专利名称：洛美沙星的偶联物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种喹诺酮类抗生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种洛美沙星(lomefloxacin)的偶联物及其制备方法与应用。属抗生素药免疫检测领域。
背景技术：
本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书BSA牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司产品PBS磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75葡聚糖凝胶，Sigma公司产品cBSA经乙二胺修饰的牛血清蛋白透析膜美国联合炭化(United Carbide)公司产品洛美沙星中国兽医药品监察所EDC乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺，简称EDC，Sigma公司产品洛美沙星(lomefloxacin)属于喹诺酮类抗生素。这类抗生素由于其抗菌谱广，杀菌能力强，是继土霉素之后在畜禽水产养殖中广泛应用的药物。这类药物可以有效地预防和治疗家禽细菌和霉形体疾病。洛美沙星是其中最常用最有效的药物之一。但人们通过研究逐渐发现，喹诺酮类抗生素在动物源食品中的残留对人体有毒害。作为一种人畜共用药，喹诺酮类抗生素在食品中的残留通过食物链对人体健康危害很大。新英格兰明尼苏达州卫生署的KIRKE SMITH为首的研究小组发现，家禽使用喹诺酮类药物使弯曲杆菌产生了耐药性。根据美国疾病控制与预防中心的调查，一种由食品引起疾病的弯曲杆菌对喹诺酮类药物的耐药性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我国尚未颁布动物源食品中残留的喹诺酮类药物的检测方法和相应标准。美国由于考虑到这类药物的交叉感染，已经开始在畜禽养殖业中禁用喹诺酮类抗生素。我国虽尚未在畜禽水产养殖业中禁用喹诺酮类抗生素，但有严格的停药期规定。随着人民生活水平的提高及我国加入WTO，对动物源食品的品质要求也越来越高，食品中药物残留的检测必将法制化，常规化。因此，研究喹诺酮类药物在食品中的残留限量和检测方法是非常必要的。
在抗生素药物残留的检测中，仪器法如液相色谱和质谱以及液相质谱联用是应用最广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大多数抗生素包括喹诺酮类药物都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化合物转变成能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，现在世界上尚未有关于洛美沙星的免疫原的合成及抗体制备的报道，而且目前国内检测洛美沙星药物残留的ELISA试剂盒大都购于国外，保存期限短，价格高，远不能满足检测需要，因此研究洛美沙星的免疫原的合成及抗体制备就显得十分必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能引发动物免疫系统产生针对洛美沙星有特异反应的抗体的免疫原，即洛美沙星(lomefloxacin)的偶联物及其制备方法。同时，本发明还提供了所述的洛美沙星的偶联物作为免疫原在制备洛美沙星特异反应抗体中的应用。
本发明的洛美沙星的偶联物，由洛美沙星半抗原与产生抗原性的载体物质牛血清蛋白或卯清蛋白偶联构成。
其中上述产生免疫原性的载体物质优选是牛血清蛋白。
本发明所述的洛美沙星的偶联物，其结构通式如(I) 其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的洛美沙星的分子个数，所述n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9Kda；上述偶联物显示出如下物化特征(1)外观白色粉末固体；(2)紫外吸收光谱288nm，322nm。
上述的洛美沙星的偶联物，其中n优选为整数5～15，BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa。
上述的洛美沙星的偶联物的制备方法是将洛美沙星与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
上述的洛美沙星的偶联物的制备方法，由如下步骤完成(1)溶液A的制备将洛美沙星，羟基琥珀酰亚胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，以摩尔比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩尔比为15～25∶1∶15～25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃条件下搅拌反应2～4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，然后改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；(4)按洛美沙星与cBSA的摩尔比为15～50∶1量分别取溶液A和溶液B，在20℃±5℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4～6小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，再改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色洛美沙星的偶联物。
在上述的洛美沙星的偶联物的制备方法中步骤(1)所述洛美沙星与羟基琥珀酰亚胺、EDC的摩尔比优选为1∶5∶10。
在上述的洛美沙星的偶联物的制备方法中步骤(2)所述乙二胺与牛血清蛋白、EDC的摩尔比优选为20∶1∶20。
在上述的洛美沙星的偶联物的制备方法中步骤(2)(3)所述的磷酸缓冲液pH优选为7.40，浓度优选为0.01M。
在上述的洛美沙星的偶联物的制备方法中步骤(4)所述的洛美沙星与牛血清蛋白的摩尔数比优选为30∶1。
本发明所述的洛美沙星的偶联物作为免疫原在制备洛美沙星特异反应抗体中的应用。
利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原洛美沙星与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原——洛美沙星的偶联物。
利用本发明所述的洛美沙星的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原洛美沙星有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本发明所述的洛美沙星的偶联物作为免疫原制备的洛美沙星特异反应抗体，其抗血清效价达到1∶6400，其最低检测限为1ppb。
上述的洛美沙星的偶联物以及高效价的洛美沙星特异反应抗体的制备成功，为制备洛美沙星的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。在实际应用中，把所述制备的洛美沙星特异反应抗体镀在微孔盘内，就可以用来检验动物源食品中洛美沙星的残留。由于本发明所述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于食品检验检疫中的初步扫描检测之用。这样不但可以节省大量的检验时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持，需要专门的技术人员操作，难用于现场的不足。所以，半抗原洛美沙星与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联物的合成及抗血清的成功制备为这种快速检验法奠定了基础。
