抑制血液凝固的抗体及其使用方法

专利名称：抑制血液凝固的抗体及其使用方法
技术领域：
本发明涉及新颖人类组织因子抗体，以及使用该抗体来抑制组织因子相关功能，例如血液凝固、血管新生、肿瘤转移、及发炎。本发明特别涉及新颖抗体，该抗体可以高度亲和力特异性结合天然人类组织因子，且防止第十因子(因子X)或第九因子(因子IX)的结合与活化。本发明抗体可用于多项应用用途，特别是用于体内减少血液凝固。
背景技术：
血液凝固可辅助止血，减少血液的流失。通常血液凝固需要有血管损伤、血小板凝集、凝血因子活化、及纤维蛋白的分解受抑制。凝血因子是通过一个级联作用，该级联涉及由血管损伤至血块形成(概略参考L.Stryer，生物化学，第3版，渥华福曼(W.H.Freeman)公司，纽约及A.G.Gilman等人，治疗学的药理基础第8版，麦克罗希尔(McGraw Hill)公司，纽约1311-1331页)。
一般认同因子X(FX)活化成为因子Xa(FXa)(或因子IX活化成为因子IXa)是血液凝固过程的关键步骤。通常FX(或FIX)系通过结合至包括组织因子(TF)的催化活性复合物而被转成FXa(或FIXa)。TF是一种以控制方式表达的细胞膜蛋白质，TF结合因子VII/VIIa来产生催化活性复合物。于FXa媒介的(或FIXa媒介的)凝血酶原活化后出现血凝块。通过将TF失活成为非天然形式，非天然形式无法最佳地产生TFFVIIa复合物，可最小化凝血。透过形成FXa(或FIXa)的凝血级联的过度活化，相信会促成多种血栓，包括血管再狭窄。
血栓与侵入性医疗手术有关，侵入性医疗手术例如心脏手术(例如血管成形术)、腹胸手术、动脉手术、周边血管绕道移植手术、移植物(例如血管支架或导管)置放手术或动脉内膜切除术。此外，血栓可能伴随着造成多种血栓栓塞疾病及凝血病变，例如中风、肺栓塞(例如带有栓塞的心房纤维震颤、心血管病或急性冠状症候群(例如不稳定性心绞痛或心肌梗塞)、动脉粥状硬化或其它血栓梗阻病、深部静脉血栓及弥漫性血管内凝血。操纵体液也导致形成非期望的栓子，特别于输血或体液采样，以及设计体外循环的手术(例如心肺绕道手术)及肾脏透析也导致形成栓子。
抗凝血剂常用来缓和或避免与血栓关联的血块。通过投予适当抗凝血剂或其混合物可最小化或消除凝血，抗凝血剂包括香豆素衍生物(例如杀鼠灵(warfarin)、卡马丁(Coumadin)或代卡马洛(dicumarol)或带电聚合物(例如肝素、低分子量肝素、水蛭素或类水蛭素(hirulog))或抗血小板剂(例如李欧波(ReoPro)、英特革林(Integrilin)、亚各司特(Aggrestat)、普拉威(Plavix)、提克里(Ticlid)或阿司匹林(aspirin))。参考Gilman等人，参见上文；R.J.Beigering等人，血液学年报，72177(1996)；J.D.Willerson，循环，94866(1996)。
但使用抗凝血剂经常带来副作用，例如出血、血管再梗阻、「白血块」症候群、刺激感、先天缺陷、血小板减少症、及肝功能不良。长期投予抗凝血剂特别会提高致命性疾病的风险(例如参考Gilman等人，参见上文)。
若干具有抗血小板活性的抗体也可用来缓和各种血栓。例如李欧波是一种治疗性抗体片段，李欧波例行性给药来缓和多种血栓栓塞病，例如因血管成形术、心肌梗塞、不稳定性心绞痛及冠状动脉狭窄等所引起的血栓栓塞病。此外，李欧波可用作为预防用药，来降低心肌梗塞及心绞痛的风险(J.T.Willerson，循环，94866(1996)；M.L.Simmons等人，循环，89596(1994))。
也已知若干抗凝血抗体。特别曾经报告某些TF结合抗体可抑制血液凝固，推定TF结合抗体系通过干扰催化活性TFFVIIa复合物的组装来抑制凝血(例如参考Jeske等人，SEM于血栓及血液，22213(1996)；Ragni等人，循环，931913(1996)；欧洲专利第0 420 937 B1号；W.Ruf等人，Throm.Haemosp，66529(1991)；M.M.Fiorie等人，血液，83127(1992))。
但目前的TF结合抗体有显著缺点，因而不适合用作为抗凝血剂。例如目前TF结合抗体不具有显著结合亲和力来获得最佳抗凝血活性。因此对于多种血栓疾病，为了弥补TF结合抗体的此种结合亲和力不足，必需投予无法接受的高剂量抗体来最小化血液的凝固。
如此希望有一种抗凝血抗体，其以高度亲和力及选择性结合天然人类TF，因而抑制非期望的血液凝固、及血块的生成。进一步希望有一种抗凝血抗体，其可防止因子X(或因子IX)与TFFVIIa复合物的结合。

发明内容
现在发现抗体通过以高度亲和力及特异性结合天然人类TF而提供优异抗凝血活性。本发明的抗体可于体内有效抑制血液凝固。本发明抗体可单独或呈TFFVIIa复合物形式结合天然人类TF，有效防止因子X(或因子IX)结合至TF或该复合物，因而减少血液的凝固。
优选本发明的抗体为单克隆抗体，特异性结合天然人类TF的主要构象抗原决定簇(conformational epitope)，该抗原决定簇提供意想不到的强力抗原决定簇。确实，本发明的优选抗体可以比先前技术抗凝血抗体所具有的结合亲和力，高至少约5倍，更典型高至少约10倍的结合亲和力而结合至天然人类TF。此外，优选本发明抗体对天然人类TF具有选择性，实质上不会结合至非天然TF或变性TF。H36.D2.B7(融合瘤ATCC HB-12255所分泌，通称为H36)乃本发明的特佳抗体。
优选本发明抗体结合TF，让FX(或FIX)无法有效结合至TFFVIIa复合物，因此FX(或FIX)不会被有效转成其活性形式(FXa或FIXa)。优选本发明抗体通过有效阻断FX(或FIX)的结合TF分子或接近TF分子而抑制TF功能。例如参考后文实施例3的结果。
优选本发明抗体不会显著抑制TF与因子VIIa间的交互作用或结合，或不会显著抑制TFFVIIa复合物对FX及FIX以外的材料的活性。例如参考后文实施例4的结果。
本发明也提供编码本发明抗体的核酸。H36.D2.B7的可变区的核酸序列及氨基酸序列(SEQ ID NOS1-4)显示于附图第1A及1B图。
在优选方面，本发明提供抑制血液凝固及血块生成的方法，以及降低人类TF浓度的方法。
通常，本发明抗体可用于调节实质上任一种通过FX(或FIX)结合至TF或TFFVIIa复合物所媒介的生物反应，包括前文讨论的血液凝固、发炎、肿瘤血管新生及肿瘤转移及其它病症。
本发明抗体特别可用于缓和多种血栓，特别预防或抑制血管再狭窄，或预防或抑制侵入性医疗手术例如动脉手术或心脏手术(例如血管成形术)后发生血栓。本发明抗体也用来减少或甚至有效消除于非手术性心血管病，因血液凝固活化所造成的血栓梗阻，该心血管病包括(但非限制性)冠状动脉病、急性冠状症候群(例如不稳定性心绞痛或心肌梗塞)及动脉粥状硬化。本发明抗体也可用来减少或甚至有效消除因使用医疗设施(例如导管、血管支架或其它医疗装置)造成的血液凝固。优选本发明抗体可与多种抗凝血剂组合物、抗血小板组合物及血栓溶解组合物兼容，因此允许以混合液方式给药来增强或延长血液凝固的抑制效果。
本发明抗体也可用于哺乳类特别人类的体外循环做为抗凝血剂。于此种方法，一或多种本发明抗体以足够抑制凝血用量，于体外循环前或体外循环中，例如可能出现于心肺旁路手术、器官移植手术或其它长时间手术前或手术中给药。
本发明抗体也可用作为药物载剂，特别系用作为锁定目标与血块交互作用的药物，例如链激酶、组织胞质素原活化剂(t-PA)或尿激酶。同理本发明抗体可通过共轭适当毒素至抗体而用作为细胞毒剂。本发明抗体的共轭物也可用来降低哺乳动物体特别为人体的组织因子浓度，使用方式系通过对哺乳类投予有效量的本发明抗体，该抗体共价键联至细胞毒剂或效应物分子来提供补体固定能力、及抗体相依性细胞媒介的胞毒性，如此抗体共轭物接触可表达组织因子的细胞因而降低于哺乳动物体的组织因子浓度。
本发明抗体也可用于活体诊断方法，包括天然人类TF的活体诊断用造影。
本发明抗体也可用于试管试验检定分析，来检测天然标本包括体液(例如血浆或血清)或组织(例如生检标本)的天然TF。特别多种非同质免疫检定分析及同质免疫检定分析可以竞争方式或非竞争方式用来检测生物标本是否存在有天然TF，且优选检测天然TF的含量。
此等本发明的检定分析高度可用于测定有凝血或血块病人的存在或存在的可能。换言之，血液凝固通常伴随有细胞表面的TF表达，且系由于细胞表面的TF表达结果，该等细胞例如为单核细胞、巨噬细胞以及血管内部的内皮细胞。如此通过本发明的检定分析检测体液标本的TF将可指征血液凝固。
本发明抗体也可用来由生物标本制备实质纯质的天然TF，特别天然人类TF。本发明抗体也可用于检测的纯化可表达天然TF的细胞。
本发明抗体也可用作为诊断试剂盒的一种组成元体，例如用来检测生物标本的天然TF且优选定量天然TF。
本发明也提供可特异性结合至人类组织因子TF而形成复合物的人源化抗体。优选具体实施例中，血液因子X或因子IX结合至复合物显著受抑制。优选人源化抗体包括至少一个鼠互补决定区(CDR)，且更佳一、二、三或四个此种鼠CDRs。此外提供此种人源化抗体的TF结合片段。
于另一方面，本发明提供抑制哺乳类动物血液凝固的方法，包括对该哺乳类动物投予有效量的人源化抗体或其片段，其特异性结合至人类组织因子(TF)来形成复合物。用于该方法的优选抗体可显著减少因子X或因子IX结合至复合物。优选方法进一步包括抗体与TF或TFFVIIa复合物间形成特异性复合物来抑制凝血。
本发明也提供抑制哺乳类动物血液凝固的方法，包括对该哺乳类动物投予有效量的一种人源化抗体或其片段，其包含至少一个鼠互补决定区(CDR)。优选用于该方法的人源化抗体可特异性结合至人类组织因子(TF)来形成复合物。优选结合至复合物的因子X或因子IX显著减少。优选方法进一步包括形成抗体与TF间的特异性复合物来抑制凝血。
本发明的其它方面讨论如后。


第1A及1B图显示H36.D2.B7的轻链可变区及重链可变区的核酸序列(SEQID NOS1及3)及氨基酸序列(SEQ ID NOS2及4)，超可变区(CDRs或互补决定区)的下方划线(核酸序列下方划单线，而氨基酸序列下方划双线)。
第2图显示藉ELISA或BIACore分析测得抗组织因子抗体的结合常数(Ka)及解离常数(Kd)。
第3图显示通过与抗组织因子抗体前培养来抑制TFFVIIa复合物媒介的FX的活化的抑制作用。
第4图显示藉抗组织因子抗体抑制TFFVIIa对FVIIa特异性产色基质S-2288的活性的抑制作用。
第5图显示H36抗体于TF引发凝血检定分析延长凝血酶原时间(PT)的能力。
第6A及6B图以线图显示FXa的形成与H36抗体对rhTF摩尔比间的关系。第6A图于添加FX前，H36与TFFVIIa复合物前培养。第6B图H36、TFFVIIa及FX系同时添加。
第7图显示于J-82细胞活性检定分析，藉H36抗体抑制TFFVIIa活性的抑制作用。
第8A及8B图为墨点分析代表图，显示H36抗体结合rhTF的构象抗原决定部位。线道1-天然rhTF、线道2-以8M尿素处理的天然rhTF、线道3-以8M尿素及5mM DTT处理的天然rhTF。第8A图中墨点暴露约40秒；第8B图中墨点暴露120秒。
第9A-B图为略图显示人IgG1-cH36 HC可变区转化载体及表达载体。HC转化载体(9A)及HC表达载体(9B)。
第9C-D图为略图显示人IgG4-cH36 HC可变区转化载体及表达载体。HC转化载体(9C)及HC表达载体(9D)。
第10A-B图为略图显示cH36 LC可变区转化载体及表达载体。LC转化载体(10A)及LC表达载体(10B)。
第11图为略图显示人源化抗-TF IgG1抗体表达载体(pSUN 34)的质体映像图。
第12A-D图为略图显示部分人化及全部人化轻链(LC)可变区的序列。cH36的轻链CDR序列显示于第12B-D图。定名为「LC-09」的序列为全人化LC构架区的代表。
第13A-D图为部分人化及全部人化重链(HC)可变区的序列。cH36及HC-08的重链CDR序列显示于第13B-D图。定名为「HC-08 」的序列为完全人化HC构架区。
第14A-B图为略图显示人化IgG1抗组织因子抗体(hOAT)(IgG1)恒定区。
第15A-B图为略图显示人化IgG4抗组织因子抗体(hFAT)(IgG4)恒定区。
具体实施例方式
