凝血因子viii聚合物偶联物的制作方法
【专利说明】凝血因子Vl I I聚合物偶联物
[0001] 本申请是申请日为2009年7月29日、申请号为200980130950. 3(国际申请号为 PCT/US2009/052103)、名称为凝血因子VIII聚合物偶联物的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请为于2007年3月29日申请的美国专利申请11/729,625的部分后续申请， 美国专利申请11/729,625要求分别在2006年6月6日及2006年3月21日申请的美国临 时专利申请60/790, 239及60/787, 968的优先权。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种包含与至少一种水溶性聚合物（包括聚环氧烷，例如聚乙二醇） 相结合的凝血因子Vin(FVIII)的蛋白质构建体。此外，本发明还涉及用于延长患有与 FVIII功能缺陷或缺乏相关的出血性疾病的哺乳动物的血液中FVIII的体内半衰期的方 法。
【背景技术】
[0004] 血浆中的凝血因子VIII (FVIII)以很低的浓度循环并且非共价地结合于冯威勒 布兰特因子（von Willebrand factor，VWF)。在止血期间，FVIII与VWF分开，并作为协同 因子，在钙和磷脂或者细胞膜存在的情况下，通过提高活化速度，用于受被活化的凝血因子 IX(FIXa)调节的凝血因子X(FX)的活化。
[0005] FVIII被合成为具有结构域A1-A2-B-A3-C1-C2的大约270-330kD的单链前体。当 FVIII被从血浆中纯化时（比如是"来源于血浆的"或者"血浆的")，FVIII由重链（A1-A2-B) 和轻链（A3-C1-C2)组成。轻链分子量是80kD，然而由于B结构域内的蛋白质水解，重链分 子量在90-220kD的范围内。
[0006] FVIII也可被合成为重组蛋白质用于出血性疾病的治疗使用。已经设计了不同的 体外试验来确定重组体FVIII (rFVIII)作为治疗药物的潜在有效性。这些试验模拟内源性 FVIII的体内效果。正如体外分析所测定的那样，FVIII的体外凝血酶处理导致它的促凝血 活性急剧增加和随后的减少。活化和失活与重链和轻链两者中的特异的限制性蛋白质水解 一致，限制性蛋白质水解可改变FVIII中的不同结合表位的可用性，比如允许FVIII与VWF 分离并且结合至磷脂表面、或者改变与某些单克隆抗体的结合能力。
[0007] FVIII的缺乏或者功能障碍与最常见的出血性疾病即甲型血友病相关。甲型血友 病的治疗手段选择是采用来源于血浆的浓缩物或者rFVIII浓缩物的替代疗法。FVIII水平 低于1%的重症甲型血友病患者通常采用预防性疗法，目的是在给药之间保持FVIII在1% 以上。考虑到血液循环中不同的FVIII产物的平均半衰期，该目的通常通过每周给药两至 三次FVIII来实现。
[0008] 在市场上有许多浓缩物用于甲型血友病的治疗。这些浓缩物之一是重组体产物 Advate?:,其在CHO细胞中被生产出来，并且由巴克斯特保健公司制造。在细胞培养工艺、 纯化、或该产品的最终配制中没有加入人或动物血浆蛋白或者白蛋白。
[0009] 目前许多FVIII浓缩物和治疗性多肽类药物的制造商的目标是开发下一代产品， 该产品具有增强的药效和药物动力学特性，同时保持所有其他的产品特征。
[0010] 治疗性多肽类药物可被蛋白水解酶快速降解并被抗体中和。这降低了它们的半 衰期和循环时间，因此限制了它们的疗效。已经有研宄显示，添加可溶性聚合物或者碳水 化合物至多肽可以抑制降解并延长多肽的半衰期。例如，将多肽类药物聚乙二醇化可保护 它们并且增强它们的药效和药物动力学特性（Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov2003;2:214-21)。聚乙二醇化方法可将聚乙二醇（PEG)的重复单元连接至多肽药 物。分子的聚乙二醇化可以导致药物对酶降解的抗性增加、体内半衰期增加、给药频率降 低、免疫原性降低、物理和热稳定性增加、溶解性增加、液体稳定性增加和凝聚减少。
[0011] 因此，比如通过聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII产物性能的一种方 法。现有技术状况已有不同的专利和专利申请记载：
[0012] 美国专利申请6, 037, 452描述了聚（环氧烷）FVIII或者FIX偶联物，其中蛋白质 通过所述FVIII的羰基被共价连接至聚（环氧烷）上。
[0013] EP1258497B1描述了一种制备FVIII与生物相容性聚合物的偶联物的方法。该专 利被R5i；Un等人的出版物（Bioconj Chem 2000 ;11:387-96)进行了补充。偶联物包括被删 除的且被单甲氧基聚乙二醇修饰的重组FVIII。偶联物降低了 FVIII功能，并且促凝血活性 随着修饰度的增加而快速地降低。
[0014] WO 4075923 A3描述了一种共聚物-FVIII分子偶联物，其包含多个偶联物，其中 每个偶联物都有一至三个被共价连接至FVIII分子上的水溶性聚合物。该FVIII分子的B 结构域已被删除。
