抑制凝血的抗体及其使用方法

专利名称：抑制凝血的抗体及其使用方法
本申请是申请日为1998年3月10日、申请号为98804169.3、发明名称为“抑制凝血的抗体及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
1.发明领域 本发明涉及新型抗体及使用该抗体抑制凝血的方法。特别地，本发明涉及能够与天然人组织因子高亲和力地特异结合的新型抗体。本发明抗体有多种应用，特别可用于降低体内凝血。
2.背景知识 凝血通过将血液流失减到最小而协助维持内环境稳定。一般说来，凝血需要血管损伤、血小板聚集、凝血因子和抑制纤维蛋白溶解。凝血因子通过一个包括由血管损伤到血块形成的级联反应起作用(主要参考L.Stryer著《生物化学》(Biochemistry)，第三版，W.H.Freeman公司，纽约；和A.G.Gilman著《治疗学的药理学基础》(The PharmacologicalBasis of Therapeutics)，第八版，McGraw Hill公司，纽约，第1311-1331页)。
众所周知，在凝血过程中，X因子(FX)激活为因子Xa(FXa)是一个关键性的步骤。一般说来，FX通过与一种具有催化活性的复合体结合而转变为FXa，该复合体中包括“组织因子”(TF)。TF是一种可被调控表达的细胞膜蛋白，它与VII/VIIa因子结合而产生具有催化活性的复合体(TF:VIIa)。血液凝块是在FXa介导的凝血酶原激活后形成的。通过使TF失活为不能理想地产生TF:VIIa复合体的非天然形式，就可以将凝血最小化。FXa的过量形成被认为有助于形成包括心瓣再狭窄在内的各种血栓。
血栓形成可能与一些侵入性的医学操作有关，例如心脏外科手术(如血管成形术)，腹胸外科手术，动脉外科手术，器具(如斯滕特固定模或导管)的安置，或动脉内膜切除术。血栓形成还可能会伴随各种血栓栓塞性失调和各种凝血病发生，分别例如肺栓塞(如房颤并发性栓塞)和弥散性血管内凝血。对体液的操作也会产生非预期性血栓，在输血或取液样以及涉及体外循环的操作(如心肺旁路外科手术)和透析中尤为如此。
抗凝剂常常被用来减轻或避免与血栓形成有关的血凝块。通过使用一种适当的抗凝剂或其混和物，包括一或多种香豆素衍生物(如华法林和双香豆素)，或带电聚合物(如肝素，水蛭素或hirulog)，常常可以使凝血降至最小甚或消除。例如，见Gilman等，见上；R.J.Beigering等，血液学年鉴(Ann.Hemathol.)，72177(1996)；J.D.Willerson，循环(Circulation)，94866(1996)。
然而，抗凝剂的使用经常伴随着副作用，如出血、重阻塞、“白凝块”综合症、刺激、出生缺陷、血小板减少和肝脏机能失常。长期使用抗凝剂特别会增加致命性疾病的危险性(例如见，Gilman等，见上)。
某些具有抗血小板活性的抗体也被用来减少各种血栓形成。例如，ReoProTM是一种治疗性抗体，它被常规性地施用，以缓解各种血栓栓塞性紊乱，如由血管成形术、心肌梗塞、不稳定性绞痛和冠状动脉狭窄导致的紊乱。另外，ReoProTM可被用作预防剂，以降低患心肌梗塞和绞痛的危险性(J.T.Willerson，循环，94866(1996)；M.L.Simmons等，循环，89596(1994))。
也已知某些抗凝血性抗体。特别地，已报道某些TF结合性抗体可用来抑制凝血，这可能是通过干预有催化活性的TF:VIIa复合体的组装而起作用的(例如见，Jeske等，SEM in THROM.and HEMO，22213(1996)；Ragni等，循环，931913(1996)；欧洲专利号No.0420937B1；W.Ruf等，Throm.Haemosp.，66529(1991)；M.M.Fiorie等，血液(Blood)，83127(1992))。
然而，现有的TF结合性抗体显示出一些明显的缺点，从而使其作为抗凝剂的适宜性减至最小。例如，现有的TF结合性抗体不具有作为理想抗凝剂的足够结合亲和力。相应地，对于许多血栓形成性疾病，为了弥补这种不太有效的结合亲和力，必须使用难以接受的高抗体水平才能够使凝血减至最小。进一步地，现有的TF结合性抗体不能有效地识别天然TF和非天然形式TF，也就是说，现有的抗体不具备足够的结合特异性。更进一步地，现有的TF结合性抗体不能阻止FX与TF和/或TF:VIIa复合体结合。
因此，人们希望有一种抗凝血抗体能够以高亲和力和选择性地结合天然人TF，从而抑制不希望的凝血和血凝块形成。人们更希望有能够阻止X因子与TF/VIIa复合体结合的这种抗凝血性抗体。
发明简述 我们目前已发现的抗体，它们通过与天然人TF高亲和力和高特异性地结合而具有较高的抗凝剂活性。本发明的抗体能够在体内有效抑制凝血。本发明的抗体能够结合单独的或者存在于TF:VIIa复合体中的天然人TF，有效阻止X因子结合TF或该复合体，从而减少凝血。
本发明的优选抗体是能特异性结合天然人TF的一个主要构象表位的单克隆抗体，该表位提供了一个极强的抗体结合位点。实际上，与前面提到的抗凝血性抗体相比，本发明的优选抗体与天然人TF的结合亲和力至少高约5倍以上，更通常是高至少约10倍以上。另外，本发明的优选抗体对天然人TF具有选择性，不会实质上结合非天然或变性TF。H36.D2.B7(由杂交瘤ATCC HB-12255分泌)为本发明的特别优选抗体。
本发明的优选抗体可结合TF，导致FX不能有效地结合TF/因子VIIa复合体，从而使得FX不能有效转变为其活化形式(FXa)。本发明的优选抗体通过有效阻止FX结合或靠近TF分子而能够抑制TF的功能。例如，见随后实施例3的结果。
本发明的优选抗体也不会显著抑制TF和VIIa因子的相互作用或结合，不会抑制TF:因子VIIa复合体相对于其它材料而非FX的活性。例如，见随后实施例4的结果。
本发明也提供了编码本发明抗体的核酸。H36.D2.B7可变区的核酸和氨基酸序列(SEQ ID NO1-4)示于附图中的

图1A和1B。
优选地，本发明提供抑制了凝血和血凝块形成的方法，和降低人TF水平的方法。
一般说来，本发明抗体可用以调节实际上任何由FX结合到TF或TF:VIIa复合体所介导的生物反应，包括以上讨论的凝血，炎症和其他疾病。
本发明的抗体特别可用于减缓各种血栓形成，尤其是阻止或抑制再狭窄，或侵入性医疗操作例如动脉或心脏外科手术(如血管成形术)之后的其它血栓形成。本发明抗体也可用于减少或有效消除由于使用医疗器具(例如导管，斯滕特固定模或其它医疗器具)造成的凝血。本发明的优选抗体可与许多抗凝剂、抗血小板剂和溶栓性组合物相容，从而允许以“鸡尾酒”形式施用，以加强或延长对凝血的抑制。
本发明抗体也能在哺乳动物，特别是人体的体外循环中用作抗凝剂。在这些方法中，将本发明的一或多种抗体在体外循环(例如在心肺旁路外科手术、器官移植外科手术或其它长时间外科手术中可能发生)之前或过程中施用于哺乳动物，其用量足以抑制凝血。
本发明抗体也可用作药物[特别是定向于与血块相互作用的药物，例如链激酶、组织纤溶酶原激活物(t-PA)或尿激酶]的载体。相似地，通过将适当的毒素与抗体相缀合，可以将本发明抗体用作细胞毒性剂。通过给哺乳动物施用有效量的本发明抗体，还可以将本发明抗体的缀合物用于降低哺乳动物、尤其是人体中的组织因子水平，该抗体共价连接了一种细胞毒素或效应物因子，以提供补体结合能力和细胞介导的抗体依赖性细胞毒性，从而使得抗体偶联物与表达组织因子的细胞接触，进而降低哺乳动物中的组织因子水平。
本发明抗体也被用于体内诊断方法中，包括天然人TF的体内诊断成像。
本发明抗体也可用于体外测定中，以检测包括体液(如血浆或血清)或组织(如活体解剖样本)在内的生物样本中的天然TF。更为特别地，可以竞争性或非竞争性方式应用各种异质和同质免疫测定，以检测生物样本中天然TF的存在，优选地检测其量。
本发明的这些测定对于确定病人有凝血或血块的确定性和可能性是很有用的。即，凝血通常伴随着TF在细胞(如排列于维管结构的细胞)表面表达。在没有凝血的情况下，TF通常不表达。所以，通过本发明的测定来检测体液样品中的TF可以预示凝血情况。
本发明的抗体也可用于从生物样品中制备基本纯的天然TF，特别是天然人TF。本发明抗体也可用于检测和纯化表达天然TF的细胞。
本发明抗体也可用作诊断试剂盒(例如用以检测、优选定量测定生物样品中的天然TF的试剂盒)的一个组分。本发明的其它方面于下文进行讨论。
插图的简要描述 图1A和1B显示H36.D2.B7轻链和重链可变区的核酸(SEQ ID NO1和3)和氨基酸(SEQ ID NO2和4)序列，划线部分(单线表示核酸序列，双线表示氨基酸序列)表示超变区(CDR或互补决定区)。
图2显示由ELISA或BIACore分析确定的抗组织因子抗体的结合常数(Ka)和解离常数(Kd)。
图3显示与抗组织因子抗体的预先温育对TF:VIIa复合体介导的FX激活的抑制作用。