如前文讨论，本发明的优选抗体可抑制对天然人类TF的实质亲和力。特别本发明的优选抗体具有用于天然人类TF的解离常数(Ka，M-1)，藉表面质粒基因体分析(特别根据后文实施例1程序的百欧可(BIACore)分析)至少约为1×108，更佳藉表面质粒基因体分析测得至少约5×108，又更佳用于天然人类TF的Ka(Ka，M-1)藉表面质粒基因体谐振分析测得至少约为1×1010。此种本发明抗体的实质结合亲和力与先前报告抗体的远较低结合亲和力形成尖锐对比。
就此方面而言，可使用相当低有效浓度的本发明抗体，例如相对低浓度抗体可用于试管试验检定分析(例如后文实施例2的说明)用来视需要抑制TF功能(例如至少约95、98或99％抑制)。
优选抗体对天然人类TF也有高度特异性，优选不会实质上结合非天然TF。优选抗体例如藉标准墨点检定分析测得不会实质上结合非天然TF、或其它免疫上不相关分子(例如藉此墨点分析以视觉检测未结合至非天然TF，或实质未结合至天然TF)。此处所述「非天然TF」表示天然人类TF或重组人类TF其已经使用趋混沌剂处理，故TF被变性。典型趋混沌剂包括清洁剂(例如SDS)、尿素组合二硫赤丝醇或β-巯基乙醇；胍盐酸盐等。H36、H36.D2或H36.D2.B7抗体不会实质结合至此种非天然TF。例如参考后文实施例8结果，该例为墨点分析。
如前文讨论，本发明的优选抗体也结合TF，让FX(或FIX)不会有效结合至TFFVIIa复合物，因此FX(或FIX)不会有效转成其活性形式(FXa或FIXa)。特佳本发明抗体将强力抑制FX被TFFVIIa复合物活化，例如抑制达至少约50％，更佳至少约80％及又更佳至少约90％或95％，甚至于低TF浓度，例如低于约1.0nM TF，或甚至低于约0.20nM TF或0.10nM TF也可强力抑制，如藉标准试管结合检定分析测定，例如后文实施例3所述，该检定分析包括于有(亦即实验标本)以及无(亦即对照标本)本发明抗体存在下，让FX(或FIX)接触TFFVIIa复合物，以及测定实验标本与对照标本FX转成FXa(或FIX转成FIXa)间的差异百分比。
本发明抗体当用于揭示方法及检定分析，优选实质为纯质。述及抗体为「实质纯质」表示抗体或蛋白质已经与天然伴随的成分分离。例如通过使用标准免疫亲和纯化技术或蛋白质A亲和纯化技术，本发明抗体可通过使用天然TF作为抗原或蛋白质A树脂而由融合瘤培养纯化。同理，天然TF可通过使用本发明抗体，使用标准免疫亲和纯化技术，而以实质纯质形式获得。特别当总蛋白质中的至少50％(于指定减低的总蛋白质重量百分比)为本发明抗体或蛋白质时，该抗体或蛋白质为实质纯质。优选该抗体或蛋白质至少占总蛋白的60wt％，更佳至少75wt％，又更佳至少90wt％，及最佳占总物质的至少98wt％。纯度方便藉已知方法检定分析，该已知方法例如SDS(PAGE)凝胶电泳、管柱层析术(例如亲和层析术)或HPLC分析。
本发明优选抗体(H36.D2.B7)的氨基酸序列(SEQ ID NOS1及3)及氨基酸序列(SEQ ID NOS2及4)显示于附图第1A及1B图。SEQ ID NOS1及2分别为轻链可变区的核酸及氨基酸，以及SEQ ID NOS3及4分别为重链可变区的核酸及氨基酸，于全部序列下方有高度可变区(CDRs或互补决定区)。
其它优选本发明抗体具有实质氨基酸序列同第1A及1B图所示轻链序列或重链序列的任一者或二者。特别优选抗体包括与SEQ ID NOS2及/或4具有至少约70％同构型(氨基酸序列同源性)的抗体，更佳与SEQ ID NOS2及/或4有至少约80％或以上同构型，又更佳于SEQ ID NOS2及/或4有约85、90或95％或以上同构型的抗体。
优选本发明抗体与SEQ ID NOS2及4的超可变区(于第1A及1B图以下方划双线显示)具有高度氨基酸序列同源性。特佳本发明抗体具有一、二或三个轻链可变区的超可变区，其与H36.D2.B7的轻链可变区的对应超可变区「该等超可变区以下方划线显示于第1A图如后1)LASQTID(SEQ ID NOS5)；2)AATNLAD(SEQID NOS6)；及3)QQVYSSPFT(SEQ ID NOS7)]中的一、二或三者有高度序列同源性(至少90％或95％氨基酸序列同源性)或为完全相同。
特佳本发明抗体具有重链可变区的一、二或三个超可变区，其与H36.D2.B7的重链可变区的对应超可变区「该等超可变区以下方划线显示于第1B图如后1)TDYNVY(SEQ ID NO8)；2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO9)；及3)DVTTALDF(SEQ ID NO10)]中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％氨基酸序列同源性)或为完全相同。
本发明核酸优选长度(优选至少约100、200或250碱基对)于下列中等苛刻条件(于此处称作为「正常严苛度」条件)下足够结合至SEQ ID NO1及/或SEQ ID NO3的序列使用包含20％甲醯胺于0.8M食盐水/0.08M柠檬酸钠(SSC)缓冲液的杂交缓冲液于37℃温度，于37℃使用该SSC缓冲液洗涤一次时仍然保持结合。
更佳本发明核酸(至少约100、200或250碱基对)将于下列高等苛刻条件(于此处称作为「高严苛度」条件)下足够结合至SEQ ID NO1及/或SEQ ID NO3的序列使用包含20％甲醯胺于0.9M食盐水/0.09M柠檬酸钠(SSC)缓冲液的杂交缓冲液于42℃温度，于42℃使用该SSC缓冲液洗涤两次时仍然保持结合。
本发明核酸优选包含至少20碱基对，更佳至少约50碱基对，又更佳本发明核酸包含至少约100、200、250或300碱基对。
通常优选本发明核酸将表达本发明抗体，该抗体具有优选结合亲和力及其它如此处揭示的性质。
优选本发明核酸具有与第1A及1B图所示轻链序列或重链序列中的任一者或二者的实质序列同源性。特别，优选核酸包含一序列其具有与SEQ ID NOS1及/或3，至少70％同构型(核酸序列同源性)，更佳与SEQ ID NOS1及/或3约80％或以上同构型，又更佳与SEQ ID NOS1及/或3具有约85、90或95％或以上的同构型。
特佳本发明的核酸序列与SEQ ID NOS1及3的超可变区(以下方划线显示于第1A及1B图)有高度序列同源性。特佳核酸包括编码抗体轻链可变区，以及具有一、二或三个序列其编码超可变区，以及与编码H36.D2.B7的对应超可变区「该等超可变区以下方划线显示于第1A图如后1)CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQID NO11)；2)GCTGCCACCAACTTGGCAGAT(SEQ ID NO12)；及3)CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(SEQ ID NO13)]的编码序列中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％核酸序列同源性)或为完全相同。
特佳核酸也编码抗体重链可变区，以及具有一、二或三个序列其编码超可变区，以及与编码H36.D2.B7的对应超可变区[该等超可变区以下方划线显示于第1A图如后1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO14)；2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO15)；及3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO16)]的编码序列中的一、二或三者具有高度序列同源性(至少90％或95％核酸序列同源性)或为完全相同。
本发明核酸经分离，通常组织存在于一指定分量的总核酸至少约0.5％，优选至少约2％及更佳至少约5％重量比。特别纯质的核酸组成存在于一指定分量总核酸的至少约10％，优选至少约30％，及更佳至少约60％重量比。纯质核酸组成存在于一指定分量总核酸的至少约80％，优选至少约90％，及更佳至少约95％重量比。
本发明抗体可通过业界一般已知技术制备，典型产生天然TF的纯化标本，典型为天然人类TF，优选为纯化重组人类组织因子(rhTF)。以截头重组人类组织TF或「rhTF」(由243氨基酸组成，且缺胞质领域)特佳用于产生本发明抗体。抗体也可由免疫原性胜产生，该胜包含一或多个天然TF的抗原决定部位，而非天然TF不具有该等抗原决定部位。此处述及「天然TF」包括此种TF标本，包括此种rhTF。如前文讨论，通常以单克隆抗体为佳，但也可使用多株抗体。
特别抗体可通过使用天然人类TF的纯化标本或如前文讨论的免疫原性胜 ，单独使用或与载剂复合用来免疫接种哺乳动物而制备。适当哺乳动物包括典型实验动物例如绵羊、山羊、兔、天竺鼠、大鼠及小鼠。以大鼠及小鼠特别以小鼠用来获得单克隆抗体为佳。抗体可藉多种适当途径例如皮下注射、腹内注射、静脉注射、肌肉注射或皮内注射等多种途径的任一种投予哺乳类。最佳免疫接种时间间隔、免疫接种剂量等可于相当宽广范围改变，可基于此处揭示以实验决定。典型程序涉及经数个月时间注射抗原数次。抗体系藉标准技术由经免疫接种动物的血清收集，抗体经衰减来找出对天然人类TF的特异性抗体。单克隆抗体可于可产生抗体的细胞制造，以及通过形成融合瘤细胞的标准融合技术用来产生单克隆抗体的细胞制造。参考Huse等人，自然，256456(1975)。典型地如此涉及抗体产生性细胞与永生细胞系(例如骨髓瘤细胞)融合来制造杂交细胞。另外，单克隆抗体可藉Huse等人，科学，2561275(1989)的方法而由细胞制造。
一种适当方案使用包含经纯化的rhTF复合物组合物腹内免疫接种小鼠，进行约2至7个月时间。然后由免疫接种小鼠取出脾细胞。切除脾细胞的前，来自免疫接种小鼠的血清用来检定分析rhTF的特异性抗体力价。然后切除的小鼠脾细胞融合至适当同质或非同质(优选为同质)带有一个标记的淋巴细胞系，该标记例如为次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核酸转移酶缺陷(HGPRT-)或胸腺苷激酶缺陷(TK-)。优选采用骨髓瘤细胞作为淋巴细胞系。骨髓瘤细胞与脾细胞混合，例如以约1至4个骨髓瘤细胞对脾细胞的比例混合。细胞可藉聚乙二醇(PEG)方法融合。参考G.Kohler等人，自然，参见上文。如此转化的融合瘤于培养基生长例如于RPMI-1640生长。参考G.E.More等人，美国内科协会期刊199549(1967)。融合瘤于融合程序后生长，融合瘤例如藉放射性免疫检定分析或酶免疫检定分析筛选是否分泌可特异性结合至醇rhTF的抗体，例如抗体经选择其可结合至纯化后的rhTF，但不会结合至非天然TF。优选使用ELISA进行筛检。于此等筛检时显示阳性结果的融合瘤可藉限制稀释法扩大及转化。优选进行进一步筛检来选出于溶液以及于人类体液样本中可结合至rhTF的抗体。经分离的抗体可藉任一种适当免疫学技术(包括亲和层析术)进一步纯化。可制造特佳H36.D2.B7抗体的融合瘤培养已经遵照布达佩斯条约保藏于美国种型培养收集会(ATCC)，马里兰州10852洛克维尔，公园草皮大道12301号。融合瘤培养系于1997年1月8日保藏于ATCC，被指定保藏号ATCCHB-12255。
供人类治疗用，希望制造嵌合型抗体衍生物，例如组合非人动物可变区及人恒定区的抗体分子，藉此让该抗体比对应的非嵌合型抗体对人类的免疫原性较低。可制备多种类型的此种嵌合型抗体，例如包括制造人类可变区嵌合体，其中部分可变区，特别为抗原结合领域的保留区属于人类来源，只有超可变区才非人类来源。也参考人化嵌合型抗体及其制造方法的讨论，参见S.L.Morrison，科学，2291202-1207(1985)；Oi等人，生物技术，4214(1986)；Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozbor等人，今日免疫学，47279(9183)；Olsson等人，酶学方法，93-16(1982)。此外，可采用基因转化小鼠。例如已经形成携带有人类抗体人类的基因转化小鼠，该小鼠可以天然人类TF免疫接种。此种经过免疫接种的基因转化小鼠所得脾细胞随后用来形成融合瘤，融合瘤分泌人类单克隆抗体，如前文说明，该单克隆抗体与天然人类TF特异性反应。参考N.Lonberg等人，自然，368856-859(1994)；L.L.Green等人，自然遗传学，713-21(1994)；S.L.Morrison，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，816851-6855(1994)。