具体实施例方式
实施例1(1)液A的制备称取洛美沙星10.00mg，羟基琥珀酰亚胺13.12mg，EDC 27.31mg，溶解在3ml二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与EDC的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺18.03mg溶于20ml pH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.40；分别称取1000.00mg BSA(分子量68,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃条件下搅拌反应2小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，然后改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.40，浓度为0.01M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；(4)按洛美沙星与cBSA的摩尔比为20∶1量分别取溶液A和溶液B，在20℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，再改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色洛美沙星的偶联物。
实施例2(1)A的制备称取洛美沙星10.00mg，羟基琥珀酰亚胺16.40mg，EDC 54.63mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与EDC的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺18.03mg溶于20ml pH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.40；分别称取1000.00mg BSA(分子量68,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在25℃条件下搅拌反应4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析72小时，然后改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.40，浓度为0.01M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；(4)按洛美沙星与cBSA的摩尔比为30∶1量分别取溶液A和溶液B，在25℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析72小时，再改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色洛美沙星的偶联物。
实施例3(1)液A的制备称取洛美沙星10.00mg，羟基琥珀酰亚胺26.24mg，EDC 81.95mg，溶解在10ml二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与EDC的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺18.52mg溶于20ml pH为7.56，浓度为0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.56；分别称取1000.00mg BSA(分子量67,000)和57.51mg EDC，然后加入乙二胺溶液中，在22℃条件下搅拌反应3小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析80小时，然后改用蒸馏水透析20小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.56，浓度为0.02M的磷酸缓冲溶液中，配成12.0mg/ml的溶液，备用；(4)按洛美沙星与cBSA的摩尔比为50∶1量分别取溶液A和溶液B，在22℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应5小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析80小时，再改用蒸馏水透析20小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色洛美沙星的偶联物。
(7)用Sephadex-G75(Sigma)进行纯化分离，以PBS(0.01M，pH＝7.40)为洗脱液。收集洛美沙星的偶联物纯品。冻干得到洛美沙星的偶联物即洛美沙星免疫原固体粉末。
实施例4抗体的制备纯化及检测1.抗体的制备选择上述实施例2所制备的洛美沙星的偶联物作为免疫原进行动物免疫实验以制备抗体。
取1mg/ml的洛美沙星的偶联物的溶液1ml，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后，经皮下多点注射给四只体重2kg的雄性健康新西兰大白兔，1ml/只，15天后以同量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，二免以后，每隔15天加强免疫一次，抗原量减半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心脏采血，室温静置1小时，0-4℃过夜，13000转/分离心15分钟，收集血清，-20℃保存，备用。
2.抗体的纯化搅拌状态下向上述制备的抗血清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵溶液的终浓度为体积百分比是50％，0-4℃放置过夜，有沉淀物析出；以13000转/分离心15分钟，弃上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵溶液的终浓度为体积百分比是33％，0-4℃放置过夜，有沉淀物析出；以13000转/分离心15分钟，弃上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解。将上述纯化物用0.01M、pH7.4的PBS，0-4℃透析，换透析液3次，然后加入质量体积百分比为0.02％的叠氮化钠，-20℃保存，备用。
3.抗体的酶联免疫检测(1)效价测定方法采用常规的间接酶联免疫吸附检测法在96孔的酶标板上，用100μl/孔的洛美沙星与卵清蛋白的偶联物(10μg/ml)包被，0-4℃放置过夜，然后用PBST(1000mlpH7.4、浓度0.01M的PBS+体积百分比是0.05％Tween20)洗板四次；用250μl/孔封闭液(1000mlPBST+质量体积百分比是1％卵清蛋白)封闭，室温放置3小时，洗板；在洗去封闭液后，加100ul/孔的抗血清，室温放置2小时，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1∶1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 100ul，室温放置1小时，洗板；加入底物邻苯二胺显色，室温放置10min，再加入2MHCl终止。酶标仪A492nm检测。