图4显示通过抗组织因子抗体来抑制针对FVIIa特异性底物S-2288的TF/VIIa活性。
图5显示H36抗体在TF引发的凝血测定中增加凝血酶原时间(PT)的能力。
图6A和6B通过图表显示FXa形成和H36.D2抗体与rhTF摩尔比之间的关系。图6A在加FX前将H36.D2与TF:VIIa复合体预先温育。图6BH36.D2、TF:VIIa和FX同时加入。
图7显示在J-82细胞激活测定中H36.D2抗体对TF:VIIa活性的抑制作用。
图8A和8B表示点杂交，显示H36.D2抗体结合到rhTF上的一个构象表位。条带1-天然rhTF，条带2-用8M尿素处理过的天然rhTF，条带3-用8M尿素和5mM DTT处理过的天然rhTF。图8A中，印迹曝光约为40秒，而图8B中，印迹曝光120秒。
本发明详细描述 如上所述，本发明的优选抗体显示对天然人TF有高亲和性。特别地，本发明的优选抗体显示与天然人TF的结合常数(Ka，M-1)至少约1×108，这是由表面胞质基因组测定(特别是下述实施例I操作中的BIACore分析)确定的，更优选地，由表面胞质基因组测定确定的Ka(Ka，M-1)为至少约5×108，还要更优选对天然人TF的Ka(Ka，M-1)至少为大约1×1010。本发明抗体的这种显著结合亲和性与以前报道抗体的更低亲和性形成鲜明对照。
这样看来，本发明抗体可以使用相当低的有效浓度，例如，在体外测定中，如下文例3所述，可以使用相当低浓度的抗体来达到所需的TF功能抑制作用(如至少约95，98或99％抑制)。
优选的抗体对天然人TF也有高特异性，并且优选地不与非天然TF实质性结合。优选抗体不与非天然TF或其它免疫学上不相关的分子实质性结合，这可通过例如标准点杂交分析来验证(例如，通过此类点杂交测定，肉眼检测到不与或基本上不与非天然TF结合)。这里“非天然TF”指的是已被离液剂(choatropic agent)处理过而发生了变性的天然或重组人TF。典型的离液剂包括去污剂(如SDS)，混有二硫苏糖醇或β-巯基乙醇的尿素；盐酸胍等等。H36、H36.D2或H36.D2.B7抗体不与这些非天然TF实质性结合，例见下文实施例8中的点杂交测定结果。
如上所述，本发明的优选抗体也与TF结合，这样FX不能有效地与TF/VIIa复合体结合，从而FX不能有效转变为其激活形式(FXa)。本发明的特别优选抗体能够在甚至低TF浓度(如约1.0nM以下，或甚至是0.20nM或0.10nM以下)下强烈抑制FX与TF/VIIa复合体的结合活性，例如，抑制至少约50％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约90％或95％，这是通过诸如随后实施例3中所述的标准体外结合实验确定的，该实验包括在本发明抗体存在(即实验样品)和不存在(即对照样品)的情况下，将FX与TF:因子VIIa复合体接触，确定实验样品与对照样品之间FX转变为FXa的百分比差别。
在发明公开的方法和测定中，本发明抗体优选已基本纯化的抗体。“已基本纯化”指的是已与天然伴随组分分离的抗体或蛋白质。例如，通过使用标准的免疫亲和或蛋白A亲和纯化技术，可以利用天然TF作为抗原或蛋白A树脂从杂交瘤培养物中纯化出本发明抗体。相似地，通过使用本发明的抗体和标准免疫亲和纯化技术，可以获得基本纯的天然TF。特别地，当至少50％的总蛋白质(给定样品中总蛋白质的重量百分比)是本发明的蛋白质或抗体时，则抗体或蛋白质基本上比较纯。优选抗体或蛋白质占总蛋白质的60％(重量)以上，更优选至少75％(重量)，甚至更优选至少90％(重量)，最优选占总材料的至少98％(重量)。通过已知方法，如SDS(PAGE)凝胶电泳，柱层析(如亲和层析)或HPLC分析，可以很容易测定纯度。
本发明优选抗体(H36.D2.B7)的核酸序列(SEQ ID NO1和3)和氨基酸序列(SEQ ID NO2和4)见附图的图1A和1B。SEQ ID NO1和2分别是轻链可变区的核酸和氨基酸序列，SEQ ID NO3和4分别是重链可变区的核酸和氨基酸序列，在所有这些序列中下划线的是高变区(CDR或互补决定区)。
本发明的其它优选抗体与图1A和1B中的轻链或重链序列之一或两者有显著的序列相同性。更特别地，优选抗体包括与SEQ ID NO2和/或4有至少约70％同源性(序列相同性)的那些，更优选是与SEQ IDNO2和/或4有约80％或更高同源性的那些，还要更优选的是与SEQ IDNO2和/或4有约85％、90％或95％或更高同源性的那些。
本发明的优选抗体与SEQ ID NO2和4的高变区(图1A和1B中用双下划线表示)有高度序列相同性。本发明的特别优选抗体在其轻链可变区内具有与H36.D2.B7内轻链可变区的1，2或3个相应高变区[图1A中下划线表示的那些高变区，序列如下1)LASQTID(SEQ ID NO5)2)AATNLAD(SEQ ID NO6)；和3)QQVYSSPFT(SEQ ID NO7)]相同或有高度序列相同性(至少90％或95％序列相同性)的1、2或3个高变区。
本发明的特别优选抗体在其重链可变区内也具有与H36.D2.B7内重链可变区的1、2或3个相应高变区[在图1B中显示的那些高变区，序列如下1)TDYNVY(SEQ ID NO8)；2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ IDNO9)；和3)DVTTALDF(SEQ ID NO10)]相同或有高度序列相同性(至少90％或95％序列相同性)的1、2或3个高变区。
本发明的核酸优选足够长(最好至少约100，200或250个碱基对)，在适度严谨条件(此处称为“正常严谨”条件)下能够与SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO3序列结合使用在0.8M盐水/0.08M柠檬酸钠(SSC)缓冲液中含有20％甲酰胺的37℃杂交缓冲液，在37℃下用该SSC缓冲液洗涤一次仍能够保持结合。
更优选地，本发明的核酸(优选至少约100、200或250个碱基对)在下述高度严谨条件(此处称为“高度严谨”条件)下能够与SEQ IDNO1和/或SEQ ID NO3序列结合使用在0.9M盐水/0.09M柠檬酸钠(SSC)缓冲液中含有20％甲酰胺的42℃杂交缓冲液，在42℃条件下用此SSC缓冲液洗2次时能够保持结合。
本发明的核酸优选含至少20个碱基对，更优选含至少约50个碱基对，仍更优选本发明核酸含至少约100、200、250或300个碱基对。
一般说来，本发明的优选核酸能够表达具有本文公开的较佳结合亲合力和其它特性的本发明抗体。
本发明的优选核酸也与图1A和1B所示的轻链或重链序列之一或两者具有实质性的序列相同性。更特别地，优选核酸具有的序列与SEQID NO1和/或3有至少约70％同源性(序列相同性)、更优选有约80％或更多的同源性、仍然更优选有约85、90或95％或更多的同源性。
本发明的特别优选核酸序列与SEQ ID NO1和3的高变区(图1A和1B中下划线表示)具有高度序列相同性。特别优选的核酸包括编码抗体轻链可变区、并具有编码高变区的1，2或3个序列的那些核酸，所述1、2或3个序列与编码H36.D2.B7相应高变区的1、2或3个序列[图1A中下划线表示的高变区，序列如下 CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQ ID NO11)；2) GCTGCCACCAACTTGGCAGAT(SEQ ID NO12)；和3) CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(SEQ ID NO13)
相同或有高度序列相同性(至少90％或95％序列相同性)。
特别优选的核酸包括编码抗体重链可变区、并具有编码高变区的1，2或3个序列的那些核酸，所述1、2或3个序列与编码H36.D2.B7相应高变区的1、2或3个序列[图1B中下划线表示的高变区，序列如下 1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO14)； 2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQID NO15)；和 3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO16)
相同或有高度序列相同性(至少90％或95％序列相同性)。
本发明核酸已分离，这是指给定核酸通常构成所给组分内总核酸重量的至少约0.5％、优选至少约2％、更优选至少约5％。部分纯化的核酸构成所给组分内总核酸重量的至少约10％、优选至少约30％、更优选至少约60％。纯的核酸构成所给组分内总核酸重量的至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％。