编码本发明抗体的核酸也可通过聚合酶连锁反应制备(参考后文实施例1揭示的引子)。概略参考Sambrook等人，分子转化(第2版，1989年)。此种核酸也可藉已知方法合成，例如藉磷酸三酯合成(参考寡核苷酸合成，IRL出版社(M.J.Gait编辑，1984))或使用市售自动化寡核苷酸合成仪合成。此种制备所得本发明核酸可用来藉已知技术表达本发明抗体。例如编码本发明抗体的核酸可藉已知方法结合于适当载体，该结合方法例如通过使用限剪酶来于载体制作切口供插入组合物，接着接合。含有所插入的核酸序列的载体，该核酸序列适合以操作式键联至激活子序列，随后被导入宿主细胞内表达。概略参考Sambrook等人，参见上文。适当载体的选择可基于转化方案相关因素通过实验做选择。例如载体需与使用的宿主细胞可兼容，且具有该使用的宿主细胞的适当复制子。此外，载体需可容纳所插入的核酸序列。适当宿主细胞包括宽广多种真核细胞或原核细胞如大肠杆菌(E.coli)等。
本发明抗体的分子量将依据若干因素决定，该等因素例如抗体的期望用途，以及抗体是否包括共轭或重组稠合毒素、药物或可检测的标记等。此外分子量将依据抗体的转译后修改(若有)(例如糖化)的本质及程度决定。修改系依据用来表达的宿主而改变，大肠杆菌制造未经糖化抗体，哺乳动物细胞制造糖化抗体。通常本发明抗体具有分子量约20至150kDa。此种分子量方便藉分子筛选方法测定，分子筛选方法例如为SDS-PAGE凝胶电泳，接着为蛋白质染色或西方墨点分析。
「本发明抗体」或其它类似术语表示全免疫球蛋白，及可结合天然TF的其免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包括抗原决定簇(亦即可由抗体特异性结合的抗原决定部位，该抗体可辨识可特异性结合天然人类TF的天然人类TF)。抗体片段例如包括Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2通过还原免疫球蛋白的双硫键衍生而得的「半分子」、单链免疫球蛋白，或其它适当抗原决定片段(例如参考Bird等人，科学242-424页(1988)；Huston等人，PNAS，(USA)，855879(1988)；Webber等人，分子免疫学，32249(1995))。抗体或其免疫活性片段可为动物抗体(例如啮齿类动物如小鼠或大鼠抗体)或嵌合型抗体(参考Morrison等人，PNAS，816851(1984)；Jones等人，自然，321-522页(1986))。以本发明的单链抗体为佳。
同理，「本发明的核酸」表示可表达而获得本发明抗体的核苷酸序列，此种术语特别表示前文定义。
如前文讨论，本发明抗体可投予哺乳类，优选投予灵长类如人类，来预防或减少由于TF媒介的凝血活化所造成的血栓梗阻病症，典型本发明抗体系于组合物，该组合物包括一或多种医药上可接受的无毒载剂如无菌水或食盐水、二醇类如聚乙二醇、植物来源的油类等。特别可生物兼容、可生物分解的丙交酯聚合物、丙交酯乙交酯共聚物、或聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物为有用的赋形剂，用来控制此处所述含抗体组合物的释放。其它可能有用的给药系统包括乙烯/乙酸乙烯酯共聚物粒子、渗透压帮浦及可植入输注系统及微脂粒。通常本发明的抗凝血剂组合物系呈溶液或悬浮液形式(或冻干形式，其可重新调制为溶液或悬浮液)，优选包括约0.01％至10％(w/w)本发明抗体，更佳包括约0.01％至5％(w/w)抗体。抗体可呈组合物的唯一活性成分投予，或呈混合液投予，该混合液包括一种或多种其它抗凝血剂(例如肝素、水蛭素或类水蛭素、香豆素、杀鼠灵)、抗血小板剂(例如阿司匹林、普拉威、提克里、李欧波、英特革林、或亚各司特)、或血栓溶解剂(例如组织胞质素原活化剂、链激酶及尿激酶)。此外，本发明抗体可于投予一或多种适当抗凝血剂、抗血小板剂或血栓溶解剂的前或的后投予，来增强或延长期望的抗凝血活性。
也如前文讨论，本发明抗体可用来减少由于使用医疗装置例如留置装置如导管、血管支架等可能造成的血液凝固。一种优选方法中，该医疗装置可于接触体液的前使用本发明抗体(例如呈1毫克/毫升食盐水溶液)处理。另外或此外，本发明抗体可以凝血足够减少用量与体液组合。
根据本发明的治疗性抗凝血剂组合物适合以肠道外或静脉给药形式，特别以液态溶液剂剂型使用。此种组合物方便以单位剂量给药，可根据制药界已知方法制备。参考雷明顿制药科学(默克出版公司，宾州伊士顿(1980年))。「单位剂量」一词表示本发明的治疗性组合物系以适合用于灵长类例如人类的单位剂量的实体分开单位使用，每个单位含有经过计算可产生预定疗效的预定量活性物质，组合所需稀释剂或载剂。单位剂型系依据多项因素决定，该等因素包括欲治疗的血栓类型及严重程度、个体凝血系统利用抗体的能力，以及期望FX(或FIX)活化的抑制程度或中和程度。抗体的精确给药量将由临床医师的判定决定，但单位剂量通常系依据给药途径决定，单位剂量系于10纳克/千克体重至50毫克/千克体重每日，更典型于100纳克/千克体重至约10毫克/千克体重每日的范围。此种初期投予与追加接种的方案也有多种变化，典型为初次投予，接着为1小时或数小时间隔藉注射或其它投予方式投予重复剂量。另外，连续静脉输注或间歇静脉输注足以维持抗体的血中浓度至少由约10纳摩尔浓度至10微摩尔浓度。
某些情况下，可能希望修改本发明抗体来提供预定生物、化学或物理性质。特别将抗体共轭(亦即共价键联)至药剂(例如纤维蛋白分解药物如t-PA、链激酶或尿激酶)来提供纤维蛋白分解活性，或将抗体共轭至锁定目标化学剂例如纤维蛋白结合领域。此种键联可藉数种方法达成，包括使用键联分子如非同质双官能蛋白质交联剂，如SPDP、甲二醯亚胺等或藉重组方法达成键联。
除了药物例如纤维蛋白分解剂的外，本发明抗体也可共轭至例如植物来源或细菌来源的毒素，例如白喉毒素(亦即DT)、痢疾毒素、相思子毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、皂素、假单胞杆菌外毒素(PE)、北美商陆抗病毒蛋白或洁洛宁(gelonin)。此种毒素的生物活性片段为业界众所周知，例如包括DT A链及蓖麻毒素A链。毒素也可为于细胞表面有活性的化学剂，例如磷脂酶(磷脂酶C)。至于另一例，毒素可为化学治疗药例如文德辛(vendesine)、文克斯汀(vincristine)、文拉斯汀(vinblastin)、美索崔塞(methotrexate)、阿利亚霉素(adriamycin)、阿霉素(doxirubicin)、布利欧霉素(bleomycin)或西斯拉汀(cisplatin)；或毒素可为放射性核种例如碘-131、钇-90、铼-188或铋-212(概略参考Moskaug等人，生物化学期刊，26415709(1989)；I.Pastan等人，细胞，47641(1986)；Pastan等人，重组毒素作为新颖治疗剂，生物化学年报综论，61331(1992)；嵌合型毒素Olsnes及Phil，药物治疗学，25355(1982)；公告PCT申请案第WO94/29350号；公告PCT申请案第WO94/04689号；及美国专利第5,620,939号)。此外如前文讨论，除了毒素外，本发明抗体可共轭至效应物分子(例如IgG1或IgG3)来当投予哺乳类时提供补体固定能力及抗体相依性细胞媒介的胞毒性。
此种抗体-胞毒素或效应物分子共轭物可以治疗有效量投予哺乳类，优选为灵长类例如人类，此处该哺乳类动物已知具有或怀疑具有可表达TF的肿瘤细胞、免疫系统细胞、或内皮。此种肿瘤细胞、免疫系统细胞及内皮例如包括乳癌及肺癌、单核细胞及血管内皮。
本发明抗体除了前文说明之外也可共轭至多种其它药剂，例如药物、酵素、激素、可结合至放射性核种的螯合剂以及其它可用于疾病诊断或治疗的蛋白质及多。用于诊断目的，本发明抗体可以加可检测标记或未加标记使用。例如宽广多种标记适合用来以可检测方式标记抗体，该等标记例如放射性核种、萤光、酶、酶基质、酶辅因子、酶抑制剂、配位子例如半抗原等。
也提供诊断方法包括体内诊断造影[例如参考A.K.Abbas，细胞及分子免疫学，328页(华比桑德(W.B.Saunders)公司，1991年)]。用于大部分体内造影用途，本发明可使用例如125I、32P、99Tc或其它可检测标记以可检测方式标记，以及随后抗体投予哺乳类特别为人类经历一段足够允许该抗体接触预定目标的时间。然后个体藉已知程序例如扫描摄影分析扫描，来检测抗体的结合情况。分析可辅助多种血栓，特别前文揭示的血栓的诊断与治疗。该方法于结合心脏手术特别血管成形术或其它手术，该等手术可能形成非期望的血块使用时特别有用，可观察血块的发展及移动。
本发明抗体也可用于由生物标本制备实质纯质(例如至少约90％纯质，优选至少约96％或97％纯质)天然TF，特别天然人类TF。例如可如前文说明获得天然TF(例如参考L.V.M.Rao等人，血栓研究，56109(1989))，将该溶液混合包含该抗体的固体撑体形成偶合反应混合物纯化获得。固体撑体包括板壁，例如微力价孔板，以及包含下列材料或由下列材料组成的撑体聚苯乙烯、聚氯乙烯、交联葡萄聚糖(如希法德士(Sephadex)法玛西雅(Pharmacia)精细化学品公司)、琼脂糖、聚苯乙烯珠粒(亚伯特实验室(Abbott Laboratories))、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺呈交联形式、硝基纤维素或尼龙等。然后根据标准免疫技术，以实质纯质形式由固体撑体分离TF。(概略参考Harlow及Lane参见上文及Lane参键上文及Ausubel等人参见上文)。
也如前文讨论，本发明抗体可用来检测生物标本的天然人类TF，特别检测凝血相关的天然TF。生物标本例如包括血浆、血清、唾液、尿液、粪便、阴道分泌物、胆汁、淋巴、眼房水、脑脊髓液、细胞培养基及组织，特别为血管组织例如心脏组织。标本适合来自患有或怀疑患有血栓且优选为血管再狭窄的哺乳动物，该血栓或血管再狭窄系关联下列情况，例如侵入性医疗手术如经皮穿管腔冠状动脉手术、心肺绕道手术、动脉内膜切除术、周边血管绕道移植、重建手术或整型手术、关节置换术；心脏病例如心肌梗塞、心肌病、瓣膜性心脏病、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、或栓塞引起的心房纤维震颤；凝血病变包括弥漫性血管内凝血、深部静脉血栓、医疗装置如血管支架或心导管的置放；休克(例如败血性休克症候群)、血管外伤、肝病、出血性脑中风、中暑、恶性疾病(例如胰癌、卵巢癌、或小细胞肺癌)、狼疮、子痫、血管周围梗阻病及肾脏病。
用于此等检定分析，本发明抗体可根据已知方法使用适当原子或分子以可检测方式标记，标记原子或分子例如为放射性碘、氚、生物素、或可产生可检测产物的反应剂，例如抗特应基因型抗体附着于酶(如β-半乳糖苷酶或辣根过氧化酶)，或萤光标记(例如萤光素或若丹明)。于生物标本接触经过可检测方式标记的抗体后，任何未反应的抗体可由生物标本分离，标记(或产物)可藉习知免疫学方法检测，检测方法包括抗体捕捉检定分析、抗体夹层检定分析、RIA、ELISA、免疫沉淀法、免疫吸附法等方法(参考Harlow及Lane，参见上文；Ausubel等人，参见上文)。任何标记(或产物)超过于适当对照标本检测得的量，指征生物标本存在有天然TF，特别存在有血块。例如本发明抗体可根据标准免疫学技术(例如抗体捕捉检定分析、ELISA、抗体夹层检定分析、RIA、免疫沉淀法、免疫吸附法等)，以可检测方式标记来检测且优选为定量检测天然TF。某些情况下，特别当使用组织时，免疫学技术包括以已知实质上可维持蛋白质构象的作用剂(例如稀甲醛)固定组织。概略参考Ausubel等人，分子生物学流行方案，约翰威利父子公司，纽约(1989)；Harlow及Lane，抗体实验室手册，CSH出版公司，纽约(1988)。
本发明抗体可用于检测且纯化可表达天然TF的细胞，该等细胞包括纤维母细胞、脑细胞、免疫细胞(例如单核细胞)、上皮及若干恶性细胞。优选细胞的检测与纯化方法包括习知免疫学方法(例如流动细胞计量方法如FACS，及免疫淘洗法)。可表达天然TF的实质纯质细胞群可用于临床及研究，例如建立培养细胞用来筛检TF结合抗体。
本发明提供试验及诊断试剂盒，用来检测试验标本特别为体液如血液、血浆等或如前述组织，检测天然TF，特别天然人类TF。优选试剂盒包括本发明的经可检测标记抗体。诊断试剂盒可以任一种可接受的免疫学格式例如ELISA格式，用来检测生物标本中是否存在有天然TF或天然TF存在量。
