分离单个的克隆细胞，它们中的各个克隆分泌出针对该抗原的单一抗体种类。因为各个杂交瘤是来源于与单个B细胞融合的克隆，故其产生的所有抗体分子在结构上是相同的，包括它们的抗原结合位点和同种型。单克隆抗体还可以使用其他合适的技术生成，包括EBV-杂交瘤技术(参见，例如，Haskard和Archer,J.Immunol.Methods，74(2):361-67(1984)，和Roder等，MethodsEnzymol，121:140-67(1986))、噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等，Science,246:1275-81(1989))、或包括抗体片段比如Fab和scFv的噬菌体展示库(单链可变区)(参见，例如，美国专利Nos.5,885,793和5,969,108，以及国际专利申请WO92/01,047和WO99/06,587)。单克隆抗体可以在任何合适的动物中分离出或产生，但优选在哺乳动物中产生，进一步优选在小鼠或人体内产生，更进一步优选在人体内产生。用于在小鼠体内产生抗体的方法对本领域技术人员来说是熟知的，在此对其进行说明。至于人源抗体，本领域的一个普通技术人员乐于看到多克隆抗体能从用合适的抗原接种或免疫的人类个体的血清中分离出来。可选地，人源抗体可以通过采用已知的用于在非人类动物比如小鼠体内产生人源抗体的技术产生(参见，例如，美国专利No.5,545,806、5,569,825、禾tl5,714,352、以及美国专利申请公开No.2002/0,197，266A1)。虽然人源抗体，尤其是人源单克隆抗体在人类的治疗应用中是理想的选择，但它们典型地比小鼠的单克隆抗体更难生成。然而，小鼠的单克隆抗体在给药人类时会诱导出快速的宿主抗体反应，这会降低抗体-药物偶联物的治疗或诊断效力。为避免这些并发症，优选单克隆抗体不被人类免疫系统视作"外来物"。为此，噬菌体展示可用于生产抗体。就这点来说，使用标准的分子生物学技术和重组DNA技术能生成编码抗体中结合抗原的可变(V)结构域的噬菌体文库(参见，例如，Sambrook等编著，MolecularCloning,ALaboratoryManual，3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(2001))。选取编码具有预期特异性的可变区的噬菌体，以用于特异性地与预期抗原结合，并且包括选取的可变结构域的完整的人源抗体被重组。将编码重组抗体的核酸序列导入到合适的细胞系比如用于杂交瘤制备的骨髓瘤细胞中，使得具有单克隆抗体特性的人源抗体由细胞分泌出来(参见，例如，Janeway等，同上、Huse等，同上、和美国专利No.6,265,150)。可选地，可由小鼠生成单克隆抗体，该小鼠是转基因小鼠，具有特定的人源免疫球蛋白重链和轻链基因。该方法在本
技术领域：
是已知的，并在比如美国专利Nos.5,545,806和5,569,825、以及Janeway等的上述文献中进行了说明。最优选抗体是人源化抗体。在此使用的"人源化"抗体是这样一种抗体其中鼠源单克隆抗体中互补决定区(CDR)被移植到人源抗体分子的骨架上，其中鼠源单抗形成抗体的抗原结合环。由于小鼠抗体与人源抗体的结构相似性，故在本
技术领域：
中通常认为该方法产生了抗原性与人源抗体相同、但结合了与其中衍生了CDR序列的鼠源单克隆抗体相同的抗原的单克隆抗体。用于产生人源化抗体的方法在本
技术领域：
是熟知的，并在比如Janeway等的上述文献、美国专利Nos.5,225,539、5,585,089和5,693,761、欧洲专利No.0,239,400Bl、和英国专利No.2,188,638中进行了详细说明。人源化抗体还可以使用美国专利No.5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235:959-973(1994)中描述的抗体表面重塑技术生成。虽然用于本发明组合物的免疫偶联物中的抗体最优选为人源化单克隆抗体，但如上所述的人源化单克隆抗体和鼠源单克隆抗体也在本发明的保护范围内。具有至少一个抗原结合位点、进而识别并结合到存在于靶细胞表面上的至少一个抗原或受体的抗体片段也在本发明的保护范围内。就这方面来说，完整的抗体分子的蛋白酶裂解能产生各种保留了识别和结合抗原能力的抗体片段。例如，用蛋白酶木瓜蛋白酶对抗体分子进行限制性消化典型地产生了3个片段，其中两个是相同的，并且因为它们保留了母体抗体分子的抗原结合活性而被称为Fab片段。用酶胃蛋白酶对抗体分子进行酶解通常产生两个抗体片断，其中一个保留了抗体分子中的两个抗原结合臂，从而被称为F(ab')2片段。具有二硫苏糖醇或半胱胺的F(ab')2片段的降解会产生被称为Fab'片段的片段。单链可变区片段(sFv)的抗体片段可以使用常规的DNA重组技术生成，其由截断的Fab片段组成，该Fab片段包括经由合成多肽与抗体轻链的V结构域相连的抗体重链的可变(V)结构域(参见，例如，Janeway等，同上)。类似地，用二硫键稳定的可变区片段(dsfv)可以用DNA重组技术制备(参见例如，Reiter等，ProteinEngineering7:697-704(1994))。然而，本发明范围内的抗体片段不限于这些示例的抗体片段类型。可以使用任何合适的可识别并结合到预期细胞表面受体或抗原上的抗体片段。抗体片段还在文献比如Parham，J.Immunol.,131:2895-2卯2(1983)、Spring等，J.Immunol.，113:470-478(1974)、以及Nisonoff等，Arch.Biochem.Biophys.，89:230-244(1960)中得到进一步说明。抗体-抗原的结合可以使用本
技术领域：
中已知的任何合适的方法进行分析，比如，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、蛋白质印迹分析(Westernblot)、免测沉淀法、和竞争性抑制分析(参见，例如，janeway等，同上、和美国专利申请公开No.2002/0,197,266Al)。此外，抗体可以是嵌合抗体或其抗原结合片段。所谓"嵌合"，是指抗体包括至少两个来自于至少两个不同物种的免疫球蛋白、或其片段(例如，两种不同的免疫球蛋白，比如可与鼠源免疫球蛋白可变区相结合的人源免疫球蛋白恒定区)。抗体还可以是结构域抗体(dAb)或其抗原结合片段，比如，例如骆驼抗体(参见，例如，Desmyter等，NatureStruct.Biol.，3:752，(1996))、或鲨鱼抗体，比如，例如，新的抗原受体(IgNAR)(参见，例如，Greenberg等，Nature,374:168(1995)，和Stanfield等，Science,305:1770-1773(2004))。在本发明的范围内可以使用任何合适的抗体。例如，单克隆抗体J5是对普通的急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)具有特异性的鼠源IgG2a抗体(Ritz等，Nature,283:583-585(1980))，其能用于表达CALLA的耙细胞(例如急性淋巴母细胞白血病细胞)。