本发明抗体能够用本领域普遍熟知的技术制备，通常是制成天然TF(通常是天然人TF)的纯化样品，优选纯化的重组人组织因子(rhTF)。截短的重组人组织因子或“rhTF”(由243个氨基酸组成，缺少细胞质结构域)尤其有利于用来产生本发明的抗体。抗体也能由含有天然TF具有而非天然TF没有的1或多个表位的免疫原性肽产生。这里所指的“天然TF”包括那些TF样品，包括那些rhTF。如上所述，尽管多克隆抗体也能使用，但通常优选单克隆抗体。
更特别地，可以通过给哺乳动物免疫接种单独的天然人TF纯化样品或上述的免疫原性肽，或将其与载体混合接种，从而制备该抗体。合适的哺乳动物包括典型的实验动物，如绵羊、山羊、兔、豚鼠、大鼠和小鼠。优选用大鼠和小鼠，尤其是小鼠，来获得单克隆抗体。向哺乳动物施用抗原可以通过一些适当途径中的任一种如皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射、肌肉注射或皮内注射。理想的免疫接种间隔、免疫剂量等可在相当宽的范围内变化，并可根据本文由经验决定。典型步骤包括在几个月内注射抗原几次。通过标准技术从被免疫动物的血清中收集抗体，并进行筛选以找出特异于天然人TF的抗体。通过使用形成杂交瘤细胞的标准融合技术，可由产生抗体的细胞制备单克隆抗体，并用那些细胞来产生单克隆抗体。见G.Kohler等，自然(Nature)，256456(1975)。这通常涉及将抗体产生细胞与无限增殖细胞系(如骨髓瘤细胞)融合以形成杂种细胞。另外，单克隆抗体也可用Huse等，科学(Science)，2561275(1989)的方法从细胞中产生。
一种合适的方案是在大约2-7个月的期间内给小鼠腹膜内免疫接种含有纯化rhTF复合体的组合物。然后可以从被免疫小鼠内取出脾脏细胞。在切出脾细胞之前测定被免疫小鼠血清内特异于rhTF的抗体效价。然后将切出的小鼠脾细胞与适当的同种或异种(优选同种)淋巴样细胞系融合，所述淋巴样细胞系具有如次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(HGPRT-)或胸苷激酶缺陷(TK-)之类的标记。优选用骨髓瘤细胞作淋巴样细胞系。将骨髓瘤细胞和脾细胞混合在一起，例如以骨髓瘤细胞与脾细胞之比约1-4的比率。可用聚乙二醇(PEG)方法融合细胞。见G.Kohler等，自然，见上。然后在诸如RPMI-1640之类的培养基中培养克隆的杂交瘤。见G.E.More等，美国医学学会杂志(Journal of American Medical Association)，199549(1967)。对融合步骤之后生长的杂交瘤通过例如放射免疫测定或酶免疫测定等方法进行筛选，分析其分泌能特异性结合纯化rhTF的抗体的情况，例如筛选出能结合纯化rhTF但不与非天然TF结合的抗体。优选采用ELISA方法进行筛选。在筛选中显示阳性结果的杂交瘤可进行扩增，并通过有限稀释法克隆。优选进行进一步筛选，以选出能结合溶液和人体液样品中的rhTF的抗体。分离出的抗体可用任何适当的免疫技术进一步纯化，包括亲和层析。按照布达佩斯条约，将能产生特别优选的H36.D2.B7抗体的杂交瘤培养物保藏于马里兰州Rockville的Parklawn Drive大街12301号(10852)的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。此杂交瘤培养物是于1997年1月8日保藏于ATCC的，保藏号为ATCC HB-12255。
为了人体治疗上的应用，可能期望合成嵌合抗体衍生物，例如，结合了非人类动物的可变区和人类恒定区从而使此抗体比相应的非嵌合型抗体在被试人体中的免疫原性更小的抗体分子。可以制备多种类型的这类嵌合抗体，例如包括制备人可变区嵌合体，其中部分可变区(尤其是抗原结合结构域的保守区)是人源的，而仅高变区是非人源的。关于人源化嵌合抗体及其制备方法的讨论也可参见S.L.Morrison，科学，2291202-1207(1985)；Oi等，生物技术(BioTechniques)，4214(1986)；Teng等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，807308-7312(1983)；Kozbor等，今日免疫学(ImmunologyToday)，47279(1983)；Olsson等，酶学方法(Meth.Enzymol.)，93-16(1982)。另外，也可利用转基因小鼠。例如，已经制成了携带人抗体所有组分的转基因小鼠，可用天然人TF对其免疫。然后可利用来自这种被免疫的转基因小鼠的脾细胞来产生能分泌可与上述天然人TF特异性相作用的人单克隆抗体的杂交瘤。见N.Louberg等，自然，368856-859(1994)；L.L.Green等，自然遗传学(Nature Genet.)，713-21(1994)；S.L.Morrison，美国国家科学院院报，816851-6855(1994)。
本发明抗体的核酸也可用聚合酶链式反应制备(见下文实施例1中所述引物)。一般可参考Sambrook等，分子克隆(MolecularCloning)(第2版，1989)。这类核酸也可用已知方法合成，例如磷酸三酯法(见IRL出版社的《寡核苷酸合成》(M.J.Gait1984年编))，或通过使用市售寡核苷酸自动合成仪合成。这样制备的本发明核酸可用来通过已知技术表达本发明的抗体。例如，通过已知方法，例如使用限制性内切酶在载体上制造缺口以便插入构建体、随后进行连接，可将编码本发明抗体的核酸插入至合适的载体上。然后将含有适当地有效连接了启动子序列的插入核酸序列的载体导入至宿主细胞中进行表达。一般参见Sambrook等，见上。可以基于与克隆步骤有关的因素，依经验选择合适的载体。例如，载体应该与所用宿主细胞相容，并带有合适的复制子。进一步地，载体必须能够容纳插入的核酸序列。合适的宿主细胞包括多种真核或原核细胞，例如大肠杆菌等等。
本发明抗体的分子量大小取决于数个因素而不同，例如，其计划用途以及该抗体是否包含一个缀合或重组融合的毒素、药物或可检测的标记等等。一般说来，本发明抗体的分子量大约为20-150KDa。这样的分子量能够很容易地通过诸如SDS-PAGE凝胶电泳及随后的蛋白质染色或Western印迹分析等分子大小测定方法来确定。
“本发明抗体”或其它相似术语指的是可与天然TF结合的完整免疫球蛋白和免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包含一个抗体结合位点(即能够特异结合天然人TF的peritope)。典型的抗体片段包括例如Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2片段、通过还原免疫球蛋白的二硫键而衍生的“半分子”、单链免疫球蛋白或其它适当的抗原结合片段(例见，Bird等，科学，第242-424页(1988)，Huston等，美国国家科学院院报，855879(1988)；Webber等，分子免疫学(Mol.Immunol.)，32249(1995))。抗体或其免疫活性片段可以是动物的(例如小鼠或大鼠之类啮齿类动物)，或嵌合形式(见Morrison等，美国国家科学院院报，816851(1984)；Jones等，自然，第321，522页(1986))。可以优选本发明的单链抗体。
相似地，“本发明核酸”指的是可表达产生本发明抗体的序列，本发明抗体是特指上文所定义的术语。
如上所述，可以将本发明抗体施用于哺乳动物，优选灵长类(如人)，以阻止或减少血栓形成，如心瓣再狭窄，这通常是以存在于含有一或多种药学上可接受的无毒性载体(如无菌水或盐水，乙二醇类诸如聚乙二醇，植物油等等)的组合物形式施用的。特别地，生物相容性的、可生物降解的乳酸聚合物、乳酸乙醇酸共聚物或聚环氧乙烷、聚氧丙烯共聚物可以作为有用的赋形剂来控制这里所述的含抗体的组合物的释放。其它具潜在利用价值的给药系统包括乙烯乙烯基乙酸共聚物颗粒、渗透泵，和可植入性灌输系统和脂质体。一般说来，本发明的抗凝血性组合物是溶液或悬浮液形式，优选含有约0.01％-10％(w/w)的本发明抗体，更优选含有大约0.01％-5％(w/w)的抗体。可以将抗体作为组合物中的唯一活性成分给药，或作为包括一或多种其它抗凝剂(如肝素、水蛭素或hirulog)、抗血小板剂(如ReoPro)或溶栓剂(如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶)的混合剂给药。另外，本发明的抗体可以在施用一或多种合适的抗凝剂、抗血小板剂或溶栓剂之前或之后施用本发明的抗体，以加强或延长所需的抗凝血活性。
也如上所述，可以利用本发明抗体来减少由于使用医疗器具而导致的潜在血液液固，这些医疗器械例如是植入性器具，如导管、斯滕特固定模等等。在一种优选方法中，可以在将器具与体液接触之前，用本发明抗体(例如，作为1mg/ml的盐溶液)对其进行处理。或者是或额外地，可将量足以使凝血最小化的本发明抗体与体液混合。