如前文讨论，本发明也提供人源化抗体，人源化抗体特异性结合至人组织因子来形成结合复合物。组织因子可为天然或重组组织因子(rHTF)。优选因子X或因子IX的结合至复合物受到抑制。于优选本发明的具体实施例中，人源化抗体对hTF具有亲和常数(Kd)小于约1nM，优选小于约0.5nM及更佳由约0.01nM至约0.4nM。参考后文实施例11，有关测定人源化抗体亲和常数的额外信息。「特异性结合」一词表示人源化抗体与TF形成可检测的复合物，藉标准免疫学技术如RIA、西方墨点或ELISA技术未检测得其它抗原。
本发明的其它人源化抗体的进一步特征为藉标准凝血酶原(PT)凝固时间测定，可增加血液凝固时间达至少约5秒。优选具体实施例中，人源化抗体与检定分析的含量为约5nM至约75nM，及更佳约10nM至约50nM。例如参考后文实施例11(说明如何使用人源化抗体进行标准PT凝血检定分析)。
根据本发明的额外优选人源化抗体具有对组织因子优选为天然人类TF的结合特异性系约略等于或大于来自H36.D2.B7的抗体(以ATCC保藏号HB-12255保藏)。也优选人源化抗体具有对TF的结合亲和力系约略等于或大于来自H36.D2.B7的抗体(以ATCC保藏号HB-12255保藏)。结合特异性及亲和力的测定方法为业界已知，包括后述特定检定分析。
根据本发明的进一步人源化抗体包括至少一个鼠互补测定区(CDR)。如一般了解，免疫球蛋白轻链及重链共享某些结构类似性，例如各自包括四区(FR1-4)构架，其序列为相对保留性。各个FR1-4(FR1、FR2、FR3、FR4)系以三个CDRs亦即CDR1、CDR2、CDR3共价连接。一般了解四个FRs大为具有β片组态，互连的CDRs形成回路连结β片结构，某些情况下构成β片结构的一部分。大部分CDRs维持接近于毗邻FRs，与来自相对轻链或重链的对应CDRs辅助形成抗原决定部位。已经揭示宽广多种CDRs及FRs。例如参考Kabat等人，免疫学感兴趣的蛋白质序列，美国卫生与人类服务部，美国政府印刷所(1987年)。
也参考EP-A-0239400及美国专利第5,985,279号(说明制造变化抗体的方法，其中CDRs系由FR以外的不同物种衍生而得)。
「人源化」一词表示一种免疫球蛋白，其包括人类构架区以及一或多个来自非人来源的CDRs，通常为啮齿类动物如大鼠或小鼠免疫球蛋白。提供CDRs的非人免疫球蛋白称作为「供体」，而人类免疫球蛋白称作为「受体」。如同于某些免疫球蛋白的TF结合片段，无需存在有恒定区。优选恒定区(若存在时)实施例系与人免疫球蛋白恒定区相同，亦即相对于氨基酸序列的同源性至少约90％，优选至少约95％相同或以上。如此，几乎全部人化免疫球蛋白的各部分(CDRs可能例外)实质上皆系与天然人类免疫球蛋白序列的对应部分完全相同。
「人源化抗体」一词表示一种抗体其包括人化轻链及人化重链免疫球蛋白。此种抗体的制造方法及使用方法已经讨论如前。参考S.L.Morrison，参见上文；Oi等人，参见上文；Teng等人，参见上文；Kozbor等人，参见上文；Olsson等人，参见上文；及前文引用的其它参考文献。
例如人源化抗体的说明例包括1)轻链及重链构架(FRs)，其各自氨基酸序列于对应人类FRs至少约90％相同且优选至少95％相同；2)至少一个CDR系来自小鼠，且优选全部CDRs皆来自小鼠；以及3)免疫球蛋白恒定区与对应人类免疫球蛋白恒定区至少约90％同源性且优选至少约95％同源性。须了解由于结果所得人源化抗体预期可结合至可提供CDRs的供体抗体的相同抗原，供体抗体已经藉「人化」方法而人化。
进一步须了解此处提供的人源化抗体可具有一或多个视需要可为连续或非连续的保留性氨基酸取代。例如此种取代典型对抗原结合功能或其它免疫球蛋白结合功能实质具有极少或无影响。「保留取代」一词包括多种型式，表示下列的组合glyala；valileleu；aspglu；asngln；serthr，lysarg；及phetyr。
其它人源化抗体具有可变区，其氨基酸序列与一或多种天然人类免疫球蛋白序列的对应可变区具有至少70％同源性(例如约73％至75％同源性)。
根据本发明的额外人源化抗体于整个抗体具有与一或多种人类抗体至少90％同源性。
更特定本发明的人源化抗体为其中构架(FRs)1、2、3及4与第12A图所示轻链FR序列(SEQ ID NO.＿)至少约90％氨基酸序列同源性，且优选至少约95％或以上的同源性。优选该序列于第12A图显示为「LC-09」。进一步优选人源化抗体包括轻链恒定区其具有氨基酸序列于第14A或15A图所示序列(SEQ ID NO.＿)至少约90％同源性，且优选至少约95％或以上序列同源性。其它特定人源化抗体为各个构架(FRs)1、2、3及4具有于第13A图所示重链序列(SEQ ID NO.＿)至少约90％氨基酸序列同源性且优选约95％或以上同源性。优选该序列于第13A图显示为「HC-08」。
其它人源化抗体具有重链恒定区，该恒定区于第14B或第15B图所示序列(SEQID NO.＿)至少约90％氨基酸序列同源性，且优选约95％或以上同源性。
若干具体实施例中，人源化抗体具有IGGL(HOAT)或IgG4(HFAT)同型基因。参考实施例9。
本发明也提供此处揭示人源化抗体的功能片段。优选片段以亲和常数(Kd)小于约1nM，优选小于约0.5nM及更佳由约0.01nM至约0.4nM特异性结合TF。特佳为抗原结合Fab、Fab’、及F(ab)2片段。
如此处讨论，本发明包含人源化抗体，其包括至少一个鼠互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2、CDR3。
优选具体实施例中，抗体特异性结合至人类组织因子(TF)而形成复合物。典型地，因子X或因子IX结合至TF或TFFVIIa，被TFFVIIa的活化受到抑制。如前述，优选CDRs(轻链及重链)系来自啮齿类动物来源，典型系来自小鼠。
本发明的人源化抗体的优选具体实施例中，抗体进一步包括至少一个人类构架(FR)区。优选全部FR区(轻链及重链)皆为人类来源。
更特定具体实施例中，重链超可变区的第一CDR(CDR1)具有与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。典型地，重链超可变区的第二CDR(CDR2)具有与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。也优选重链超可变区的第三CDR(CDR3)具有与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。
两个核酸序列间的同源性可通过检视及/或使用习知计算机软件如BLAST或FASTA测定。
本发明的另一具体实施例中，轻链超可变区的第一CDR(CDR1)具有与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。典型地，轻链超可变区的第二CDR(CDR2)具有与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。也优选轻链超可变区的第三CDR(CDR3)具有与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少90％同源性，且优选至少与该序列具有约95％或以上的同源性。
此外本发明的人源化抗体包括重链超可变区的第一构架(FR1)，该FR1与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1 HC-08」至少具有同源性90％。一具体实施例中，FR1包含至少一种如下氨基酸变化E1至Q；Q5至V；P9至G；LI1至V；V12至K；Q19至R；及T24至A。优选FR1包括2、3、4、5或6个该等变化，全部氨基酸变化对多项用途为优选。
其它本发明的人源化抗体包括重链超可变区的第二构架(FR2)，该FR2与第13A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2 HC-08」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR2包含至少一种下列氨基酸变化41H至P；及44S至G。优选FR2包括此二种氨基酸变化。
本发明也包含人源化抗体其中重链超可变区的第三构架(FR3)，该FR3与第13A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3 HC-08」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR3包含至少一种下列氨基酸变化76S至T；77T至S；80F至Y；82H至E；84N至S；87T至R；89D至E；及91S至T。优选FR3包括两种、三种、四种、五种或六种氨基酸变化，以全部七种氨基酸变化通常为优选。
本发明的特色也包含人源化抗体其中第四构架(FR4)，该FR4与第13A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4 HC-08」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR4包含至少一种下列氨基酸变化113L至V。
此外本发明的人源化抗体包括轻链超可变区的第一构架(FR1)，该FR1与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1 LC-09」至少具有同源性90％。一具体实施例中，FR1包含至少一种如下氨基酸变化11Q至L；15L至V；17E至D；及18至R。优选FR1包括两种或三种氨基酸变化，而以全部四种氨基酸变化为优选。
其它本发明的人源化抗体包括轻链超可变区的第二构架(FR2)，该FR2与第12A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2 LC-09」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR2包含至少一种下列氨基酸变化37Q至L。
本发明也包含人源化抗体其中轻链超可变区的第三构架(FR3)，该FR3与第12A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3 LC-09」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR3包含至少一种下列氧基酸变化70K至D；74K至T；80A至P；84A至V；及85N至T。优选FR3包括两种、三种或四种氨基酸变化，以全部五种氨基酸变化通常为优选。
另外，本发明的人源化抗体包括第四构架(FR4)，该FR4与第12A图所示序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4 LC-09」至少90％同源性，且优选与该序列具有约95％或以上同源性。一具体实施例中，FR4包含至少一种下列氨基酸变化100A至Q及106L至I。
本发明也包含前述人源化抗体的人TF结合片段。此等片段例如包括Fab、Fab’及F(ab)2。
特定具体实施例中，本发明包含人源化抗体，及包括至少一个啮齿类动物互补决定区(CDR)，通常为小鼠。优选该抗体特异性结合至人类组织因子(TF)，来形成复合物，其中因子X或因子IX结合至TF或TF/VIIa及藉TF/VIIa活化受到抑制。也优选人源化抗体于重链包括下列成分中的至少一种，且更佳包括全部a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，d)第一构架(FR1)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1HC-08」至少95％相同，e)第二构架(FR2)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2HC-08」至少95％相同，f)第三构架(FR3)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3HC-08」至少95％相同，及g)第四构架(FR4)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4HC-08」至少95％相同。