单克隆抗体MY9是可特异性地结合于CD33抗原的鼠源IgGl抗体(Griffin等，LeukemiaRes.，8:521(1984))，其能用于表达CD33的靶细胞(例如，急性骨髓性白血病(AML)细胞)。类似地，单克隆抗B4抗体(也被称为B4)是可结合于B细胞上CD19抗原的鼠源IgGl抗体(Nadler等，J.Immunol.,131:244-250(1983))，其能用于表达CD19的耙B细胞或带病细胞(例如，非何杰金瘤(non-Hodgkin'slymphoma)细胞和慢性淋巴细胞白血病细胞)。N901是可结合于存在于神经内分泌源、包括小细胞肺肿瘤的细胞上CD56(神经细胞粘附分子)抗原的鼠源单克隆抗体，其能用在免疫偶联物中以使药物靶向神经内分泌源的细胞。J5、MY9、和B4抗体优选在用作免疫偶联物中部分之前被表面重塑或人源化。抗体的表面重塑或人源化在文献比如Roguska等，Proc.Natl.Acad.ScLUSA，91:969-73(1994)中进行了说明。此外，单克隆抗体C242可结合于CanAg抗原(参见，例如，美国专利No.5，552，293)，其能用于使免疫偶联物靶向表达CanAg的肿瘤比如结肠直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、和胃癌。HuC242是单克隆抗体C242的人源化形式(参见，例如，美国专利No.5，552,293)。用ECACC标识号90012601来沉积可产生HuC242的杂交瘤。HuC242可以使用CDR-移植方法(参见，例如，美国专利Nos.5,585,089、5,693,761、和5,693,762)或表面重塑技术(参见，例如，美国专利No.5,639,641)制备。HuC242可用于使免疫偶联物靶向表达CanAg抗原的肿瘤细胞，比如，例如结肠直肠癌细胞、胰腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、和胃癌细胞。为靶向卵巢癌细胞和前列腺癌细胞，抗MUC1的抗体可用作免疫偶联物中的细胞结合剂。抗MUC1的抗体包括，例如，抗-HMFG-2(参见，例如，Taylor-Papadimitriou等，Int.J.Cancer,28:17-21(1981))、hCTM01(参见，例如，vanHof等，CancerRes.，56:5179-5185(1996))、和DS6。还可通过用抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为细胞结合剂比如J591，来用免疫偶联物靶向前列腺癌细胞(参见例如，Liu等，CancerRes.，57:3629-3634(1997))。此外，表达Her2抗原的癌细胞比如乳房癌、前列腺癌、和卵巢癌可以用曲妥珠单抗抗体靶向。在免疫偶联物中也可以使用可结合到类胰岛素生长因子受体的抗-IGF-IR抗体。尤其优选抗体是人源化单克隆抗体，其例子包括huN901、huMy9-6、huB4、huC242、DS6、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、和美罗华(参见，例如，美国专利Nos.5,639,641和5,665，357、美国专利申请公开No.2005-0118183Al、国际专利申请WO02/16,401、Pedersen等，同上、Roguska等，同上、Liu等，同上、Nadler等，同上、Colomer等，CancerInvest.，19:49-56(2001)、Heider等、Eur.J.Cancer，31A:2385-2391(1995)、Welt等，J.Clin.Oncol.，12:1193-1203(1994)和Maloney等，Blood，90:2188-2195(1997))。更进一步优选抗体是huN卯l人源化单克隆抗体或huMy9-6人源化单克隆抗体。其他的人源化单克隆抗体在本
技术领域：
中是已知的并可用于本发明。免疫偶联物可包括任何合适的药物，典型地为细胞毒剂。在此使用的"细胞毒剂"是指任何导致细胞死亡、诱发细胞死亡、或降低细胞活力的化合物。合适的细胞毒剂包括，例如美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、紫杉类药物、CC-1065和CC-1065类似物、以及海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素类似物。在本发明的优选实施方式中，细胞毒剂是美登木素生物碱，包括美登木醇和美登木醇类似物。美登木素生物碱是抑制微管形成并对哺乳动物细胞具有较高毒性的化合物。合适的美登木醇类似物的例子包括那些具有经修饰的芳香环的美登木醇类似物、和那些在其他位置进行修饰的美登木醇类似物。该美登木素生物碱在例如美国专利No.4，256，746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545、禾B6,333,410中进行了说明。具有经修饰的芳香环的美登木醇类似物的例子包括(1)C19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(通过安塞霉素(ansamytocin)P2的LAH还原制备)、(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-019-脱氯(美国专利Nos.4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌脱甲基或使用LAH脱氯制备、和(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(通过使用酰氯进fi^酰基化制备)。在非芳香环位置处修饰的美登木醇类似物的例子包括(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(通过美登木醇与H2S或P2S5的反应制备)、(2)C-14-烃氧甲基(去甲氧基/CH20R)(美国专利No.4,331,598)、(3)C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(由诺卡氏菌制得)、(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(通过用链霉菌转化美登木醇制得)、(5)C-15-甲氧基(美国专利Nos.4,313,946和4,315,929)(从滑桃树中分离)、(6)C-18-N-去甲基(美国专利Nos.4,362,663和4,322,348)(通过用链霉菌使美登木醇去甲基化来制备)、和(7)4,5-脱氧(美国专利No.4,371,533)(通过美登木醇的三氯化钛/LAH还原制备)。在本发明的优选实施方式中，免疫偶联物使用含硫醇的美登木素生物碱DM1、也称作N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-l-氧代丙基)-美登素作为细胞毒剂。