本发明的治疗性抗凝血性组合物适于非肠道或静脉内给药，特别是以液体溶液的形式给药。这类组合物可以单位剂量使用的形式方便地施用，它们可根据制药领域中的已知方法制备。见《诺明登药物科学手册》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，(Mack出版公司，Easton PA，(1980))。术语“单位剂量”指的是应用于物理上分离的单位中的本发明治疗组合物，适于灵长类(如人)使用的单位剂量，每单位中含有预定量的活性物质，经计算，结合需要的稀释剂或载体，可以产生所需的治疗效果。单位剂量取决于多种因素，包括待治疗的血栓形成类型及其严重程度，被试者凝血系统利用该抗体的能力，和期望对FX激活作用达到的抑制或中和程度。待给予的抗体精确量通常根据使用者的判断指导，然而，单位剂量一般说来取决于给药途径，其范围为每天10ng/kg体重到50mg/kg体重，更通常是每天10ng/kg体重到约100mg/kg体重。加强给药最初施用的合适方案也是可变的，典型情况是初次施用后，接下来以1或多小时的间隔通过随后注射或其它施用方法而重复用药。另外，可以使连续或间断性的静脉内灌注足够维持血液中至少约10纳摩尔浓度-10微摩尔浓度的抗体。
有些情况下，可能需要对本发明抗体进行修饰，以赋予其所需的生物学、化学或物理学特性。更特别地，将抗体与药剂(例如纤溶药物，如t-PA、链激酶或尿激酶)缀合(即共价连接)以提供纤维蛋白溶解活性可能比较有用。可通过几种方法获得这样的连接，包括使用一种连接分子，如异形双功能蛋白交联剂，例如SPDP，碳二亚胺等等，也可通过重组方法。
除了药物(诸如纤维蛋白溶解剂)之外，也能将本发明抗体与诸如植物或细菌来源的毒素缀合，如白喉毒素(即DT)、痢疾毒素(志贺毒素)、相思豆毒蛋白、霍乱毒素，蓖麻毒蛋白，皂草素，假单胞菌外毒素(PE)、美洲商陆抗病毒蛋白或gelonin。这类毒素的生物活性片段在本领域已研究得很清楚，包括如DT的A链和蓖麻毒蛋白的A链。毒素也可以是在细胞表面有活性的物质，例如磷脂酶(如磷脂酶C)。另一个例子是，毒素可以是化学治疗剂，例如Vendesine、长春花新碱、长春灭瘟碱、氨甲蝶呤、阿霉素、博来霉素或顺式铂氨，或者毒素可以是放射性核素，例如碘-131，钇-90，铼-188或铋-212(总见，Moskaug等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26415709(1989)；I.Paston等，细胞(Cell)，47641(1986)；Pastan等，“作为新型治疗剂的重组毒素”，生化年评(Ann.Rev.Biochem.)，61331(1992)；“嵌合毒素”，(Olsnes和Phil)，《药物理论》(Pharmac.Ther.)，25355(1982)；已公开的PCT申请号WO94/29350；已公开的PCT申请号WO94/04689；和美国专利号5,620,939)。而且，如上所述，除了毒素之外，本发明抗体还可与效应物分子(如IgG1或IgG3)缀合，当应用于哺乳动物时，会产生补体结合活性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
可以治疗有效量将此类抗体/细胞毒素或效应物分子缀合物施用于哺乳动物，优选灵长类(如人)，其中所述哺乳动物已知或被怀疑带有能表达TF的肿瘤细胞、免疫系统细胞或内皮细胞。这样的例子包括乳腺癌和肺癌，单核细胞和血管内皮。
除了上述的以外，本发明抗体也可与多种药剂缀合，例如药物、酶、激素、能够结合放射性核素的螯合剂，以及可用于诊断或治疗疾病的其它蛋白质和多肽。为了诊断目的，可将本发明的抗体以可检测性标记形式或非标记形式使用。例如，有多种标记适用于对抗体进行可检测性标记，例如放射性核素、荧光、酶、酶底物、酶的辅助因子、酶抑制剂、配基(如半抗原)等等。
也提供了一些诊断方法，包括体内诊断成像术[见例如A.K.Abbas，细胞和分子免疫学第328页(W.B.Saunders公司，1991)]。对于大多数体内成像应用，本发明抗体能够用如125I、32P、99Tc或其它可检测标记物进行可检测性标记，随后施用于哺乳动物，特别是人，给药持续足以使抗体与所需靶物质接触的预定量时间。然后，用已知步骤(如闪烁照相分析)扫描被试者，以探测抗体的结合情况。该分析能够帮助诊断和治疗一些血栓，诸如本文具体公开的那些。当与心脏外科手术、特别是血管成形术或其它会发生不希望的血凝块形成的手术过程联合使用以观察血凝块的发展或移动时，这种方法特别有用。
本发明抗体也能用来从生物样品中制备基本纯(例如至少约90％纯，优选至少约96％或97％纯)的天然TF，特别是天然人TF。例如，可以用前述方法(见如，L.V.M.Rao等，《血栓形成研究》(ThrombosisRes)，56109(1989))获得天然TF，通过将溶液与含有抗体的固相支持物混合以形成偶联反应混合物，可以进行纯化。典型的固体支持物包括平板如微量滴定板的壁，以及包括或由聚苯乙烯、聚氯乙烯、交联葡聚糖如SephadexTM(Pharmacia精细化学公司)、琼脂糖、聚苯乙烯珠(Abbott实验室)，交联形式的聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，硝酸纤维素或尼龙膜之类组成的支持物。然后可按照标准免疫技术，从固态支持物中以基本纯的形式分离TF。总见Harlow和Lane的《抗体实验室手册》(AntibodiesA Laboratory Manual)，CSH出版物，纽约(1988)和Ausubel等编《现代分子生物学方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，纽约(1989)。
也如上所述，本发明抗体可用于检测生物样品中的天然人TF，特别是与血块结合的天然TF。典型生物样品包括血浆、血清、唾液、尿液、粪便、阴道分泌物、胆汁、淋巴液、眼分泌物、脑脊液、细胞培养基和组织，特别是血管组织，如心脏组织。样品可由具有或怀疑患有下述情况的哺乳动物中适当获取，优选心瓣再狭窄，以及与侵入性医疗操作(如心肺旁路外科手术)有关的血栓；心脏病，如心肌梗塞，心肌病，心脏瓣膜疾病，不稳定的心绞痛，或心房纤维性颤动并栓塞；凝血病，包括散布性血管内凝血，器具如斯滕特固定模或导管的安置；休克(如败血性休克综合症)，血管创伤，肝病，中暑，肿瘤(如胰脏癌，卵巢癌或小肺细胞癌)，狼疮，惊厥，血管外周阻塞性疾病，和肾病。
对于这类测定，可用适当原子或分子，例如放射性碘、氚、生物素，或能够产生可检测产物的试剂，例如连接了如β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶之类酶的抗同种型抗体，或者荧光标记物(如荧光素或若丹明，按照已知方法进行。将生物样品与具可检测标记的抗体相接触后，能够从生物样品中分离出任何未反应抗体。标记物(或产物)可通过常规免疫方法检测，包括抗体捕捉测定，抗体夹心测定(三明治法测定)，RIA，ELISA，免疫沉淀，免疫吸附之类(见Harlow和Lane，见上；Ausubel等，见上)。任何标记物(或产物)比适宜对照样品中所检测到的更多表明生物样品中存在天然TF，更具体地说是存在血块。例如，本发明抗体能够被可探测性地标记，以通过诸如抗体捕捉测定，ELISA，抗体夹心法测定，RIA，免疫沉淀，免疫吸附等等标准免疫技术检测、优选地定量检测天然TF。在某些情况下，特别是当使用组织时，免疫技术可能包括用已知能基本保持蛋白质构象的试剂(如稀甲醛)进行组织固定。一般可见，Ausubel等，《现代分子生物学方案》，JohnWiley&Sons，纽约，(1989)；Harlow和Lane的《抗体实验室手册》，CSH出版，纽约，(1988)。
本发明抗体也可用于检测和纯化能表达天然TF的细胞，包括成纤维细胞、脑细胞、免疫细胞(如单核细胞)、上皮细胞，以及某些癌细胞。优选的检测和纯化细胞的方法包括常规免疫方法(如，流式细胞计量术诸如荧光激活细胞分选术，和immunopanning)。表达天然TF的细胞基本纯的群体在医疗和科研环境中都有用处，例如，可用来建立诸如培养细胞这样的细胞，以便筛选可结合TF的抗体。
本发明也提供了测试和诊断试剂盒，用以检测测试样品、特别是体液(如血液，血浆等等)或如上述的组织中天然TF、特别是天然人TF的存在情况。较好的试剂盒中包括本发明的一种被可检测性标记了的抗体。该诊断试剂盒可应用于任何可接受的免疫方式，如ELISA方式，以检测生物样品中天然TF的存在或其量。
此处所提到的所有文件均全文引入作为参考文献。