特定具体实施例中，也优选人源化抗体于轻链包括下列成分中的至少一种，且优选包括全部h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少95％相同，k)第一构架(FR1)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1LC-09」至少95％相同，
l)第二构架(FR2)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2LC-09」至少95％相同，m)第三构架(FR3)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3LC-09」至少95％相同，及n)第四构架(FR4)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4LC-09」至少95％相同。优选人源化抗体进一步包括第14A图(SEQ ID NO.＿)或第15A图(SEQ ID NO.＿)的轻链恒定序列。也优选，抗体包括第14B图(SEQ ID NO.＿)或第15B图(SEQ ID NO.＿)的重链恒定区。
本发明也有特色在于一种人源化抗体于重链包括下列成分中的至少一种，且优选包括全部a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，d)第一构架(FR1)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1HC-08」完全相同，e)第二构架(FR2)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2HC-08」完全相同，f)第三构架(FR3)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3HC-08」完全相同，及g)第四构架(FR4)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4HC-08」完全相同。
一具体实施例中，也优选人源化抗体于轻链包括下列成分中的至少一种，且优选包括全部h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，k)第一构架(FR1)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR1LC-09」完全相同，l)第二构架(FR2)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR2LC-09」完全相同，
m)第三构架(FR3)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR3LC-09」完全相同，及n)第四构架(FR4)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)为「FR4LC-09」完全相同。优选人源化抗体进一步包括第14A图(SEQ ID NO.＿)或第15A图(SEQ ID NO.＿)的轻链恒定序列。也优选，抗体包括第14B图(SFQ ID NO.＿)或第15B图(SEQ ID NO.＿)的重链恒定区。
本发明的人源化抗体除了完整抗体的外，可呈多种适当形式存在；包括例如Fv、Fab及F(ab’)2以及双官能杂交抗体(例如Lanzavecchia等人，欧洲免疫期刊17，105(1987))；及呈单链存在[例如Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，85，5879-5883(1988)及Bird等人，科学242，423-426(1988)，以引用方式并入此处]。[参考Hood等人，免疫学，Benjamin，，N.Y.2.sup.nd ed.(1984)，Harlow及Lane，抗体，实验室手册，冷泉港实验室(1988)及Hunkapiller及Hood，自然，323，15-16(1986)，以引用方式并入此处]。
「嵌合型抗体」一词或相关术语包括复数型，表示抗体，其轻链基因及重链基因典型已经藉基因工程而由属于不同种属的免疫球蛋白基因片断组合而成。例如来自小鼠单克隆抗体基因的可变(V)片断可接合至人类恒定(C)片断如γ1γ3。典型治疗嵌合型抗体为来自小鼠抗体如V领域或抗原结合领域及来自人抗体的C领域或效应物领域组成的杂交蛋白质，但也可使用其它总哺乳动物。特佳嵌合型抗体为此处揭示的cH36小鼠-人嵌合体。
本发明的人源化抗体可视需要为多株抗体或单克隆抗体，可具有IgG1或IgG4同基因型。
此处揭示的人源化抗体可藉包括前文参照的一种策略或组合策略制造。例如参考S.L.Morrison，参见上文；Oi等人，参见上文；Teng等人，参见上文；Kozbor等人，参见上文；Olsson等人，参见上文；及前文引用的其它参考文献。
一种办法中，采用四个一般步骤来人源化抗体。第一，小鼠抗体轻链及重链的氨基酸序列来自cH36小鼠-人嵌合型抗体。第二，cH36抗体通过测定何者人抗体构架区可获得「最佳匹配」而人化，「最佳匹配」表示最类似对应的小鼠构架氨基酸序列。第三，将相关轻链及重链FR序列人化；以及第四，转移感染且表达编码人化轻链或重链的经分离的核酸(或人化轻链及重链，例如参考后述mega载体)。
某些情况下，有限数目的人化免疫球蛋白的构架氨基酸经选择为与供体位置氨基酸相同，而非与受体位置氨基酸相同。此项技术的优点系提升包括人化免疫球蛋白链抗体的亲和力。也参考美国专利第5,985,279；5,693,762号；及EP-A0239400(揭示制造人源化抗体的概略方法)。
特别以应用「最佳匹配」办法来人化嵌合型抗组织因子抗体cH36为特佳。此种办法中，第1A及1B图(SEQ ID NOS2及4)显示的鼠轻链及鼠重链可变序列用来搜寻(「比对」)全部可来自蛋白质数据库，有关该等人抗体可变领域序列而该等序列系与鼠可变序列最具有同构型。例如参考Kabat等人，参见上文。多种易得的计算机程序可用来执行此项步骤，例如BLAST、FASTA等程序及相关程序。轻链及重链的构架1、2、3及4特别令人感兴趣，原因在于此等部位最为众所周知保有于抗原结合适当方向性的CDRs。搜寻结果的输出，典型为与查询的小鼠序列最具有同构型的序列、对各个序列的同构型百分比、以及各个人序列与对应小鼠序列的对正程度的窗体。分析通常系于轻链及重链独立进行。
根据「最佳匹配」办法，查询小鼠构架序列与数据库中对应人类构架序列间的氨基酸不匹配数目最小化。大部分情况下，适当人类构架区系基于下列相同性标准选择。于轻链，小鼠FR1的氨基酸序列系与对应人类FR1至少约80％相同；小鼠FR2与对应人类FR2至少约90％；小鼠FR3与对应人类FR3至少约90％；以及小鼠FR4与对应人类FR4至少约75％。以及于重链，小鼠FR1的氨基酸序列系与对应人类FR1至少约80％相同；小鼠FR2与对应人类FR2至少约85％；小鼠FR3与对应人类FR3至少约70％；以及小鼠FR4与对应人类FR4至少约90％。典型地当评估类似的候选人类构架序列时，以保留性氨基酸取代为佳。发现当考虑此等因素时，结果所得人类构架可作为嵌合型cH36抗体的人化的良好参考点。
也优选，根据「最佳匹配」办法，于轻链及重链的全部人类构架皆系衍生自可能的相同人类抗体克隆。
一旦已经决定所需人类构架，使用重组聚合酶连续反应(PCR)技术来于轻链及重链二链进行期望的氨基酸取代。典型地制造寡核苷酸，用来将小鼠可变领域构架突变成为含有所需残基。采用有多种不同长度的寡核苷酸。参考WO92/07075有关重组PCR方法及相关方法的广义揭示。
通常，常规PCR用来转化，导入转化部位或诊断用核酸内切酶部位，以及改变位于可变区末端的氨基酸残基。以PCR为主的突变用来特别于残基位在可变区中央时，一次改变多个氨基酸残基。部位取向突变用来一次导入一或二个氨基酸取代。于各步骤，部分人化克隆经过定序，部分可变区后来转化入表达载体。更特别的进行此等操控方法述于实施例乙节。
于进行前述「最佳匹配」办法来人化嵌合型cH36抗体后，编码构架及/或CDR的突变后的核酸联结至编码轻链或重链恒定区的适当DNA。然后此等组合物转化入适当表达载体，转移感染入宿主细胞，优选为哺乳类细胞。此等步骤系使用业界已知的重组技术及细胞培养技术达成。如此本发明的人源化抗体可藉后述广义方法制备(a)制备第一表达载体，其包括一个适合表达宿主的复制子，以及一个工作式连结至DNA序列的适当激活基因，其编码Ig重链或轻链的至少一个可变领域，该可变领域包含根据「最佳匹配」办法制备的人化构架区1-4及来自cH36抗体的鼠CDRs1-3，(b)制备一第二可复制表达载体，其包括一适当激活基因工作式联结至一DNA序列，该DNA序列分别至少编码互补Ig轻链或重链的可变领域，该可变领域包含根据「最佳匹配」办法制备的人化构架区1-4及来自cH36抗体的鼠CDRs1-3；(c)以第一制备所得载体或二载体转移感染一细胞系；以及(d)培养该转移感染后的细胞系来制造经过改变的抗体。
优选于步骤(a)及(b)的DNA序列编码来自人抗体链的适当恒定领域。适当同基因型例如包括IgG1及IgG4。
另外，本发明的适当人源化抗体的制备方式，系通过制备单一可复制「mega」载体，其包括适当激活基因工作式连结至一DNA序列，其编码Ig重链或轻链的至少一个可变领域，该可变领域包含根据「最佳匹配」办法制备的人化构架区1-4及来自cH36抗体的鼠CDRs1-3。优选该mega载体进一步包括适当激活基因工作式连结至一DNA序列，其编码互补Ig轻链或重链的至少一个可变领域，该可变领域包含根据「最佳匹配」办法制备的人化构架区1-4及来自cH36抗体的鼠CDRs1-3。mega载体的使用经常系适合用于需要由单一载体表达人源化抗体的本发明的具体实施例。
其它方法也极为适合用于制造本发明的人源化抗体及片段。一具体实施例中，该方法包括下列至少一个步骤，且优选包括全部步骤a)比较来自啮齿类动物抗体的轻链构架的氨基酸序列与对应人类抗体构架序列(优选为小鼠抗体)的集合，b)由该集合选出与对应啮齿类动物轻链构架具有最大氨基酸序列同源性(亦即至少于70％序列同源性)的人类构架序列，c)突变编码啮齿类动物轻链构架的DNA片断来编码一种人化轻链构架，其具有氨基酸序列系与步骤b)选定的人类构架序列实质相同(亦即至少约95％相同)，d)对啮齿类动物轻链的个别构架重复步骤a)至c)，来产生多个DNA序列，其中各个序列编码一种人化轻链构架，其中于步骤b)选定的对应人类构架序列个别系由相同或不同的人抗体制备，e)将步骤d)制造的编码人化构架序列的DNA序列，组装成为一第一载体，其编码至少啮齿类动物抗体的轻链可变区；以及f)于足够制造人源化抗体的条件下，将组装后的抗体导入一适当宿主内。优选用于该方法的轻链构架序列包括此处揭示的特定小鼠轻链构架及人化轻链构架。
一具体实施例中，前述人源化抗体制造方法进一步包括至少一个下列步骤且优选全部步骤g)比较来自啮齿类动物抗体的重链构架的氨基酸序列与对应人类抗体构架序列的集合，h)由该集合选出与对应啮齿类动物重链构架具有最大氨基酸序列同源性(亦即至少于70％序列同源性)的人类构架序列，i)突变编码啮齿类动物重链构架的DNA片断来编码一种人化重链构架，其具有氨基酸序列系与步骤h)选定的人类构架序列实质相同(亦即至少约95％相同)；以及j)对啮齿类动物重链的个别构架重复步骤g)至i)，来产生多个DNA序列，其中各个序列编码一种人化重链构架。优选于步骤h)选定的对应人类构架序列个别系由相同或不同的人抗体制备。优选用于该方法的重链构架序列包括此处揭示的特异性小鼠重链构架及人化重链构架。
更特别制造人源化抗体的方法包括将步骤j)制造的编码人化构架序列的DNA序列，组装成为一第二载体，其编码至少啮齿类动物抗体的重链可变区；以及于足够制造人源化抗体的条件下，将组装后的第一及第二载体导入宿主内。
如前文讨论，经常需要由单一载体来表达本发明的人源化抗体，该单一载体偶尔称作为「mega」载体。一具体实施例中，该方法包括将步骤j)制造的编码人化构架序列的DNA序列，组装成编码至少啮齿类动物抗体的重链可变区及轻链可变区的第一载体；以及进一步将组装后的第一载体于足够制造人源化抗体的条件下导入宿主内。