DM1的结构用化学式(I)表示在本发明的另一优选实施方式中，免疫偶联物使用含硫醇的美登木素生物碱DM4、也称为^2'-脱乙酰基^-2'-(4-甲基-4-巯基-l-氧代戊基)-美登素作为细胞毒剂。DM4的结构用化学式(II)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(II)在本发明的范围内可以使用其他美登素，包括例如，含硫醇和二硫化物的美登木素生物碱，其在带有硫原子的碳原子上具有单个或两个烷基取代基。尤其优选美登木素生物碱在C3位置处具有C,4羟甲基、ds羟基、或C20去甲基官能团、带有受空间位阻的硫氢基的酰基基团的酰化氨基酸侧链，其中带有硫醇官能团的酰基基团中的碳原子上具有一个或两个取代基，所述取代基是CH3、C2H5、具有110个碳原子的线性或支链烷烃基或烯烃基、具有310个碳原子的环状垸烃基或烯烃基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基，此外，其中取代基中的一个可以是H，在羰基官能团和硫原子之间的酰基基团具有至少三个碳原子的直链长度。本发明范围内使用的额外的美登素包括用化学式(III)表示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(in)其中Y'代表(CR7R8)1(CR9《RK))p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CRn=CR12)sBt(CR3R4)rrCR!R2SZ，其中R,和R2各自独立是具有110个碳原子的线性烷基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状垸基或链烯基、苯基、取代苯基或者杂环芳香族或杂环垸基的游离基，其中R2也可以是H，其中A，B，D是具有310个碳原子的环垸基或环烯基、简单的或取代的芳基、或者是杂环芳香族或杂环烷基的游离基，其中R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Rio、Rii、和Ri2各自独立是H、具有110个碳原子的线性垸基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环的芳香族或杂环垸基的游离基，其中l、m、n、p、q、r、s、u、和t各自是零或15内的整数，但l、m、n、p、q、r、s、u、和t中的至少两个同时不为零，并且其中Z是H、SR或COR，其中R是具有110个碳原子的线性烷基或链烯基、具有3IO个碳原子的支链或环状垸基或烯基、简单的或取代的芳基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基。化学式(III)的实施方式优选包括如下化学式为(III)的化合物，其中(a)R！是H、R2是甲基并且Z是H，(b)R!和R2是甲基并且Z是H，(c)R!是H、112是甲基、并且Z是-SCH3，以及(d)R!和R2是甲基、并且Z是-SCH3。该附加的美登素还包括由化学式(IV-L)、(IV-D)、或(IV-D,L)表示的化合物(IV-L)(IV-D)(IV-D,L)其中Y代表(CR7Rs),(CR5R6)m(CR3R^CR!R2SZ，其中R,和R2各自独立是H、具有110个碳原子的线性垸基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状垸基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基。其中R3、R4、R5、R6、R7和Rg各自独立是H、具有110个碳原子的线性烷基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代苯基、或杂环的芳香族或杂环烷基的游离基，其中l、m、和n各自独立是15内的整数，此外，n可以是零，其中Z是H、SR或COR，其中R是甲基、具有110个碳原子的线性或支链烷基或链烯基、具有310个碳原子的环状烷基或烯基、或简单的或取代芳基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基，以及其中May代表在C-3位置处具有侧链C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20去甲基的美登木素生物碱。化学式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的实施方式优选表示包括如下化学式为(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)的化合物，其中(a)R,是H、112是甲基、R5、R、117和118各自是11、l和m各自是l、n是0、并且Z是H，(b)&和112是甲基、R5、Re、117和118各自是11、1和m是1、n是0、并且Z是H，(c)R,是H、112是甲基、R5、&、R7和Rs各自是H、1和m各自是l、n是0、并且Z是-SCH3，或(d)Ri和R2是甲基、R5、Re、117和118各自是H、l和m是l、n是O、并且Z是-SCH3。优选细胞毒剂是由化学式(IV-L)表示的化合物。优选附加的美登素还包括由化学式(V)表示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(V)其中Y代表(CR7Rs),(CR5R6)m(CR3R4)nCR,R2SZ，其中R,和R2各自独立是H、具有110个碳原子的线性的烷基或链烯基，优选为CH3或C2Hs、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基，其中R3、R4、R5、R6、R7、和Rs各自独立是H、具有110个碳原子的线性的烷基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环垸基的游离基，其中l、m、和n各自独立是l5内的整数，此夕卜，n可以是零，以及其中Z是H、SR或COR，其中R是甲基、具有110个碳原子的线性垸基或链烯基、具有310个碳原子的支链或环状垸基或烯基、或简单的或取代的芳基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基。化学式(V)的实施方式优选包括如下化学式为(V)的化合物，其中(a)R!是H、R2是甲基、R5、R6、R7、和Rs各自是H、l和m各自是l、n是0、并且Z是H，(b)R,和R2是甲基、R5、Re、R、Rs各自是H、l和m是l、n是0、并且Z是H，(c)R,是H、112是甲基、R5、R6、R7、和Rs各自是H、1和m各自是1、n是0、并且Z是-SCH3，或(d)R,和R2是甲基、R5、R6、R7、Rs各自是H、l和m是l、n是0、并且Z是-SCH3。