下面的非限制性实施例是本发明的解释示例。在以下实施例及别处中会提到H36和H36.D2。所指的那些抗体是与H36.D2.B7同样的抗体，但是H36是从母克隆获得的，H36.D2来自初级克隆，而H36.D2.B7则来自次级克隆。没有观察到这三种克隆在抑制TF的能力方面或其它物理特性方面有区别。
实施例1抗rhTF单克隆抗体的制备和克隆 抗rhTF的单克隆抗体按如下制备。
A.免疫和加强免疫 五只BALB/C雌鼠分别用10μg脂质化的纯rhTF免疫。先用Hunter’s Titermax佐剂对小鼠进行腹膜内致敏。最后三次加强免疫是在0.85％NaCl中施用的。在首次致敏后的2、5.5和6.5月进行加强免疫。所有加强免疫都是于腹膜内进行的，除了第一次是皮下进行的。最后一次加强免疫在融合前3天进行，使用量为20μg。
B.小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合 用PEG1500将来自一只免疫接种了rhTF的BALB/C小鼠脾脏的淋巴细胞与X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合。在暴露于PEG之后，将细胞在热灭活的胎牛血清中于37℃温育1小时。再将融合细胞重悬浮于RPMI1640中，并在37℃、10％CO2条件下培养过夜。次日细胞用RPMI1640铺板，并补加巨噬细胞培养物上清液。
C.进行ELISA 用于ELISA测定的平板用100μl含重组组织因子(0.25μg/ml)的碳酸盐缓冲液包被。所有步骤均在室温下进行。平板用BSA封闭，洗板，然后分别加入待测样品和对照。通过将平板与山羊抗小鼠HRP缀合物(Jackson免疫研究实验室)温育，然后使用ABTS过氧化物酶底物系统(Kirkegaad & Perry实验室)检测抗原/抗体的结合情况。在自动读板仪上于405nm波长下读出光吸收值。
D.稳定rhTF杂交瘤细胞系 融合后两周，开始用特异的rhTF ELISA对杂交瘤集落进行筛选。新集落的筛选持续三周。阳性克隆每1-2周检测一次，确定其抗体的连续生产，直至15个稳定的克隆得以确认并冻起来。
E.初级克隆和次级克隆 对每一个稳定的阳性杂交瘤进行一定程度的稀释克隆，以得到初级克隆。解冻细胞并在培养液中培养一小段时间，然后稀释到10个细胞/孔至0.1个细胞/孔。用抗rhTF ELISA检测初级克隆，将5到6个阳性克隆扩充培养并冻存。
从初级克隆H36.D2得到抗rhTF抗体的次级克隆H36.D2.B7，按上面所述的方法制备并冻存于液氮中。在96孔微量滴定板上制备初级克隆的4个不同稀释度；5细胞/孔，2细胞/孔，1细胞/孔，和0.5细胞/孔，以用于进行次级克隆。细胞用IMDM组织培养液稀释，该培养液中还含以下附加组份20％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％GMS-S，0.075％NaHCO3。为了确定能分泌抗rhTF抗体的克隆，在培养两周后，从0.2个细胞/孔的微量滴定板上5个独立孔中取出上清液，通过ELISA测定，如上述检测抗rhTF抗体的存在。所有5个克隆在ELISA测定中都显示出阳性结果，其中H36.D2.B7是最好的抗体生产者。在含有下述添加物的RPMI培养基中调整并扩充所有5个克隆20％胎牛血清(FBS)，2mML-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1％GMS-S，0.075％NaHCO3和0.013mg/ml的草乙酸。由细胞培养物上清液经蛋白质A亲和层析法纯化得到H36.D2.B7，并用FX激活测定法检测其抑制TF:VIIa的能力。结果表明H36.D2.B7与H36.D2抗体具有相同的抑制作用。所有细胞均冻存于液氮中。
F.从H36.D2.B7中分离总RNA 从2.7×105个H36.D2.B7杂交瘤细胞中分离得到269微克总RNA。总RNA的分离根据Qiagen公司RNeasy Midi试剂盒的说明书所述方法进行。RNA样品溶于水中，冻存于-20℃备用。
G.cDNA的合成和H36.D2.B7基因可变区的克隆 为了获取cDNA第一链，制备反应混合物，该混合物中包含5μg如上述分离的总RNA，重链(HC)下游引物JS300和轻链(LC)的下游引物OKA57(所有引物序列见下面)，RNase抑制剂，各种dNTP，DTT，和Superscript II反转录酶。将该混合物置于42℃孵育1小时，然后将反应管置于65℃孵育15分钟以终止转录。冷却下来后，向反应管中加入5个单位的RNase H，并在37℃孵育20分钟。将cDNA样品冻存于-70℃备用。
用以上制备的cDNA分别进行PCR(聚合酶链反应)，以克隆抗rhTF，H36.D2.B7的重链和轻链可变区(重链和轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列见图1A和1B)。共进行三轮PCR反应。第一轮用上游引物JS002和下游引物JS300在96℃，53℃和72℃进行35个循环的PCR反应制备重链，用上游引物JS009和下游引物OKA57在96℃，63℃和72℃进行35个循环的PCR反应制备轻链。第二轮与第一轮中所述相同地进行重链和轻链的PCR反应，只是制备重链时用pMC-18作为上游引物，制备轻链时用pMC-15作为上游引物。第三轮用H36HCF和H36HCR作为引物在96℃，60-65℃和72℃进行30个循环的PCR反应制备重链，用H36LCF和H36LCR作为引物在96℃，58℃和72℃进行30个循环的PCR反应制备轻链。
克隆H36.D2.B7重链和轻链可变区时所用引物如下 OKA 57 5′-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC-3′(SEQ ID NO17) JS300 5′-GAARTAVCCCTTGACCAGGC-3′(SEQ ID NO18) JS009 5′-GGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCMCARTC-3′(SEQ ID NO19) JS002 5′-ATTTCAGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTYCARCTKCARCARYC-3′ (SEQ ID NO20) pMC-15 5′-CCCGGGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKG-3′(SEQ ID NO21) pMC-18 5′-CCCGGGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTC-3′(SEQ ID NO22) H36HCF 5′-ATATACTCGCGACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGATCCAGCTGCA GCAGTC-3′(SEQ ID NO23) H36HCR 5′-GACCTGAATTCTAAGGAGACTGTGAGAGTGG-3′(SEQ ID NO24) H36LCF 5′-TTAATTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC-3′(SEQ ID NO25) H36LCR TAATCGTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCC (SEQ ID NO26) SEQ ID NO17-26中，K是G或T；M是A或C；R是A或G；S是C或G；V是A，C或G；W是A或T；Y是C或T。
实施例2-本发明单克隆抗体的结合活性 应用以上实施例1中制备的本发明单克隆抗体。依照标准方法(见Harlow和Lane，见前；Ausubel等，见前)，在大肠杆菌中表达rhTF分子并用免疫亲和层析纯化。单克隆抗体的结合常数(Ka)和解离常数(Kd)由ELISA测定和表面胞质基因组共振(也就是BIACore)测定来确定(见Harlow和Lane，见上；Ausubel等，见上；Altschuh等，生物化学，316298(1992)；和Pharmacia Biosensor公司的BIAcore方法)。BIACore测定中，依照生产厂家的指导，将rhTF固定在生物传感片上。测定每个单克隆抗体在四个抗体浓度(0.125nM，0.25nM，0.5nM和1nM)下的常数。
依照标准测定(M.M.Bradford，分析生物化学，72248(1976))，用牛血清白蛋白作为标准及一种可购买的染料试剂(Bio-Rad)，确定蛋白质浓度。
图2显示了每个抗rhTF单克隆抗体的结合和解离常数。在所有被检测的抗rhTF单克隆抗体中，单克隆抗体H36显示出结合速度最高(Ka＝3.1×1010M-1)和解离速率最低(Kd＝3.2×10-11M)。