「组装」或「组装后」一词表示使用标准重组技术来将编码人化构架的本DNA序列导入载体内。此种组装可藉一种办法或多种办法的组合进行，该等办法包括(但非限制性)将迭代变化导入单一构架序列将各片段剪接在一起(通过使用限剪核酸内切酶及接合酶剪接)，或通过合成DNA合成技术进行组装。概略参考Harlow及Lane参见上文及Ausubel等人参见上文。
前述制造人源化抗体的方法可使用几乎任一种可接受的突变发生技术实施。特别如上步骤c)及i)的一者或二者可采用部位取向突变发生方法或标准PCR方法，来使用适当人类氨基酸置换构架的预定啮齿类动物氨基酸。典型地修改后的(人化)构架序列系对应由基因库选出的人类构架序列。
人源化抗体可使用任一种重组表达系统制备，例如前文于S.L.Morrison参见上文；Oi等人，参见上文；Teng等人，参见上文；Kozbor等人，参见上文；Olsson等人，参见上文；及其它前文引述的参考文献揭示的重组表达系统。
例如本发明的适当核酸编码此处揭示的人源化抗体或其片段的重链或轻链中的至少一种。典型地，核酸为包括该经分离的核酸的重组DNA载体。DNA载体典型进一步包括一表达控制多核苷酸序列，其以工作式连结至人化免疫球蛋白编码序列，包括天然关联的激活基因区、或非同质激活基因区。优选表达控制序列为真核激活基因系统于可转化或转移感染真核宿主细胞的载体，但也可使用原核宿主用的控制序列。一旦载体已经结合于适当宿主，宿主被维持于适合高度表达核酸序列的条件下，若有所需，轻链、重链、轻链/重链二元体或完好抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式的收集与纯化说明如后。
最终可表达所需人源化抗体的本发明核酸序列可由多种不同多核苷酸(基因体或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等)及其组成元体(例如V、J、D及C区)形成，以及藉多种不同方法制造。接合适当基因体序列及合成序列为最常见的制法，但也可使用cDNA序列。例如参考S.L.Morrison，参见上文；Oi等人，参见上文；Teng等人，参见上文；Kozbor等人，参见上文；Olsson等人，参见上文；欧洲专利公告案第0239400号及Riechmann，L.等人，自然，332，323-327(1988)；及其中引述的参考文献。
一具体实施例中，适当DNA表达载体包括一或多个选择标记例如四环素(tetracycline)、安比西林(ampicillin)或新霉素(neomycin)，使允许检测以所需DNA序列转化的该等细胞(例如参考美国专利第4,704,362号，该案以引用方式并入此处)。大肠杆菌属于特别可用于转化本发明的多核苷酸的一种原核宿主。其它适合使用的微生物宿主包括(但非限制性)细菌如枯草杆菌(Bacillus subtilus)及其它肠细菌科如沙门氏菌(Salmonella)、锯杆菌(Serratia)、多种假单胞杆菌属(Pseudomonas species)及其它微生物例如放线菌(如链丝菌属(Streptomyces species))、酵母(例如酿母菌属(Saccharomyces species))或真菌(例如曲菌属(Aspergillus species))。此等原核宿主中也可制造表达载体，其典型含有可与宿主细胞兼容的表达控制序列(例如激活基因及复制起点)。此外，存在有多种众所周知的激活基因的任一者，例如乳糖激活基因系、色氨酸(trp)激活基因系、β-内醯胺激活基因系或来自噬菌体λ的激活基因系。激活基因典型可控制表达，选择性使用操纵基因序列控制表达，具有核糖体结合部位序列等供引发以及完成转录及转译。其它微生物如酵母也可用于表达。以酿母菌为优选宿主，适当载体具有表达控制序列如激活基因包括3-磷酸甘油酸激酶及其它糖分解酶以及视需要包括复制起点、终结序列等。植物(例如阿拉伯草属(Arabidopsis)、烟草属(Nicotinia)等)及植物细胞培养也可用来表达及制造本发明抗体。
除了前述以微生物为主的系统外，哺乳类组织细胞培养也可用来表达及制造本发明的多(参考Winnacker，由基因至克隆，VCH出版社，纽约州纽约，(1987年)，其引用方式并入此处)。
多种情况下以真核细胞通常为优选，典型为CHO细胞系、多种COS细胞系、NSO细胞、BK细胞、HeLa细胞，优选为骨髓瘤细胞系等或融合瘤的转化B细胞。此等细胞的表达载体可包括表达控制序列如复制起点、激活基因及促进子(Queen等人，免疫学综论，89，46-68(1986))，以及需要的处理信息部位例如核糖体结合部位、RNA剪接部位、聚腺苷化部位及转录终结基因序列。优选表达控制序列为衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳突瘤病毒、细胞巨病毒等的激活基因。
实施本发明的优选DNA载体包括下列以工作式联结的序列抗生素抗药性标记例如安比西林抗药性F1起点及重链(HC)或轻链(LC)可变区。该可变区可插入适当HC表达载体，其包括以操作式联结的下列序列HC可变区、人IgG1或IgG4恒定区、第一多A部位、SV40激活基因、抗生素抗药性标记例如新霉素抗药性、第二多A部位、细胞巨病毒(CMV)激活基因/促进子及适当前导子序列。
额外优选DNA载体包括LC可变区，以工作式联结至啮齿类动物κ插入序列(例如小鼠)，该插入序列系工作式联结至适当人κ恒定区；及抗生素抗药性标记例如新霉素抗药性。
如前文讨论，由单一核酸表达本发明的人源化抗体经常高度有用。优选DNA载体偶尔于此处称作为「mega」载体，其序列包括下列成分以工作式联结SV40激活基因、抗生素抗药性标记如新霉素、第一多A部位、第一CMV激活基因/促进子、LC可变区、啮齿类动物κ插入序列(例如小鼠)、人κ表达序列、第二多A部位、第二CMV激活基因/促进子、HC可变序列及人类IgG1或IgG4重链恒定区。此种mega载体的特例为后文于实施例说明的人源化抗TF IgG1抗体表达载体。也参考第11图。
以下三种核酸载体pSUN36(人源化抗-TF抗体Ig G1-HC表达载体)、pSUN37(人源化抗-TF抗体Ig G4-HC表达载体)及pSUN38(人源化抗-TF抗体LC表达载体)已经遵照布达佩斯条约保藏于美国种型培养收集会(ACTT)，于维吉尼亚州20110-2209马娜萨司，布得瓦大学10801号。载体被指定如下保藏号PTA-3727(pSUN36)；PTA-3728(pSUN37)；及PTA-3729(pSUN38)。
多种适当宿主细胞可用来制造此处揭示的人源化抗体及片段。一具体实施例中，该方法包括提供一宿主细胞被转移感染以1)一编码人源化抗体或其片段轻链的第一表达载体，以及一编码人源化抗体或其片段重链的第二表达载体；或2)一单一表达载体其编码人源化抗体或其片段的轻链及重链二者；将该宿主细胞维持于可表达各链的生长条件下；以及分离人源化抗体或其片段。
例如经转移感染而产生人源化抗体的细胞系可为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、BK细胞系或NSO细胞系。进一步可接收的细胞系包括经辨识的永生哺乳类细胞系，优选为淋巴来源细胞系，例如骨髓瘤细胞系、融合瘤细胞系、三合瘤细胞系或四合瘤细胞系。细胞系也包含正常淋巴细胞如B细胞，其已经使用病毒如EB病毒(Epstein-Barr virus)转化而永生化。曾经报告使用CHO细胞来表达多种蛋白质的方法。例如参考Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77 4216-4220(1980))及WO87/04462。NSO细胞也优选，说明如下实施例乙节。
虽然用来产生人源化抗体的细胞系优选为哺乳类细胞系，但另外也可使用任何其它细胞例如细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。特别预期可使用大肠杆菌衍生的细菌种系。
一旦由适当细胞来源表达，全抗体、其二元体、个别轻链及重链或本发明的其它免疫球蛋白形式(如功能化人源化抗体片段)可根据标准程序回收及纯化。此等程序包括(但非限制性)硫酸铵沉淀、亲和管柱、管柱层析术、凝胶电泳等(概略参考Scopes，R.，蛋白质纯化，史宾基凡拉革(Springer-Verlag)，纽约(1982))。实质纯质的本发明人源化抗体及其片段具有至少约90至95％同构型，以具有约98至99％或以上同构型用于大部分药物用途为优选。一旦纯化后，部分纯化或视需要纯化为均质后，人源化抗体可供治疗用，或用于发展及进行检定分析程序、免疫萤光染色等(概略参考免疫学方法第I及II期，Lefkovits及Pernis编辑，学术出版社，纽约州纽约(1979年及1981年))。
优选纯化本人源化抗体的方法涉及习知亲和层析术及离子交换层析术，优选系使用重组蛋白质A西法罗司(Sepharose)(已知人Ig G Fc对其具有高度亲和力)。含抗体部分经收集，接受进一步离子交换层析术，优选使用Q西法罗司进行离子交换层析术。含蛋白质畸峰的抗体经汇集，对适当溶液或缓冲液例如PBS渗析。
根据本发明的人源化抗体及其片段可藉一种方法或多种标准方法的组合来测试其功能。优选试验检定分析TF功能的抑制。优选方法偶尔于此处称作为「标准凝血酶原时间」检定分析等相关名词。标准凝血酶原时间(PT)检定分析典型涉及以下至少一个且优选全部步骤a)组合TF及因子VIIa而形成结合复合物，b)于可形成因子Xa(或因子IXa)的条件下，让结合复合物接触因子X(或因子IX)，c)因子Xa接触凝血酶原来产生凝血酶原，优选系于Va及脂质存在下接触。
进行标准PT检定分析是优选TF来源于市面上可以商品名印奴文(Innovin)获得。血液因子的优选来源为人血浆制剂称作西拙(Ci-Trol)凝血控制。
此处提供的人源化抗体及其片段易于检定分析试验。一整份经纯化后的抗体或片段优选为约200nM至约2000nM添加至该方法，优选系于步骤a)的前添加，但于检定分析的其它点添加对某些用途亦优选。典型地，人源化抗体或其片段添加至Ci-Trol凝血控制，接着添加TF。
包括全IgG、Fab、Fab’、F(ab)2及单链抗体(包含人源化抗体的抗原结合可变区)的高度优选人源化抗体及其片段，当以至少约1nM至约20nM，优选约5nM至约15nM及更优选约10nM存在于标准检定分析时，将延长凝血时间至少约5秒。典型对照为进行标准PT检定分析，而未添加任何抗体或其片段。额外优选的本发明抗体及片段比例对照组，可达成至少约90％抑制TF-相依性凝血，优选达成至少约95％抑制或以上。标准PT检定分析的特例述于实施例。
虽然前文已经说明本发明的治疗性抗凝血剂组合物的范围，但预期涵盖其它包括人源化抗体及其片段的组合物。例如此种抗体及其片段可用作为唯一治疗剂，或组合一或多种其它人源化抗体或其片段来达成预定结果。此种抗体及片段也可组合其它抗体使用，特别为可与细胞上该病相关的其它标记反应的人类单克隆抗体。
前文已经说明宽广多种本发明抗体及其片段的主要使用范围，例如用来检测生物标本的天然TF，用来检测及纯化可表达TF的细胞，以及用来预防或治疗医疗病情，例如人类病人的非期望的凝血。实际上，人源化抗体可用作为分开给药组合物结合其它抗凝血剂使用，其它抗凝血剂包括阿司匹林、香豆素、肝素、水蛭素或类水蛭素。也包含共同投予抗血小板剂(例如李欧波(ReoPro)、英特革林(Integrilin)、亚各司特(Aggrestat)、普拉威(Plavix)、及/或提克里(Ticlid)及/或血栓溶解剂(例如组织胞质素原活化剂、链激酶及尿激酶)。
于具体实施例中其中此处所述治疗性抗凝血剂组合物包括一或多种人源化抗体或片段，该组合物包括抗体或其混合液溶解于可接受的载剂优选为水性载剂的溶液。前文已经叙述多种水性载剂，例如水、经缓冲的水、0.4％食盐水、0.3％甘胺酸等。此等溶液优选为无菌，且通常不含颗粒物质。组合物可藉习用的众所周知的灭菌技术灭菌。组合物可含有所需医药上可接受的辅剂物质，来近似生理条件，该等物质例如为pH调节剂及缓冲剂、毒性调整剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本调配剂的抗体浓度可有宽广变化，例如由低于约0.5％，通常于或至少约1％至高达15％或20％重量比，将根据选用的特定给药模式主要系依据流体容积、黏度等选用。概略参考雷明顿制药科学，参见上文。