经测定本发明所述洛美沙星的偶联物抗体效价达1∶6400。
效价的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀释倍数为该抗体的酶联免疫检测效价。
其中上述P为代测血清在某一稀释倍数测定的吸光度值，上述N为阴性对照在相应稀释倍数测定的吸光度值。
(2)特异性测定测定步骤与效价测定类似，在上述最佳的包被抗原与抗体浓度条件下，加抗体的同时加入洛美沙星溶液(从100ppm-1ppt)，与包被抗原竞争结合有限的抗体，洛美沙星药的浓度越高，抗体与包被抗原就结合得越少，从而显色越浅，吸光度值越低。再与空白对照(只加抗体，未加洛美沙星药的吸光度值)相比较，以确定抗体特异性。
通过测定抗体特异性较好，其最低检测限可达到1ppb，检测灵敏度较高，并且与喹诺酮类其它药物的交叉反应较小。
实施例5制备洛美沙星与卵清蛋白的偶联物(1)A的制备称取洛美沙星10.00mg，羟基琥珀酰亚胺16.40mg，EDC 54.63mg，溶解在4.6ml二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与EDC的活性中间体，备用；(2)溶液B的配制把卵清蛋白溶于pH为7.40，浓度为0.01M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；
(3)按洛美沙星与卵清蛋白的摩尔比为30∶1量分别取溶液A和溶液B，在25℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4小时，得到溶液C；(4)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析72小时，再改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(5)冻干上清液，得到白色洛美沙星与卵清蛋白的偶联物。
权利要求
1.一种洛美沙星的偶联物，由洛美沙星半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。
2.如权利要求1所述的洛美沙星的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质是牛血清蛋白。
3.如权利要求2所述的洛美沙星的偶联物，其结构通式如(I) 其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的洛美沙星的分子个数，所述n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量范围是6.6KDa～6.9Kda；上述偶联物显示出如下物化特征(1)外观白色粉末固体；(2)紫外吸收光谱288nm，322nm。
4.如权利要求3所述的洛美沙星的偶联物，其特征是所述n为整数5～15，BSA分子量范围是6.7KDa～6.8KDa。
5.权利要求1～4中任一项所述的洛美沙星的偶联物的制备方法，其特征是将洛美沙星与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
6.如权利要求5所述的洛美沙星的偶联物的制备方法，由如下步骤完成(1)溶液A的制备将洛美沙星，羟基琥珀酰亚胺，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，以摩尔比1∶2～8∶5～15溶解在二甲基甲酰胺中，反应生成洛美沙星与乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺的活性中间体，备用；(2)cBSA的制备在0～4℃条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38～7.56；以乙二胺∶BSA∶EDC的摩尔比为15～25∶1∶15～25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20℃±5℃条件下搅拌反应2～4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0～4℃条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，然后改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；在0～4℃，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；(3)溶液B的配制把cBSA溶于pH为7.38～7.56，浓度为0.01M～0.02M的磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；(4)按洛美沙星与cBSA的摩尔比为15～50∶1量分别取溶液A和溶液B，在20℃±5℃温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4～6小时，得到溶液C；(5)溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70～80小时，再改用蒸馏水透析20～30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0～4℃下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；(6)冻干上清液，得到白色洛美沙星的偶联物。
7.如权利要求6所述的洛美沙星的偶联物的制备方法，其特征是步骤(1)所述洛美沙星与羟基琥珀酰亚胺、EDC摩尔比为1∶5∶10。
8.如权利要求6所述的洛美沙星的偶联物的制备方法，其特征是步骤(2)所述乙二胺与牛血清蛋白、EDC的摩尔比为20∶1∶20。
9.如权利要求6所述的洛美沙星的偶联物的制备方法，其特征是步骤(4)所述的洛美沙星与牛血清蛋白的摩尔数比为30∶1。
10.权利要求1～4中任一项所述的洛美沙星的偶联物作为免疫原在制备洛美沙星特异反应抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通式(I)的洛美沙星的偶联物，由洛美沙星半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的洛美沙星的分子数，所述n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白，分子量范围是6.6KDa～6.9 KDa。本发明还公开了所述的偶联物的制备方法，即将洛美沙星与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明的洛美沙星的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达1∶6400的抗血清，其最低检测限为1ppb。本发明具有方法简便，快速，特异，准确的特点，为制备洛美沙星的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
文档编号G01N33/53GK1827645SQ200610043209
公开日2006年9月6日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者郗日沫, 卢圣欣, 张玉兰 申请人:山东大学