实施例3-FXa特异性底物测定 一般来说，利用被以70/30的重量比存在于50mM Tris HCl，pH7.5，0.1％牛血清白蛋白(BSA)中的磷脂酰胆碱(0.07mg/ml)和磷脂酰丝氨酸(0.03mg/ml)脂化了的rhTF，在37℃进行上述实验30分钟。将5nM的脂化rhTF和5nM的FVIIa在37℃孵育30分钟制得预先形成的TF:VIIa复合体贮液。将该TF:VIIa复合体贮液等份分装并冻存在-70℃备用。纯化的人VII、VIIa和FX因子均得自Enzyme ResearchLaboratories，Inc.。FXa和FVIIa测试用缓冲液如下25mMHepes-NaOH，5mM CaCl2，150mM NaCl，0.1％BSA，pH7.5。
筛选能够阻断TF:VIIa介导的由FX至FXa的活化反应的单克隆抗体。在两步不连续步骤中确定FX的激活。第一步(FX激活)，在有Ca++存在时测定FX至FXa的转化。第二步(FXa活性测定)，用EDTA猝灭FX活化，并用FXa特异性显色底物(S-2222)来确定FXa的形成。S-2222和S-2288(见下面)显色剂均得自Chromogenix(Pharmacia Hepar Inc.销售)。FX的激活包括在1.5ml小离心管中，将反应液与先和抗rhTF抗体或缓冲液对照孵育过的0.08nM TF:VIIa孵育。反应液随后在37℃孵育30分钟，然后加入30nM FX，并于37℃再孵育10分钟。FX活性测定在96孔板上进行。从第一步的反应物中取出20微升样品，与每一孔中的等量EDTA(500mM)混合，然后加入0.144ml的缓冲液和0.016ml的5mM S-2222底物。反应物于37℃再孵育15-30分钟，然后加入0.05ml 50％乙酸以猝灭反应，再测定405nm处的光吸收值。从实验组(有抗体)和对照组(没有抗体)的OD405nm值计算出对TF:VIIIa活性的抑制能力。在有的实验中，同时加入抗hTF抗体、TF/VIIa和FX以检测结合竞争性。图3显示，H36.D2单克隆抗体(粗线)比检测的其它抗rhTF单克隆抗体能更大程度地抑制TF:VIIa对FX的活性(95％)。
实验例4-FVIIa特异性底物测定 进一步用FVIIa特异性底物测定来筛选单克隆抗体。在本测定中，首先将5nM脂质化rhTF与缓冲液(对照)或50nM抗体(实验组)在96孔板中于37℃孵育30分钟，接着加入5nM纯化的人FVIIa(VT＝0.192ml)并混和，于37℃孵育30分钟。再向每孔中加入8微升20mM FVIIa特异性底物S-2288贮液(终浓度0.8mM)，并在37℃孵育1小时。用0.06ml 50％乙酸猝灭反应后测定405nm处的吸收值。根据实验组和对照组样品的OD405nm值来计算对TF/VIIa活性抑制的百分比。
图4显示，无论是抗体预先与TF孵育(在VIIa加入之前)还是抗体加入到预先与VIIa孵育的TF(加入抗体前)中，H36抗体对于阻断TF/VIIa作用于S-2288底物的活性均不显著。这表明H36并不干扰TF和FVIIa间的相互作用(结合)，H36也不抑制TF:VIIa作用于肽底物的活性。
实验例5-凝血酶原时间(PT)测定 钙化血浆在加入促凝血酶原激酶(TF)后几秒钟内即凝成血块，这种现象称作“凝血酶原时间”(PT)。PT延长通常是抗凝血活性的一个有用指标(见Gilman等，同上)。
根据标准的方法，用商业上可购买的人血浆(Ci-Trol Control，一级，购自Baxter Diagnostics Inc.)来研究H36.D2抗体对PT的影响能力。在Ca++存在时加入脂化rhTF启动凝血反应，用自动凝固计时器(MLA Electra 800)监测凝血时间。向塑料双孔杯中注入0.2ml脂化rhTF(在含有0.1％BSA、14.6mM CaCl2、0.07mg/ml磷脂酰胆碱和0.03mg/ml磷脂酰丝氨酸的50mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液中)以开始PT测定。每个杯中含0.1ml血浆，该血浆已预先与0.01ml缓冲液(对照组)或抗体(实验组)孵育1-2分钟。H36.D2抗体抑制TF介导的凝血的水平根据TF标准曲线来计算，该曲线是以log[TF]对log(凝血时间)作图得到的。
图5显示，H36.D2抗体基本上抑制了TF引发的人血浆凝固。H36.D2抗体极大地增加了凝血酶原时间，表明该抗体是TF所引发凝血的一种有效抑制剂(抑制高达约90％)。
实验例6-FX与H36.D2抗体竞争结合TF:VIIa复合体 竞争实验在TF/VIIa、FX和H36.D2抗体间进行。图6A给出了实验结果。该实验中，预先形成的TF/VIIa复合体(0.08nM)先在分别含0.02nM、0.04nM、0.08nM和0.16nM H36.D2单克隆抗体的缓冲液中于37℃孵育30分钟，然后向TF/VIIa和H36.D2抗体的混合物中加入FX(30nM)，于37℃再孵育10分钟。如前所述加入EDTA以猝灭FX的活化反应。根据实验例3中所述FXa特异性测定方法检测由此产生的FXa的量。
图6B显示了另一组实验结果，该实验与上面所述步骤一致，只是同时加入H36.D2抗体、预先形成的TF:VIIa和FX以开始FX活化反应测定。
图6A和图6B中的数据表明，H36.D2抗体和FX竞争结合预先形成的TF/VIIa复合体。
实验例7-细胞培养物中TF活性的抑制 J-82是人膀胱肿瘤细胞系(可从ATCC处获取)，它大量地表达天然的人TF作为细胞表面蛋白。为了检测H36.D2抗体能否阻断FX结合细胞表面上的天然TF，在微孔板上存在FVII时进行J-82FX活化反应测试(见D.S.Fair等，生物化学杂志，26211692(1987))。向每个孔中加入2×105个细胞，并与50ng FVII、缓冲液(对照组)或抗TF抗体(实验组)一起于37℃孵育2小时。然后，用缓冲液轻轻漂洗每孔，向每孔中加入0.3ml FX(0.05mg/ml)，并置于室温30分钟。在某些实验中，同时加入抗体和FX，以检测对天然TF的结合竞争。然后，取出0.05ml等分液并加入已加有0.025ml 100mM EDTA的96孔滴定板中。根据上述实施例3中所述的FXa特异性测定方法检测FXa活性。对J-82细胞表面TF活性的抑制根据有抗体(实验组)和没有抗体(对照组)中的OD405nm来计算。
图7显示，H36.D2抗体结合J-82细胞膜上表达的天然TF，并抑制TF介导的FX活化反应。这些结果表明，抗体与FX竞争性地结合细胞表面上的天然TF。综合以下实施例8的数据，这些结果还表明，H36.D2抗体能结合细胞膜上天然TF的一个构象表位。
实验例8-H36.D2抗体对天然rhTF的特异性结合 H36.D2与天然和非天然rhTF结合的测定用简化的点印迹测定来评定。具体来说，将rhTF分别在下面三种缓冲液中稀释至30μg/ml10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0+8M尿素；以及10mMTris-HCl，pH8.0+8M尿素+5mM二硫苏糖醇(DTT)。在Tris缓冲液中的孵育能保持rhTF的天然形式，而用8M尿素和5nM DTT处理产生的是非天然(变性)rhTF。将每个样品在室温孵育24小时。孵育后，用甲醇预湿一张Millipore Immobilon膜(7×7cm大)，再用含20％甲醇的25mM Tris，pH10.4缓冲液湿润。待膜风干后，将每一样品约0.5μl、1μl和2μl(30μg/ml)滴在膜上，风干。用含5％(重量/体积)脱脂牛奶和5％(体积/体积)NP-40的PBS封闭膜后，用H36.D2抗体探查膜，然后与山羊抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(购自JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.)孵育。按生产厂家(Amersham)指导与ECL Western印迹试剂一起孵育后，将膜用保鲜膜(SaranWrap)包裹起来，对X光片曝光不同时间。
图8A显示，在Tris缓冲液或Tris缓冲液+8M尿素中，H36.D2单克隆抗体结合天然TF上的一个构象表位(泳道1和泳道2)。放射自显影曝光时间为40秒。但是，当天然TF被8M尿素+5mM DTT变性时，H36.D2的结合大大降低或丧失(泳道3)。图8B显示曝光过量的放射自显影，显示出H36.D2抗体对非天然(即变性)rhTF的残迹结合。过量曝光的时间约为120秒。单独用8M尿素处理可能是使天然rhTF部分变性，因为TF中的两个二硫键没有被还原。也可能是部分变性的TF在后面没有尿素的印迹过程中又重新折叠到天然状态。这些结果也清楚地区别出不结合变性TF的本发明优选抗体和以前报道的不加分别地结合构象表位和变性TF的抗体(见美国专利第5,437,864号，其中图18的Western印迹分析显示与经SDS变性的TF能结合)。