更进一步优选的美登素还包括由化学式(VI-L)、(VI-D)、或(VI-D,L)表示的化合物(VI-L)(VI-D)(VI-D,L)其中Y2代表(CR7R8MCRsR6)m(CR3R4)nCR,R2SZ2，其中R,和R2各自独立是具有110个碳原子的线性垸基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环垸基的游离基，其中R2还可以是H，其中R3、R4、R5、R6、R7、和R8各自独立是H、具有110个碳原子的线性烷基或链烯基，优选为CH3或C2Hs、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环的芳香族或杂环烷基的游离基，其中l、m、和n各自独立是15内的整数，此外，ii可以是零，其中Z2是SR或C0R，其中R是具有110个碳原子的线性垸基或链烯基、具有310个碳原子的支链或环状垸基或烯基、或简单的或取代芳基、或者杂环芳香族或杂环垸基的游离基，以及其中May是美登木素生物碱。优选附加的美登素包括由化学式(VII)表示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(vn)其中Y2'代表(CR7R8)《CR9《R化)p(C《)qAr(CR5R6)mDu(CR!尸CRnMOC)sBt(CR3R4)nCR!R2SZ2，其中I^和R2各自独立是H、具有110个碳原子的线性或支链烷基或链烯基，优选为CH3或C2Hs、具有310个碳原子的环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基，其中A、B、和D各自独立是具有310个碳原子的环烷基或环烯基、简单的或取代的芳基、或者杂环芳香族或杂环垸基的游离基，其中R3、R4、R5、Re、R7、R8、R9、Rio、Rii、和R12各自独立是H、具有110个碳原子的线性烷基或链烯基，优选为CH3或C2H5、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、苯基、取代苯基、或者杂环芳香族或杂环烷基的游离基，其中l、m、n、p、q、r、s、t、和u各自是零或15内的整数，但1、m、n、p、q、r、s、t、和u中的至少两个同时不为零，以及其中Z2是SR或-COR，其中R是具有110个碳原子的线性垸基或链烯基、具有310个碳原子的支链或环状烷基或烯基、或简单的或取代的芳基、或杂环芳香族或杂环烷基的游离基。优选化学式(VII)的优选实施方式包括其中R!是H并且R2是甲基的化学式(VII)表示的化合物。除美登木素生物碱之外，用于免疫偶联物的细胞毒剂可以是紫杉烷或其衍生物。紫杉烷是包括紫杉醇(Taxol)(细胞毒性天然产物)、和多西紫杉醇(Taxotere)(半合成的衍生物)的化合物家族，这两种化合物都广泛用于癌症的治疗中。紫杉烷是抑制微管蛋白解聚、导致细胞死亡的有丝分裂纺锤体毒物。虽然多西紫杉醇和紫杉醇在治疗癌症中是有用的试剂，但它们的抗癌活性是有限的，这是因为它们对普通细胞具有非特异性毒性。此外，如紫杉醇和多西紫杉醇之类的化合物本身不能充分有效地用于免疫偶联物。用于制备细胞毒性免疫偶联物的优选的紫杉烷是如化学式(VIII)表示的紫杉烷用于合成可用于本发明的紫杉垸的方法以及用于将紫杉垸偶联到细胞结合试剂比如抗体上的方法在美国专利Nos.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6，706，708、禾D6,716,821、以及美国专利申请公开No.2004/0,024,049Al中进行了说明。细胞毒剂还可以是CC-1065或其衍生物。CC-1065是从链霉菌5^印toAnycMze/e"^的培养肉汤中分离出来的有潜力的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外的效力约为通常使用的抗癌药比如阿霉素、甲氨蝶呤、和长春新碱的效力的1000倍以上(Bhuyan等，CancerRes.，42:3532-3537(1982))。CC-1065和其类似物在美国专利Nos.5,585，499、5,846,545、6,340,701、和6,372,738中被公开。CC-1065的细胞毒性效力与其烷基化活性和其DNA结合或DNA插入活性相关。这两种活性来自分子的相分离的不同部分。在这方面，垸基化活性包含于环丙吡咯吲哚(CPI)亚单位，DNA结合活性来自CC-1065中的两个吡咯吲哚单位基。一些CC-1065类似物在本
技术领域：
中是已知的，并且也可以用作免疫偶联物中的细胞毒剂(参见，例如，Warpehoski等，J.Med.Chem.，31:590-603(1988))。一系列的CC-1065类似物已经被开发，其中CPI部分被环丙苯基吲哚(CBI)部分取代(Boger等，J.Org.Chem.，55:5823-5833(1990)，和Boger等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1:115-120(1991))。这些CC-1065类似物保持较高的母体药物的体外效力，同时不在小鼠体内引起缓发毒性。类似于CC-1065,这些化合物是共价结合到DNA的小沟中从而导致细胞死亡的烷化剂。CC-1065类似物的治疗效能可通过改变经由靶向释放至肿瘤位置的体内分布、导致降低对非靶组织的毒性并因此降低系统毒性而得到极大地提高。因此，已生产出特异性地靶向肿瘤细胞的CC-1065的类似物和衍生物与细胞结合试剂的偶联物(参见，例如，美国专利(VIII)Nos.5,475，092、5,585,499和5,846,545)。这些偶联物典型地在体外显示出较高的靶特异性的细胞毒性、和在小鼠体内人肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性(参见例如，Chari等，CancerRes.，55:4079-4084(1995))。用于合成CC-1065类似物的方法在美国专利Nos.5，475,092、5,585,499、5,846,545、6,534,660、6,586,618、禾卩6,756,397以及美国专利申请公开No.2003/0，195，365Al中有详细说明。药物比如甲氨蝶呤、柔红菌素、阿霉素、长春新碱、长春花碱、苯丙氨酸氮芥、自力霉素C、苯丁酸氮芥、加里刹霉素、tubulysin和tubulysin类似物、duocarmycin和duocarmycin类似物、海兔毒素和海兔毒素类似物也可用于本发明中。阿霉素和柔红菌素类化合物(参见，例如，美国专利No.6，630,579)也可用作药物。免疫偶联物可以用体外方法制备。为将药物或前体药物连接到抗体上，连接基团被使用。合适的连接基团在本
技术领域：