若有所需，此处所述治疗性抗凝血剂组合物可经冻干供储存，而于使用前于适当载剂重新调制。此项技术显示可有效用于习知免疫球蛋白。任一种适当冻干技术及重新调制技术皆可采用。熟谙技艺人士了解冻干及重新调制可能导致不等程度的抗体活性丧失(例如使用习知免疫球蛋白、IgM抗体的活性丧失大于IgG抗体)，须调整用量浓度来补偿。
用于若干预防性用途，将治疗性抗凝血剂组合物投予尚未出现任何可检测的疾病状态的病人，将有助于提升对疾病的抵抗力。此种用量定义为「预防性有效剂量」。于此种用途，精确用量再度系依据病人健康状况及全面性免疫力状态决定，但通常剂量系于每病人每剂0.1至25毫克特别0.5至2.5毫克的范围。优选预防性用途系用来预防预定接受侵入性医疗手术后预防非期望的凝血。
如前文讨论，本发明也提供试剂盒，其包括本抗体或其片段。一具体实施例中，人源化抗体或其片段可用来对抗TF抗原，或用来检测TF抗原。如此，可提供一或多种人源化抗体其片段或单链抗体，通常呈冻干形式于容器提供。此种抗体、片段或单链抗体可共轭至前述标记或毒素，或未经共轭，此等抗体或其片段与缓冲剂(如Tris、硫酸盐、碳酸盐等)、安定剂、杀生物剂、惰性蛋白(如血浆白蛋白)等共同含括于试剂盒。通常此等材料的存在量基于活性抗体含量低于约5％重量比；通常存在总量基于抗体浓度至少约为0.001％wt.。经常需要含括惰性增量剂或赋形剂来稀释活性成分，赋形剂的存在量系占总组合物的约1％至99％wt.。若于检定分析采用可结合至嵌合型抗体的第二抗体，则第二抗体通常系存在于分开小瓶。第二抗体典型共轭至标记，且以前述抗体调配物的类似方式调配。试剂盒通常包括一组使用指征。
如前文讨论，本发明也提供于哺乳类，优选为灵长类例如人类病人抑制血液凝固的方法。
例如于一具体实施例中，该方法包括对哺乳类投予治疗有效量的此处提供的人源化抗体或其片段中的至少一种且优选为一、二或三者，其特异性结合至人类组织因子(TF)而形成复合物。典型地，因子X或因子IX结合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。大部分具体实施例中，该方法进一步包括形成抗体与TF间的特定复合物来抑制凝血。
也提供抑制哺乳类动物凝血的方法，包括对哺乳类投予治疗有效量的此处揭示的人源化抗体或其片段。典型地抗体及其片段特异性结合至人类组织因子(TF)而形成复合物；进一步，其中因子X或因子IX结合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。大部分具体实施例中，该方法进一步包括形成抗体与TF间的特定复合物来抑制凝血。
更特定实施例中，本发明提供抑制哺乳类动物凝血的方法，包括对哺乳类投予治疗有效量的此处揭示的人源化抗体或其片段。典型地抗体及其片段特异性结合至人类组织因子(TF)而形成复合物；进一步，其中因子X或因子IX结合至TF或TFFVIIa及因子X或因子IX藉TFFVIIa的活化受抑制。优选，人源化抗体或其片段于重链包括下列成分中的至少一种，优选为全部a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，d)第一构架(FR1)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1HC-08」至少为95％相同，e)第二构架(FR2)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2HC-08」至少为95％相同，f)第三构架(FR3)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3HC-08」至少为95％相同，g)第四构架(FR4)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4HC-08」至少为95％相同。
本发明的更特定具体实施例中，人源化抗体于轻链包括下列成分中的至少一种，且包括全部下列成分h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)至少为95％相同，k)第一构架(FR1)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1LC-09」至少为95％相同，l)第二构架(FR2)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2LC-09」至少为95％相同，m)第三构架(FR3)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3LC-09 」至少为95％相同，n)第四构架(FR4)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4LC-09」至少为95％相同，o)轻链恒定区，其与第14A图(SEQ ID NO.＿)或第15A图(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列至少为95％相同；以及p)重链恒定区，其与第14B图(SEQ ID NO.＿)或第15B图(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列至少为95％相同。
前述方法的更特定具体实施例中，人源化抗体或其片段于重链包括下列成分中的至少一种，优选为全部a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，d)第一构架(FR1)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1HC-08」完全相同，e)第二构架(FR2)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2HC-08」完全相同，f)第三构架(FR3)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3HC-08」完全相同，g)第四构架(FR4)其系与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4HC-08」完全相同；以及于轻链h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，
i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)完全相同，k)第一构架(FR1)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR1LC-09」完全相同，l)第二构架(FR2)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR2LC-09」完全相同，m)第三构架(FR3)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR3LC-09」完全相同，n)第四构架(FR4)其系与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO.＿)呈「FR4LC-09」完全相同，o)轻链恒定区，其与第14A图(SEQ ID NO.＿)或第15A图(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列完全相同，以及p)重链恒定区，其与第14B图(SEQ ID NO.＿)或第15B图(SEQ ID NO.＿)所示氨基酸序列完全相同。
本发明也提供多种于生物标本检测组织因子(TF)的方法。一具体实施例中，该方法包括于可形成复合物的条件下，让生物标本与此处揭示的人源化抗体或其片段接触，以及检测该复合物作为指示TF存在于生物标本。
此处所述参考文献全文以引用方式并入此处。
后文非限制性实施例系供举例说明本发明。后文实施例中及它处，述及抗体H36及H36.D2。该等抗体系与H36.D2.B7相同的抗体，但H36系衍生自母克隆，H36.D2系来自一次克隆，而H36.D2.B7系来自二次克隆。此三克隆就抑制TF能力或其它物理性质而言，未见任何差异。通常使用时，H36常用来指征由任一克隆或可产生抗体的相关细胞系所产生的抗-TF抗体。
实施例1-抗-rhTF单克隆抗体的制备及转化抗rhTF的单克隆抗体制备如后。
A.免疫接种及追加接种五头BALB/c雌小鼠使用各10微克脂质化经纯化的rhTF免疫接种。小鼠最初使用汉特氏最大力价佐剂(Hunter’s Titermax adjuvant)藉腹内注射敏化。三次最终追加接种系以0.85％氯化钠投予。追加接种分别系于初次敏化后的2、5.5及6.5个月注射。全部追加接种皆由腹内投予，但第一剂采用皮下注射。最终追加接种20系于融合前3日给予，给予20微克。
B.小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合来自经rhTF免疫接种的BALB/c小鼠脾脏的淋巴细胞使用PEG1500融合至X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞。暴露于PEG后，细胞于37℃于热失活胎牛血清培养1小时。然后融合细胞再悬浮于RPMI1640，于37℃与10％二氧化碳共同培养隔夜。细胞于次日使用RPMI1640接种，且补充巨噬细胞培养上清液。
C.ELISA展开ELISA免疫接种孔板涂覆以100微升重组组织因子(0.25微克/毫升)于以碳酸盐为主的缓冲液。全部步骤皆系于室温进行。孔板以BSA阻断，洗涤，然后加入试验标本及对照。抗原/抗体结合系通过孔板与山羊抗小鼠HRP共轭物(杰克森(Jackson)免疫研究实验室)共同培养，然后使用ABTS过氧化酶基质系统(克克格及派瑞(Kirkegaard and Perry)实验室)检测。于自动孔板读取器于405纳米波长读取吸光比。
D.rhTF融合瘤细胞系的稳定化融合后两周，开始藉特异性rhTF ELISA筛检融合瘤群落。新群落的筛检连续三周。每1至2周测试阳性克隆的抗体的持续制造，直到冷冻15株稳定克隆为止。
E.一次转化及二次转化对各株阳性稳定融合瘤进行限制稀释转化，来获得一次克隆。细胞经解冻，于培养生长一段短时间，然后由10细胞/孔稀释成0.1细胞/孔。一次克隆藉抗-rhTFELISA测试，5至6株阳性克隆经扩大及冷冻。
抗-rhTF抗体H36.D2.B7的二次克隆系来自一次克隆H36.D2，如前文说明制备及储存于液态氮。于96孔微力价孔板准备一次克隆的四种不同稀释，亦即5细胞/孔、2细胞/孔、1细胞/孔、0.5细胞/孔来开始二次转化。细胞于IMDM组织培养基稀释，培养基含有下列添加剂20％胎牛血清(FBS)，2mM L-麸胺，100单位/毫升青霉素(penicillin)，100微克/毫升链霉素(streptomycin)，1％GMS-S，0.075％NaHCO3。为了测定可分泌抗-rhTF抗体的克隆，来自0.2细胞/孔微力价孔板5个个别孔的上清液于生长2周后抽出，藉如前文说明的ELISA检定分析来测试是否存在有抗-rhTF抗体。全部5株于ELISA检定分析皆显示阳性结果，以H36.D2.B7为最佳抗体制造株。全部5克隆皆于RPMI培养基内调适及扩大，该培养基含有下列添加剂10％FBS，2mM L-麸胺，100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素及1％GMS-S，0.075％NaHCO3及0.013毫克/毫升草醯乙酸。H36.D2.B7系藉蛋白质A亲和层析术而由细胞培养的上清液纯化，于FX活化检定分析试验其抑制TFVIIa的能力。结果指征H36.D2.B7具有与H36.D2抗体的相同抑制。全部细胞皆系储存于液态氮。
F.由H36.D2.B7分离全部RNA269微克全部RNA系由2.7×105H36.D2.B7融合瘤细胞分离。全部RNA的分离系如RNeasy Midi试剂盒(RNeasy Midi Kits)方案进行，该试剂盒来自奎金(Qiagen)公司。RNA样本储存于-20℃水中至需用时。