已参照其优选实施方案对本发明进行详细描述。然而，显然，本领域技术人员在参阅了本文公开内容后能对某作各种改动和改进，而不超出本发明的精神和范围。
序列表
(1)基本信息
(i)申请人Wong，Hing C.
Jiao，Jin-an
Esperanza，Nieves
Lawrence，Luepschen
(ii)发明名称抑制凝血的抗体及其使用方法
(iii)序列数目26
(iv)联系地址
(A)收件人Dike，Bronstein，Roberts&Cushman，LLP
(B)街道130Water Street
(C)城市Boston
(D)州名MA
(E)国家USA
(F)邮政编码02109
(v)计算机可读形式
(A)介质类型软盘
(B)计算机IBM兼容机
(C)操作系统DOS
(D)软件FastSEQ版本1.5
(vi)目前申请资料
(A)申请号
(B)递交日
(C)分类
(vii)在先申请资料
(A)申请号
(B)递交日
(viii)代理人/代理机构信息
(A)姓名Corless，Peter F
(B)登记号33,860
(C)参考/文档号46943-PCT
(ix)电信信息
(A)电话617-523-3400
(B)传真617-523-6440
(C)电传
(2)关于SEQ ID NO1的信息
(i)序列特征
(A)长度321个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO1
GACATTCAGA TGACCCAGTC TCCTGCCTCC CAGTCTGCAT CTCTGGGAGA AAGTGTCACC 60
ATCACATGCC TGGCAAGTCA GACCATTGAT ACATGGTTAG CATGGTATCA GCAGAAACCA 120
GGGAAATCTC CTCAGCTCCT GATTTATGCT GCCACCAACT TGGCAGATGG GGTCCCATCA 180
AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGCACAAAA TTTTCTTTCA AGATCAGCAG CCTACAGGCT 240
GAAGATTTTG TAAATTATTA CTGTCAACAA GTTTACAGTT CTCCATTCAC GTTCGGTGCT 300
GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A321
(2)关于SEQ ID NO2的信息
(i)序列特征
(A)长度107个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型蛋白质
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
(2)关于SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征
(A)长度351个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO3
GAGATCCAGC TGCAGCAGTC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC AGTGCAGGTA 60
TCCTGCAAGA CTTCTGGTTA CTCATTCACT GACTACAACG TGTACTGGGT GAGGCAGAGC 120
CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGATAT ATTGATCCTT ACAATGGTAT TACTATCTAC 180
GACCAGAACT TCAAGGGCAA GGCCACATTG ACTGTTGACA AGTCTTCCAC CACAGCCTTC 240
ATGCATCTCA ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTTT ATTTCTGTGC AAGAGATGTG 300
ACTACGGCCC TTGACTTCTG GGGCCAAGGC ACCACTCTCA CAGTCTCCTC A 351
(2)关于SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征
(A)长度117个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO4
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Thr Xaa Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
(2)关于SEQ ID NO5的信息
(i)序列特征
(A)长度7个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO5
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp
1 5
(2)关于SEQ ID NO6的信息
(i)序列特征
(A)长度7个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO6
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
(2)关于SEQ ID NO7的信息
(i)序列特征
(A)长度9个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO7
Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr
1 5
(2)关于SEQ ID NO8的信息
(i)序列特征
(A)长度6个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO8
Thr Asp Tyr Asn Val Tyr
1 5
(2)关于SEQ ID NO9的信息
(i)序列特征
(A)长度17个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO9
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn GlyIle Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
(2)关于SEQ ID NO10的信息
(i)序列特征
(A)长度8个氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型肽
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型N-末端
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO10
Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe
1 5
(2)关于SEQ ID NO11的信息
(i)序列特征
(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO11
CTGGCAAGTC AGACCATTGA T21
(2)关于SEQ ID NO12的信息
(i)序列特征
(A)长度21个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO12
GCTGCCACCA ACTTGGCAGA T21
(2)关于SEQ ID NO13的信息
(i)序列特征
(A)长度28个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO13
CAACAAGTTT ACAGTTCTCC ATTCACGT 28
(2)关于SEQ ID NO14的信息
(i)序列特征
(A)长度18个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO14
ACTGACTACA ACGTGTAC18
(2)关于SEQ ID NO15的信息
(i)序列特征
(A)长度51个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO15
TATATTGATC CTTACAATGG TATTACTATC TACGACCAGA ACTTCAAGGG C 51