是众所周知的，其包括二硫基、对酸不稳定的基团、对光不稳定的基团、对肽酶不稳定的基团、和对酯酶不稳定的基团。优选连接基团是二硫基。例如，免疫偶联物可以通过抗体与药物或前体药物之间的二硫化物交换反应来制备。药物分子还可以经由中间载体分子比如血清白蛋白连接到抗体上。抗体可以通过与双功能交联剂的反应来修饰，从而导致连接体分子共价连接到抗体上。在此使用的"双功能交联剂"是任何将细胞结合试剂共价连接到药物比如此处所述的药物上的化学部分。在本发明的优选实施方式中，连接部分中的一部分由药物提供。在这方面，药物包括一个连接部分，其为用于将抗体连接到药物上的较大连接体分子中的一部分。例如，为形成美登木素生物碱DM1，在美登素的C-3羟基处的侧链被修饰成具有游离的硫氢基(SH)。该硫醇化形式的美登素可以与经修饰的抗体反应，以形成免疫偶联物。因此，最终的连接体由两部分组成，一个部分由交联剂提供，另一部分由DM1中的侧链提供。任何合适的双功能交联剂均可用于本发明，只要该连接体试剂分别保有疗效例如细胞毒性、和药物及抗体的靶向特性即可。优选连接体分子经由化学键将药物连接到抗体上(如上所述)，使得药物与抗体彼此形成化学连接(比如，共价连接)。优选连接试剂是可分裂的连接体。进一步优选连接体在温和条件下裂解，即，该条件为在细胞内药物的活性不受影响。合适的可分裂连接体的例子包括二硫化物连接体、对酸不稳定的连接体、对光不稳定的连接体、对肽酶不稳定的连接体、和对酯酶不稳定的连接体。含二硫化物的连接体是经由二硫化物的交换而可分裂的连接体，这在生理条件下可发生。对酸不稳定的连接体是在酸性pH下可分裂的连接体。例如，某些细胞内小室比如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH4-5)，于是提供了适于裂解酸不稳定性连接体的条件。对光不稳定的连接体在身体表面和许多可接收到光的体腔中是有用的。此外，红外光可以穿透组织。对肽酶不稳定的连接体可用于裂解某些胞内或胞外多肽(参见，例如，Trouet等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79:626-629(1982)，和Umemoto等，Int.J.Cancer，43:677-684(1989))。优选药物经由二硫键被连接到抗体上。连接体分子包括能与抗体反应的反应性化学基团。优选用于与抗体反应的反应性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-硫化琥珀酰亚胺酯。此外，连接体分子包括能与药物反应以形成二硫键的反应性化学基团，优选二硫代吡啶基基团。尤其优选连接体分子包括，例如，^琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见，例如，Carlsson等，Biochem.J.，173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见，例如，美国专利No.4,563,304)、和N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)(参见，例如，CAS入藏登记号341498-08-6)。虽然在本发明的方法中优选使用可分裂的连接体，但也可用非可分裂的连接体以生成上述免疫偶联物。非可分裂连接体是任何能以稳定的、共价方式将药物比如美登木素生物碱、紫杉烷、或CC-1065类似物连接到细胞结合试剂比如抗体上的化学部分。因此，非可分裂的连接体是在保持药物或抗体活性的条件下基本上抗酸诱导裂解的、抗光诱导裂解的、抗肽酶诱导裂解的、抗酯酶诱导裂解的、和抗二硫键裂解的。形成药物和细胞结合试剂之间的非可分裂连接体的合适交联剂在本
技术领域：
是众所周知的。非可分裂连接体的例子包括具有用于与细胞结合试剂反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-硫化琥珀酰亚胺酯部分、以及用于与药物反应的基于马来酰亚胺或卤代乙酰的部分。包括基于马来酰亚胺部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺甲基)环已烷羧酸酯(SMCC)、SMCC的"长链"类似物N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己垸-l-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、k-马来酰亚胺^^一垸酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、？马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、s-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(a-马来酰亚胺醋酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺-6-(p-马来酰亚胺丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、仏琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(对马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。包括基于卤代乙酰部分的交联剂包括>^-琥珀酰亚胺-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺碘醋酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA)、和N-琥珀酰亚胺3-(溴代乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。其他可形成非可分裂连接体的不含硫原子的交联剂也可用于本发明的方法中。该连接体可衍生自基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括，但不限于，由通式(IX)表示的a,co-二羧酸HOOC-X!-Yn陽Zm-COOH(IX)其中X是具有220个碳原子的线性或支链烷基、链烯基、或炔基，Y是具有310个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有610个碳原子的取代或未取代的芳基、或其中杂原子选自于N、O或S的取代或未取代的杂环基，其中1、m、禾Qn各自为O或l，但1、m、和n不同时全为O。在此公开的许多非可分裂的连接体在美国专利申请公开Na2005-0169933Al中有详细说明。可选地，如美国专利No.6,441,163Bl中所公开的，可以首先修饰药物以导入适于与抗体反应的反应性酯。这些包含活化连接体部分的美登木素生物碱与抗体的反应提供了另一种方法，用于制备可分裂的或非可分裂的抗体-美登木素生物碱偶联物。用于制造该药物组合物的工艺包括，通过层析或渗滤将整体药物缓冲置换入合适的剂型缓冲液中、以及接着添加预期量的合适的溶液或固体赋形剂。还可以对蛋白浓度和/或pH进行最终调节以获得预期组合物。因此，本发明的免疫偶联物以本申请中所述的药物剂型和药学可接收的载体、赋形剂或稀释剂的形式给药于病人。此处所用的"药学可接受的"，是指那些可用于治疗或诊断哺乳动物、优选为人类的试剂。