[0015] 美国专利4, 970, 300描述一种被修饰的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白质 的不溶性偶联物被共价连接至无抗原性配体。
[0016] 美国专利6, 048, 720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶联物。
[0017] W094/15625描述了连接于聚乙二醇的FVIII，该聚乙二醇具有不超过5000道尔顿 的优选分子量。
[0018] 仍需要一种含有被连接的可溶性聚合物以便延长FVIII体内半衰期的FVIII，比 如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶联的大于10000道尔顿的PEG的全长FVIII，与非聚乙 二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同时提供延长的体内半衰期。
【发明内容】
[0019] 本发明涉及一种蛋白质构建体，其包含经由凝血因子VIII中的碳水化物部分而 偶联至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本发明还涉及其制备方法。
[0020] 在本发明的一个实施方式中，提供一种将水溶性聚合物偶联至FVIII中被氧化的 碳水化物部分的方法，包括在允许偶联的条件下将被氧化的碳水化物部分与被活化的水溶 性聚合物相接触。在一个相关的方面，所述水溶性聚合物选自下组：PEG、PSA和葡聚糖。在 另一方面，所述被活化的水溶性聚合物选自下组：PEG-酰肼、PSA-肼和醛活化的葡聚糖。在 本发明的另一方面，所述碳水化物部分是通过在包含NaIO 4的缓冲液中温育被氧化的。而 在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B结构域。
[0021] 在本发明的另一个实施方式中，提供根据如上所述方法中的任一方法所产生的被 修饰的FVIII。而在另一个实施方式中，提供一种蛋白质构建体，其包含：(a)凝血因子VIII 分子；和（b)至少一个连接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物通过一个以上位于凝血因子VIII的B结构域中的碳水化物部分而被连接于凝血因子 VIII。在本发明的一个相关的方面，所述水溶性聚合物选自下组：PEG、PSA和葡聚糖。
【附图说明】
[0022] 图1显示用SDS-PAGE及随后的免疫印迹法测定的rFVIII与PEG偶联后的条带变 宽和质量增加。
[0023] 图2显示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶联物与未偶联FVIII相比的药物动力学。 空心正方形：PEGrFVIII，200IU FVIII/kg 剂量。实心菱形：天然 rFVIII，200IU FVIII/kg 剂量。
[0024] 图3显示通过使用不同抗FVIII抗体的SDS-PAGE进行的聚乙二醇化位点的详细 分析。
[0025] 图4显示凝血酶诱导的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。
[0026] 图5显示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的结构域的条带。
[0027] 图6显示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同结构域的聚乙二醇化程度。
[0028] 图7显示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。
【具体实施方式】
[0029] 本发明是一种蛋白质构建体，其包含含有至少一部分完整B结构域的FVIII分 子，该FVIII分子连接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括：聚环氧烷、聚乙烯基吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉或者碳水化合物如聚唾液酸（PSA)或者葡聚 糖。在本发明的一个实施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道尔顿的聚乙二醇分 子。在另一个实施方式中，水溶性聚合物的分子量从大于10000道尔顿至大约125000道尔 顿，大约15000道尔顿至20000道尔顿，或者大约18000道尔顿至大约25000道尔顿。在 一个实施方式中，构建体保留了标准的治疗性FVIII产品的全部功能活性，并且与标准治 疗性FVIII产品相比较，体内半衰期得到延长。在另一个实施方式中，相对于天然凝血因 子 VIII，构建体保留至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、1