(2)关于SEQ ID NO16的信息
(i)序列特征
(A)长度24个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO16
GATGTGACTA CGGCCCTTGA CTTC 24
(2)关于SEQ ID NO17的信息
(i)序列特征
(A)长度23个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO17
GCACCTCCAG ATGTTAACTG CTC 23
(2)关于SEQ ID NO18的信息
(i)序列特征
(A)长度20个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO18
GAARTAVCCC TTGACCAGGC 20
(2)关于SEQ ID NO19的信息
(i)序列特征
(A)长度35个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO19
GGAGGCGGCG GTTCTGACAT TGTGMTGWCM CARTC 35
(2)关于SEQ ID NO20的信息
(i)序列特征
(A)长度45个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO20
ATTTCAGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGARGT YCARCTKCAR CARYC 45
(2)关于SEQ ID NO21的信息
(i)序列特征
(A)长度33个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO21
CCCGGGCCAC CATGKCCCCW RCTCAGYTYC TKG 33
(2)关于SEQ ID NO22的信息
(i)序列特征
(A)长度35个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO22
CCCGGGCCAC CATGGRATGS AGCTGKGTMA TSCTC 35
(2)关于SEQ ID NO23的信息
(i)序列特征
(A)长度52个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO23
ATATACTCGC GACAGCTACA GGTGTCCACT CCGAGATCCA GCTGCAGCAG TC 52
(2)关于SEQ ID NO24的信息
(i)序列特征
(A)长度31个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO24
GACCTGAATT CTAAGGAGAC TGTGAGAGTG G 31
(2)关于SEQ ID NO25的信息
(i)序列特征
(A)长度29个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO25
TTAATTGATA TCCAGATGAC CCAGTCTCC29
(2)关于SEQ ID NO26的信息
(i)序列特征
(A)长度45个碱基对
(B)类型核酸
(C)链型单链
(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型DNA
(iii)假设否
(iv)反义否
(v)片段类型
(vi)最初来源
(xi)序列描述SEQ ID NO26
TAATCGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTCA GCTCCAGCTT GGTCC 4权利要求
1.能与天然人组织因子结合、而不与非天然组织因子实质性结合的抗体。
2.权利要求1的抗体，其特征在于该抗体对天然人组织因子的结合特异性与H36.D2.B7[ATCC HB-12255]大致相等或者更高。
3.对天然人组织因子的结合亲和性与H36.D2.B7[ATCC HB-12255]大致相等或者更高的抗体。
4.具有H36.D2.B7[ATCC HB-12255]的鉴定特征的抗体。
5.权利要求1的抗体，它是H36.D2.B7[ATCC HB-12255]。
6.能与天然组织因子结合形成复合体、抑制因子X与该复合体结合的抗体。
7.权利要求1的抗体，其特征在于该抗体是单克隆抗体。
8.权利要求1的抗体，其特征在于该抗体是嵌合抗体。
9.权利要求8的抗体，其特征在于其中含有人源的恒定区。
10.权利要求1的抗体，其特征在于该抗体是单链抗体。
11.含有与SEQ ID NO1序列有至少约70％相同的序列的抗体。
12.权利要求11的抗体，其特征在于该抗体含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所代表的序列。
13.含有与SEQ ID NO5-10至少之一序列有至少90％相同的一或多个高变区的抗体。
14.权利要求13的抗体，其特征在于该抗体含有SEQ IDNO5-10至少之一所代表的高变区。
15.含有编码能与天然人组织因子结合的抗体中至少一部分的序列的分离核酸。
16.权利要求15的核酸，其中所述单克隆抗体是H36.D2.B7[ATCC HB-12255]。
17.权利要求15的核酸，其特征在于该核酸含有SEQ ID NO1或者SEQ ID NO3。
18.权利要求15的核酸，其特征在于该核酸含与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3序列有至少约70％相同的序列。
19.权利要求15的核酸，其特征在于该核酸含编码与SEQ IDNO5-10至少之一序列有至少90％相同的抗体高变区的序列。
20.含有至少约100个碱基对、能在正常严谨条件下与SEQ IDNO1或SEQ ID NO3杂交的核酸。
21.权利要求20的核酸，其特征在于该核酸能在高严谨条件下与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3杂交。
22.权利要求15的核酸，其特征在于该核酸含与SEQ IDNO11-16至少之一序列有至少90％相同并编码高变区的序列。
23.含有权利要求15的核酸的重组载体，其特征在于该载体能表达可结合天然人组织因子的抗体的至少一部分。
24.含有权利要求23的载体的宿主细胞。
25.抑制哺乳动物内血液凝固的方法，包括给该哺乳动物施用有效量的能特异性结合天然组织因子的抗体，这样抗体与天然组织因子复合，因子X与该复合体的结合受到抑制。
26.权利要求25的方法，其中该复合体还含有因子VII/VIIa。
27.权利要求25的方法，其中该哺乳动物是人。
28.权利要求25的方法，其中该人患有或怀疑有血栓形成。
29.权利要求25的方法，其中该人患有或易患与侵入性医疗操作相关的再狭窄。
30.权利要求29的方法，其中该侵入性医疗操作是血管成形术、动脉内膜切除术、斯腾特固定模的安置、导管的使用、移植物移植术或动静脉分路的使用。
31.权利要求25的方法，其中该人患有与心血管疾病、传染病、肿瘤疾病或者血栓溶解剂的使用相关的血栓栓塞病。
32.权利要求25的方法，其中还包括施用抗血小板组合物、溶血栓组合物或者抗凝血组合物。
33.权利要求25的方法，其中该抗体是H36.D2.B7[ATCC HB-12255]。
34.降低哺乳动物内组织因子水平的方法，包括
给该哺乳动物施用治疗有效量的能与天然组织因子结合的抗体，所述抗体共价连接了细胞毒素或效应分子，以提供补体结合力和抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性；
抗体与表达组织因子的细胞接触，从而降低哺乳动物内的组织因子水平。
35.权利要求34的方法，其中所述表达组织因子的细胞是癌细胞、免疫细胞或内皮细胞。
36.生物样品中的组织因子的检测方法，包括
将生物样品与权利要求1的单克隆抗体接触，分析所述生物样品和单克隆抗体，以测定生物样品中组织因子的存在情况。
全文摘要
本发明包括能够通过与天然人TF以高亲和力和特异性地结合而提供超级抗凝血活性的抗体。本发明抗体能够有效抑制体内凝血。本发明抗体能够结合天然人TF，无论是单独的还是TF:VIIa复合体，有效阻抑因子X与TF或该复合体结合，从而减少凝血。本发明的优选抗体能够特异性地结合天然人TF上的一个主要构象表位，该表位提供了一个极强的抗体结合位点。
文档编号C12N1/21GK101298479SQ20081008235
公开日2008年11月5日 申请日期1998年3月10日 优先权日1997年3月10日
发明者黄庆祥, 焦进安, E·L·尼维斯, L·鲁普申 申请人:吉尼泰克公司