给药的优选模式是肠胃外式，尤其是静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、或淋巴管内途径(参见比如，Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，1980,MackPublishingCompany,Osol等编著)。该组合物可以包括蛋白比如血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲液或缓冲剂比如磷酸盐、其他的盐、或电解质等。合适的稀释剂可以包括，例如，无菌水、等渗盐水、稀释的葡萄糖水、多元醇比如甘油、丙二醇、聚乙二醇等或这些醇类的混合物。剂型可以包含防腐剂比如苯乙醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸等。视需要，剂型可以包括0.05约0.20wtc/。的抗氧化剂。给药可以经由任何普通医师已知的有效途径进行。肠胃外给药是优选的。优选用于给药本发明的剂型的肠胃外途径包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹膜内注射、动脉注射。用于本发明的静脉注射、腹膜内注射、肌肉注射，和皮下注射给药途径是进一步优选的肠胃外给药途径。然而，静脉注射、腹膜内注射、和皮下注射给药本发明剂型的途径是更进一步优选的。经由某些肠胃外途径的给药可以包括通过针或导管将本发明的剂型导入病人体内。可选的，可以通过无菌注射器或一些其他的机械装置比如连续式注入系统进行推注给药。本发明提供的剂型可以使用本
技术领域：
中熟知的用于肠胃外给药的注射管、注射器、泵、或任何其他的器件或靠重力给药。剂型可以以无菌液体药剂的形式肠胃外给药。这些剂型可以作为丸剂或快速输液进行静脉内给药，这除了能获得预期的治疗、诊断或医学效果外，还会导致免疫偶联物的释放。本发明的免疫偶联物在较宽的剂量范围内是有效的，这取决于如下因素，比如待治疗的疾病状态或待改变的生物效应、其中给药免疫偶联物的方式、病人的年龄、体重和状态、以及其他待治疗医生确定的因素。因此，对任何目标病人的给药量可根据个体基础确定。给药本发明剂型以治疗病人的量可取决于多个因素，其中包括但不限于，病人的性别、体重和年龄、待治疗的状态或疾病的根本原因、给药途径和生物利用率、给药的免疫偶联物在体内的持久度、剂型、以及免疫偶联物的效力。在间歇性给药的情况中，每次给药的量还应考虑给药间隔、以及剂型中的免疫偶联物的生物利用率。本发明剂型的给药可以是连续式的。给药本发明剂型的滴定剂量和注入速率或频率、以获得预期的临床结果是在普通医师的技术范围之内。给药的剂量毫无疑问随已知的因素而变，该因素比如是特定试剂的药物动力学特性、和其给药模式和途径；受体的年龄、健康状况、和体重；症状性质和程度、并发治疗的种类、治疗频率、和预期效果。通常，疗效显著的化合物的每日剂量可以为约0.1100毫克每公斤体重。适用于内部给药的药剂形式包含每单位约1500毫克的疗效显著的化合物。在这些药物组合物中，以组合物的总重量为基准，疗效显著的化合物在混合之前通常在液体剂型中以约0.05wt%2wt。/。的量存在，而在冻干剂型中以250%的量存在。本发明还提供了上述剂型的冻干粉末。优选冻干剂型包括一种或多种附加的组分，比如冻干保护剂和/或填充剂。冻干粉末可以与水混合以形成重组的溶液。本剂型可以如美国专利申请No.2004/0,241,174Al所述被冻干和混合，将该申请说明书中的内容引入本文以作参考，该申请描述了包含免疫偶联物的冻干剂型。在冻干组合物重组之前，包含本发明的冻干组合物的各个组分的相对量根据项目--每mg偶联物的赋形剂(比如，缓冲剂、表面活性剂、填充剂、防冻剂)的mg量而进行说明。虽然此处所述的任何合适的缓冲剂均可用于本发明的冻干组合物，但冻干组合物优选包括琥珀酸钠缓冲液。缓冲剂可以以任何合适的量存在于本发明的冻干组合物中。特别地，冻干组合物优选包含约0.1mg约2mg的缓冲剂每mg偶联物(例如，约0.1mg约0.5mg的缓冲剂每mg偶联物、约0.5mg约1mg的缓冲剂每mg偶联物、或约1mg约2mg的缓冲剂每mg偶联物)。最优选冻干组合物包括约0.3mg的琥珀酸钠缓冲液每mg偶联物。冻干组合物优选包含约0.005mg约0.1mg的聚山梨酸酯每mg偶联物，优选包括约0.005mg约0.01mg的聚山梨酸酯每mg偶联物、0.01mg约0.05mg的聚山梨酸酯每mg偶联物、或约0.05mg约0.1mg的聚山梨酸酯每mg偶联物。当聚山梨酸酯是聚山梨酸酯20时，冻干组合物优选包括约0.02mg的聚山梨酸酯20每mg偶联物。为防止组合物中的活性成分在冻干期间的降解，本发明的冻干组合物还包括防冻剂，优选包括非晶态防冻剂。在此使用的术语"防冻剂"是指在冰冻期间保护不稳定分子的赋形剂。用于冻干组合物的合适的防冻剂对本
技术领域：
的技术人员是已知的，其包括，例如，甘油、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、葡萄糖、海藻糖、和蔗糖。最优选防冻剂是蔗糖。防冻剂可以以任何合适的量存在于本发明的冻干组合物中。冻干组合物优选包含约0.5mg约5mg、例如约0.5mg约2mg的防冻剂每mg偶联物、约0.8mg的防冻剂每mg偶联物、约2mg的防冻剂每mg偶联物、或约4mg的防冻剂每mg偶联物。当防冻剂是蔗糖时，冻干组合物优选包括约0.5mg约2mg(例如，约1mg)的蔗糖每mg偶联物。冻干组合物还可包含填充剂，优选包含可结晶的填充剂。填充剂典型地用于本
技术领域：
中以便为通过冻干法制备的"饼"提供结构和重量。任何本
技术领域：
已知的合适的填充剂均可用于本发明的冻干组合物。合适的填充剂包括，例如，甘露糖醇、葡聚糖、和甘氨酸。用于本发明的组合物的填充剂最优选为甘氨酸。冻干组合物可包含任何适量的填充剂，但优选冻干组合物包括约2mg约20mg的填充剂每mg偶联物，并且优选包括约2mg约10mg的填充剂每mg偶联物、约5mg约10mg的填充剂每mg偶联物、约10mg约15mg的填充剂每mg偶联物、或约15mg约20mg的填充剂每mg偶联物。当填充剂是甘氨酸时，冻干组合物优选包括约3.8mg的甘氨酸每mg偶联物。因此，根据本发明，用于重组以包含5mg/mL偶联物(例如，优选偶联物包含与DM1化学连结的huN901)的冻干组合物的成分优选包括(i)约0.3mg的琥珀酸钠缓冲剂每mg偶联物、(ii)约0.02mg的聚山梨酸酯20每mg偶联物、(iii)约lmg的蔗糖每mg偶联物、和(iv)约3.8mg的甘氨酸每mg偶联物。一旦与水重组，该冻干组合物优选具有约5.5的pH。此外，当冻干组合物与水重组时，上述有关与液体剂型相关的赋形剂相对浓度的说明适用于上述冻干组合物。冻干法在本
技术领域：
是众所周知的，其在比如文献Wang，W.Int.J.Pharm.，203，1-60(2000)中得到说明。例如，本发明的冻干组合物可用循环冻干法制备，包括如下步骤(1)在4'C的保存温度和环境室压下预冷却2.5小时，(2)在-5(TC的保存温度和环境室压下冰冻14小时，(3)在-2(TC的保存温度和环境室压下重结晶6小时，(4)在-5(TC的保存温度和环境室压下再次冰冻16小时，(5)在-13。C的保存温度和100mTorr的压力下初次干燥24小时，(6)在24°C的保存温度和100mTorr的压力下二次干燥10小时，以及(7)在24°C的保存温度和环境室压下用塞子进行相密封。然而，冻干组合物不限于由上述方法制造的组合物。实际上，任何合适的冻干方法均可用于制备冻干组合物，选取的冻干参量(例如，干燥时间)将随多个因素而改变，包括待冻干的溶液体积，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在另一实施方式中，本发明致力于提供用于制备含水剂型的试剂盒，该试剂盒包括容纳冻干粉末的第一容器和容纳包含重组稳定剂的含水剂型的第二容器。溶液中的冻干粉末的浓度、待装入各个容器内的溶液体积、以及容器的容积是彼此关联的参量，可根据最终剂量单元中有效成分的预期浓度而进行适当地调整。因此，这些参量可在较宽的范围内变化。在此引用的所有专利、公开、以及其他参考文献的全部内部可引入本文以作参考。现在通过如下实施例，对本发明进行进一步地说明，但这些实施例是用于说明工艺而不得视为是对本发明的限制。技术人员可以采用和修改如下工艺参数以适合特定的需要。实施例1本实施例显示了如下剂型赋形剂对形成的MAb-DMl偶联物试样的外观的影响。制得于磷酸缓冲液中含有1.0mg/mL的huN901-SPP-DMl的试样，所述磷酸缓冲液为10mM、pH6.5、具有140mMNaCl和下表所列各个赋形剂。以w/w%(赋形剂的重量/溶液的重量)为单位将赋形剂直接添加到huN901-SPP-DMl试样中。在添加赋形剂后紧接着过滤剂型混合物，然后进行外观和粒子计数测试。然后在4(TC下储存试样，储存时间为研究的时间，接着在2周和1个月时再次测试。至于外观，通过检验至少1.0mL的溶液在白色背景下的清晰度和其在白光下相对黑色背景是否存在可见颗粒来对试样进行测试。记录关于可见颗粒是否存在的结果。尺寸大于5pm的次可见颗粒也可用经校准以测定2100pm之间粒度的HIAC粒子计数器来进行测定。外观:赋形剂初始2周l个月5%的蔗糖清晰清晰清晰10%的蔗糖清晰清晰清晰0.1%的吐温20清晰清晰清晰0.8%的吐温20清晰颗粒清晰1%的环糊精清晰清晰清晰1%的葡萄糖清晰清晰颗粒5%的甘油清晰清晰颗粒2。/o的PEG6000清晰清晰颗粒5%的甘露糖醇清晰颗粒颗粒过滤的对照样*清晰清晰颗粒*在初始时间点之前短暂过滤<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>观察到了蔗糖、TWEEN-20tm、P-环糊精、葡萄糖、甘油、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)的积极效果。实施例2本实施例显示了就偶联物聚集物而言，氨基酸对huN901-SPP-DMl的稳定性的影响。在如下缓冲液中制得5.0mg/mL的huN901-SPP-DM1试样，然后在2-8°C和25°C下分别储存12个月。在1个月、3个月、6个月和12个月时通过色谱分析对偶联物聚集物的含量进行测试。(1)lOmM的磷酸钠，140mM的NaCl，pH为6.5。(2)lOmM的柠檬酸钠，135mM的NaCl，0.01%的聚山梨酸酯20，pH5.5。(3)lOmM的柠檬酸钠，130mM的组氨酸，0.01%的聚山梨酸酯20，pH5.5。(4)lOmM的柠檬酸钠，110mM的甘氨酸，80mM的NaCl，0.01%的聚山梨酸酯20，pH5.5。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例1表明，就抑制偶联集聚物的形成而言，组氨酸改善了剂型。甘氨酸也具有该优点。实施例3本实施例显示了就偶联物聚集物而言，组氨酸对huMy9-6-SPDB-DM4偶联物的稳定性的影响。在如下溶液中形成5.0mg/mL的huMy9-6-SPDB-DM4偶联物(1)lOmM的拧檬酸钠，135mM的NaCl，pH5.5(2)150mM的组氨酸/组氨酸氯化物，pH5.5在2-8'C和25'C下试样保温6个月，之后通过色谱分析对偶联物的聚集进行测试。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>数据表明，组氨酸具有防止聚集物形成的有益效果。实施例4本实施例显示了就偶联物聚集物而言，缓冲剂、糖和氨基酸对huC242-SPDB-DM4的稳定性的影响。在如下溶液中制得5.0mg/mL的huC242-SPDB-DM4试样(1)lOmM的拧檬酸钠，135mM的NaCl，pH5.5(2)lOmM的柠檬酸钠，5%的蔗糖，130mM的甘氨酸，0.1%的聚山梨酸酯80，pH5.5(3)10mM的组氨酸/组氨酸氯化物，5%的蔗糖，130mM的甘氮酸，pH5.5在To、以及在2-8。C和25°C下储存3个月后对偶联物单体和聚集物含量进行测试。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>数据表明，上述组合中就抑制偶联物聚集物而言，庶糖和甘氨酸一起改善了剂型。在庶糖和甘氨酸组合与组氨酸一起使用时，观察到最大的改进。实施例5本实施例显示了各种包含蔗糖和甘氨酸、及包含蔗糖但不包含甘氨酸的剂型对huN901-SPP-DMl偶联物聚集物含量的影响。对以5.0mg/mL浓度存在于如下各个液体剂型中的huN901-SPP-DMl试样进行单体和聚集物含量的测试。(1)10mM的拧檬酸钠，135mM的NaCl，0.01。/。的聚山梨酸酯20,pH5.5(2)lOmM的柠檬酸钠，60mM的NaCl，5%的蔗糖，pH5.5(3)10mM的柠檬酸钠，60mM的NaCl，0.01%的聚山梨酸酯20，5%的蔗糖，pH5.5(4)lOmM的磷酸钠，140mM的NaCl，pH6.5(5)lOmM的琥珀酸钠，0.25M的甘氨酸，0.01°/。的聚山梨酸酯20，0.5%的蔗糖，pH对在25'C下储存3个月、6个月、12个月的试样进行聚集物含量的测试。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>就所有情况而言，与没有蔗糖的剂型相比，包含蔗糖的剂型具有更低的聚集物含量。在本实施例中，包含甘氨酸(配方5)的剂型具有最好的稳定性。实施例6本实施例显示了聚山梨酸酯80对因搅动诱发的颗粒形成的影响。将该应力状态(搅动)设计为模拟与静态储存期间所受应力(如实施例1中所述)相反的运送和处理液体偶联物期间所受的应力。在如下缓冲液中制得1mg/mL的huC242-SPDB-DM4试样，接着将其装入用^11似60@塞密封的USP1型玻璃小瓶中(10mL的小瓶中装入5mL)。使用Lab-LineOrbitalShaker摇床在室温下以100rpm的转度摇动小瓶48小时。(1)lOmM的柠檬酸钠，135mM的氯化钠，pH5.5(2)lOmM的组氨酸，5%的蔗糖，130mM的甘氨酸，pH5.5(3)10mM的组氨酸，5%的蔗糖，130mM的甘氨酸，0.1%的聚山梨酸酯80，pH5.5(4)lOmM的组氨酸，1%的蔗糖，250mM的甘氨酸，pH5.5(5)lOmM的组氨酸，1%的蔗糖，250mM的甘氨酸，0.1%的聚山梨酸酯80，pH5.5(6)10mM的组氨酸，280mM的甘氨酸，pH5.5(7)10mM的组氨酸，280mM的甘氨酸，0.1%的聚山梨酸酯80，pH5.5(8)10mM的组氨酸，10%的蔗糖，pH5.5(9)10mM的组氨酸，10%的蔗糖，0.1%的聚山梨酸酯80，pH5.5在摇动48小时后，目测检查所有的小瓶。包含聚山梨酸酯80(配方3、5、7和9)的那些剂型保持澄清，而所有不包含聚山梨酸酯80(配方l、2、4、6和8)的那些剂型均是混浊的。这些数据表明，聚山梨酸酯80具有减少因搅动(比如在运送和处理液体偶联物期间可能碰到的)诱发的颗粒的有益效果。权利要求1.一种免疫偶联物剂型，包括(a)免疫偶联物；和(b)一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由蔗糖、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、环糊精、葡萄糖、甘油、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、和氨基酸构成的组，其中所述剂型是pH值为4.5～7.6的缓冲水溶液。2.如权利要求l所述的剂型，其特征在于，所述剂型包括一种或多种选自于由如下物质构成的组的赋形剂(i)0.1-12%的蔗糖，(ii)0.005-1.0%的聚山梨酸酯20，(iii)0.5-2%的|3-环糊精，(iv)2-8%的甘油，(v)1-5%的PEG6000，(vi)2-8%的甘露糖醇，(vii)0.005-1.0%的聚山梨酸酯80，(viii)5-20mM的组氨酸，(ix)100-300mM的甘氨酸，和(x)50-300mM的氯化钠。3.如权利要求2所述的剂型，其特征在于，所述剂型包括一种或多种选自于由如下物质构成的组的赋形剂(i)5-10。/。的蔗糖，(ii)0.005-0.2%的聚山梨酸酯20，(叫0.5-1%的卩-环糊精，(iv)2-5。/。的甘油，(v)2-3%的PEG6000，(vi)3-5。/。的甘露糖醇，(vii)0.005-0.2%的聚山梨酸酯80，(viii)10-15mM的组氨酸，(ix)130-250mM的甘氨酸，禾口(x)100-200mM的氯化钠。4.如权利要求l所述的剂型，其特征在于，所述缓冲水溶液包含组氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、和醋酸盐中的一种或多种。5.如权利要求4所述的剂型，其特征在于，所述pH为5.07.0。6.如权利要求5所述的剂型，其特征在于，所述pH为5.06.0。7.如权利要求1所述的剂型，其特征在于，所述免疫偶联物包括选自于由huMy9-6、huC242、huN901、DS6、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、和美罗华所构成的组的人源抗体。8.如权利要求l所述的剂型，其特征在于，所述免疫偶联物包括选自于由美登木素生物碱、紫杉烷、和CC-1065所构成的组的细胞毒素类药物。9.一种免疫偶联物剂型，包括(a)免疫偶联物；和(b)—种或多种选自于由组氨酸、庶糖、甘氨酸和氯化钠所构成的组的赋形剂，其中所述剂型是pH为4.57.6的缓冲水溶液。10.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述剂型包括一种或多种选自于5-200mM的组氨酸、100-200mM的甘氨酸、和2-8%的蔗糖中的赋形剂。11.如权利要求IO所述的剂型，其特征在于，所述赋形剂是5-100mM的组氨酸或100-150mM的甘氨酸。12.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述剂型包含2-8%的蔗糖和100-150mM的甘氨酸。13.如权利要求12所述的剂型，其特征在于，所述剂型包含10mM的组氨酸、5%的蔗糖和130mM的甘氨酸。14.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述缓冲水溶液包含组氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、和醋酸盐中的一种或多种。15.如权利要求14所述的剂型，其特征在于，所述pH为5.07.0。16.如权利要求15所述的剂型，其特征在于，所述pH为5.06.0。17.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述剂型还包括聚山梨酸酯20和/或聚山梨酸酯80。18.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述免疫偶联物包括选自于由huMy9-6、huC242、huN901、DS6、曲妥珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗、和美罗华所构成的组的人源抗体。19.如权利要求9所述的剂型，其特征在于，所述免疫偶联物包括选自于由美登木素生物碱、紫杉垸、和CC-1065所构成的组的细胞毒素类药物。20.—种免疫偶联物剂型，主要包括(a)浓度为0.5-10mg/ml的huN901-DMl免疫偶联物；(b)5-15mM的组氨酸禾口/或5-15mM的琥珀酸盐；(c)0.1-10%的蔗糖和/或100-300mM的甘氨酸；(d)0.005-0.2%的聚山梨酸酯80和/或0.005-0.2%的聚山梨酸酯20，其中所述剂型是pH为56的缓冲水溶液。21.—种免疫偶联物剂型，主要包括(a)浓度为0.5-10mg/ml的huC242-DM4免疫偶联物；(b)5-15mM的组氨酸；(C)0.1-10%的蔗糖禾口/或100-300mM的甘氨酸；(d)0.005-0.2%的聚山梨酸酯80和/或0.005-0.2%的聚山梨酸酯20;其特征在于，所述剂型是pH为56的缓冲水溶液。全文摘要本发明提供一种基本无颗粒的免疫偶联物剂型，该免疫偶联物剂型包括免疫偶联物和一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由蔗糖、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、环糊精、葡萄糖、甘油、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、和氨基酸所构成的组，其中该剂型是pH为4.5～7.6的缓冲水溶液。本发明还提供一种基本上没有聚集物的免疫偶联物剂型，该免疫偶联物剂型包括免疫偶联物和一种或多种赋形剂，该赋形剂选自于由组氨酸、蔗糖、甘氨酸和氯化钠所构成的组，其中该剂型是pH为4.5～7.6的缓冲水溶液。本发明还提供一种基本上没有颗粒和聚集物的免疫偶联物剂型。文档编号C07K16/00GK101237881SQ200680028557公开日2008年8月6日申请日期2006年8月2日优先权日2005年8月3日发明者亨-伟·吉,伊丽莎白·巴特利特,伟张,戈弗雷·阿姆弗雷特,迈克尔·S·弗莱明申请人:免疫基因公司