G.cDNA的合成及H36.D2.B7基因可变区的转化为了获得cDNA的第一股，制备反应混合物，该反应混合物含有5微克如前述分离的全部RNA，反向引子亦即用于重链(HC)的JS300(全部引子识别如后)及用于轻链(LC)的OKA 57，RNase抑制剂，dNTP’s，DTT及上标II反录酶；该反应混合物于42℃培养1小时。然后反应试管于65℃培养15分钟来终止转录。冷却后，加入五单位RNase H，让反应于37℃培养20分钟。cDNA样本储存于-70℃至需用时。
分开进行PCR(聚合酶连锁反应)来转化来自如上制备的cDNA的抗-rhTFH36.D2.B7的HC及LC二者的可变区(该等HC及LC可变区的核酸序列及氨基酸序列分别显示于第1A及1B图)。进行三回合PCR。第一回合使用HC的正向引子JS002及反向引子JS300于96℃、53℃及72℃进行PCR35周期。对LC则使用正向引子JS009及反向引子OKA57，于96℃、63℃及72℃进行PCR35周期。第二回合HC及LC二者的PCR系如同第一回合进行，但pMC-18用作为HC正向引子，以及pMC-15用作为LC正向引子。第三回合使用H36HCF及H36HCR作为HC引子于96℃、60-65℃及72℃进行PCR30周期。对LC，使用H36LCF及H36LCR引子，于96℃、58℃及72℃进行PCR30周期。
使用下列引子来转化H36.D2.B7的HC及LC的可变区。OKA575’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC-3’(SEQ ID NO17)JS3005’-GAARTAVCCCTTGACCAGGC-3’(SEQ ID NO18)JS0095’-GGAGGCGGCGGTTCTGACATTGTGMTGWCMCARTC-3’(SEQ ID NO19)JS0025’-ATTTCAGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTYCARCTKC ARCARYC-3’(SEQID NO20)pMC-155’-CCCGGGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKG-3’(SEQ ID NO21)pMC-185’-CCCGGGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTC-3’(SEQ ID NO22)H36HCF5’-ATATACTCGCGACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAGATCCAGCTGCAGCAGTC-3’(SEQ ID NO23)H36HCR5’-GACCTGAATTCTAAGGAGACTGTGAGAGTGG-3’(SEQ ID NO24)H36LCF5’-TTAATTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC-3’(SEQ ID NO25)H36LCR5’-TAATCGTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTCAGCTCCAGC TTGGTCC-3’(SEQID NO26)
其中于前述SEQ ID NOS17至26K为G或T；M为A或C；R为A或G；S为C或G；V为A、C或G；W为A或T；Y为C或T。
实施例2-本发明抗体的结合活性采用如上实施例1制备的本发明的抗体。rhTF分子于大肠杆菌表达，根据标准方法藉免疫亲和层析术纯化(参见Harlow及Lane，参见上文，Ausubel等人，参见上文)。藉ELISA及表面胞质体谐振(亦即BIACore)检定分析测定抗体的结合常数(Ka)及解离常数(Kd)(例如参考Harlow及Lane，参见上文，Ausubel等人，参见上文；Altschuh等人，生物化学，316298(1992)；及法玛西亚(Pharmacia)生物传感器公司揭示的BIACore方法)。用于BIACore检定分析，rhTF根据制造商指征制动于生物传感器芯片。各抗体常数系于四种抗体浓度(0.125nM、0.25nM、0.5nM及1nM)测定。
蛋白质浓度系藉标准检定分析(M.M.Bradford，分析生物化学，72248(1976))使用牛血清白蛋白作为标准品及市售染料试剂(拜雷公司(Bio-Rad))测定。
第2图显示各抗-TF抗体的结合常数及解离常数。测试的抗TF抗体中，抗体H36具有最高结合速率(Ka＝3.1×1010M-1)及最低解离速率(Kd＝3.2×1011M)。
实施例3-FXa特异性基质检定分析通常此处所述实验系使用rhTF进行，该rhTF系使用磷脂基胆碱(0.07毫克/毫升)及磷脂基丝胺酸(0.03毫克/毫升)于70/30w/w比于50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％牛血清白蛋白(BSA)于37℃脂质化30分钟。预先形成的TFFVIIa复合物的备用溶液的制法系将5nM脂质化rhTF及5nM FVIIa于37℃培养30分钟。TFFVIIa复合物分成整份，储存于-70℃至需用时。纯化后的人类因子VII、VIIa及FX系来自酶研究实验室。下述缓冲液用于全部FXa及FVIIa检定分析25mM西比(Hepes)NaOH、5mM CaCl2、150mM NaCl、0.1％BSA、pH7.5。
筛检单克隆抗体阻断TFVIIa媒介的FX活化成为FXa的能力。FX的活化系于二连续步骤进行。于第一步骤(FX活化)，于Ca+2存在下检定分析FX转成FXa。于第二步骤(FXa活性检定分析)，FX的活化藉EDTA淬熄，FXa的形成系使用FXa特异性产色基质(S-2222)测定。S-2222及S-2288(参见后文)产色原系来自可莫基尼(Chromogenix)公司(法玛西亚西帕(Pharmacia Hepar)公司分销)。FX的活化系于1.5毫升微离心管进行，将反应与0.08nM TFVIIa共同培养可与抗-rhTF抗体共同前培养，或与缓冲液对照共同前培养。随后反应于37℃培养30分钟，然后加入30nMFX，接着又于37℃培养10分钟。FXa活性系于96孔微力价孔板测定。由步骤1取出20微升样本，混合各孔内等容积EDTA(500mM)，接着加入0.144毫升缓冲液及0.016毫升5mM S-2222基质。让反应又于37℃培养15-30分钟。然后反应以0.05毫升50％乙酸淬熄，随后记录各反应于405纳米的吸光比。TFFVIIa活性的抑制系由实验样本(加抗体)及对照样本(不含抗体)的OD405nm值求出。若干实验中，抗-rhTF抗体、TFFVIIa及FX同时添加来检测结合竞争作用。第3图显示H36.D2MAb(粗体)抑制TFFVIIa对FX的活性至比其它接受试验的抗-rhTF Mabs至显著更高程度(95％)。
实施例4-FVIIa特异性基质检定分析单克隆抗体进一步藉FVIIa特异性检定分析筛检。本检定分析中，5nM脂质化rhTF首先于96孔微力价孔板，与缓冲液(对照组)或50nM抗体(实验组)于37℃共同培养30分钟，然后混合5nM纯化后的FVIIa(VT＝0.192毫升)，接着于37℃培养30分钟。然后8微升20mM FVIIa特异性基质S-2288备用溶液添加至各孔(终浓度0.8mM)。随后反应于37℃培养1小时。于使用0.06毫升50％乙酸淬熄反应后，测量于405纳米的吸光比。由实验样本及对照样本的OD405nm值求出TFFVIIa活性的抑制百分比。
第4图显示当抗体与TF前培养(于FVIIa添加前培养)、或抗体添加至TF与FVIIa前培养(添加抗体前前培养)时，H36抗体不会显著阻断TFFVIIa对S-2288基质的活性。如此指征H36不会干扰TF与FVIIa间的交互作用(结合)，H36也不会抑制TFFVIIa对胜基质的活性。
实施例5-凝血酶原时间(PT)检定分析经过钙化的血浆于添加血栓生成素(TF)后数秒时间内将凝固；称作为「凝血酶原时间」(PT)的现象。长期PT典型为抗凝血活性的有用指针(例如参考Gilman等人，参见上文)。
H36.D2抗体根据标准方法，使用市售人血浆(Ci-Trol控制(Ci-Trol Control)，I级来自巴斯特(Baxter)诊断公司)，研究影响PT的活性。凝血反应系于CA+2存在下添加脂质化rhTF而引发凝血反应。凝血时间系藉自动凝血定时器(MLA伊莱左(Electra)800)监视。PT检定分析系将0.2毫升脂质化rhTF(于50mM Tris-HCl、pH7.5缓冲液，含有0.1％BSA、14.6mM CaCl、0.07毫克/毫升磷脂基胆碱及0.03毫克/毫升磷脂基丝胺酸)至塑料双孔容器而引发。双孔容器各含0.1毫升与0.01毫升缓冲液(对照样本)或抗体(实验样本)前培养1-2分钟。藉H36.D2抗体抑制TF媒介的凝血系使用TF标准曲线计算，其中log[TF]系对log凝血时间作图。
第5图显示H36.D2抗体实质上可抑制TF引发的人血浆凝血。H36.D2抗体显著延长PT时间，显示抗体为TF引发凝血的有效抑制剂(高达约99％抑制作用)。
实施例6-FX与H36.D2抗体竞争结合至TFFVIIa复合物于TFFVIIa、FX与H36.D2抗体间进行竞争实验。第6A图显示实验结果，实验中预先形成的TFFVIIa复合物(0.08nM)于缓冲液于37℃前培养30分钟，缓冲液分别包括0.02nM、0.04nM、0.08nM及0.16nM H36.D2单克隆抗体。然后FX(30nM)添加至TFFVIIa与H36.D2抗体混合物，让混合物又于37℃培育10分钟。FX的活化如先前说明使用EDTA淬熄。如此产生的FXa系藉如上实施例3所述的FXa特异性检定分析测定。
第6B图显示遵照前述进行实验所得结果，但H36.D2抗体、预先形成的TFFVIIa及FX系同时添加来开始FX活化检定分析。
第6A及6B图所示资料，显示H36.D2抗体与FX竞争结合至预先形成的TFFVIIa复合物。
实施例7-于细胞培养TF活性的抑制J-82是一种可丰富表达天然人类TF为细胞表面蛋白的人类膀胱癌细胞系(来自ATCC)。为了了解H36.D2抗体是否可阻止FX结合至显示于细胞表面的天然TF，于FVII存在下，于微力价孔板进行J-82 FX活化检定分析(参考D.S.Fair等人，生物化学期刊26211692(1987))。于各孔加入2×105细胞，与50纳克FVII、缓冲液(对照样本)或抗TF抗体(实验样本)于37℃培养2小时。随后各孔以缓冲液洗涤，于室温添加0.3毫升FX(0.05毫克/毫升)至各孔经历30分钟时间。某些情况下，于FX的同时添加抗体，来检测对天然TF的结合竞争。随后取出0.05毫升整份，添加至96孔微力价孔板的新孔，孔内含有0.025毫升100mM EDTA。FXa活性系藉前文实施例3所述FXa特异性检定分析测定。于J-82细胞表面，TF活性的抑制作用系于无抗体存在下(对照样本)及有抗体存在下(实验样本)的OD405nm求出。
第7图显示H36.D2抗体结合表达于J-82细胞膜的天然TF，且抑制TF媒介的FX的活化。结果指征抗体与FX竞争显示于细胞表面的天然TF。
由如下实施例8的资料，结果也显示H36.D2抗体可结合于细胞膜的天然TF的构象抗原决定部位。
实施例8-H36.D2抗体特异性结合至天然rhTFH36.D2抗体结合至天然rhTF及非天然rhTF的评估系藉简化墨点检定分析进行。特别，rhTF于如下三种缓冲液各自稀释为30微克/毫升10mM Tris-HCl，pH 8.0；10mM Tris-HCl，pH8.0及8M尿素；以及10mM Tris-HCl，pH8.0，8M尿素及5mM二硫赤丝醇。于Tris缓冲液培养可保持rhTF呈天然形式，而使用8M尿素及5mM二硫赤丝醇产生非天然rhTF(变性rhTF)。各样本于室温培养24小时。培养后，米里普伊目比伦(Millipore Immobilon)(7×7厘米截面)膜以甲醇预先湿润，接着以25mM Tris，pH10.4，含20％甲醇湿润。于膜风干后，各试样(30微克/毫升)约0.5微升、1微升及2微升施用至该膜及风干。通过含5％(w/v)脱脂乳及5％(w/v)NP-40的PBS阻断膜的后，膜使用H36.D2抗体探测，接着与山羊抗小鼠IgG过氧化酶共轭物(来自杰克森免疫研究实验室)共同培养。与ECL西方墨点试剂，根据制造商指征(阿莫山(Amersham)公司)培养后，使用塑料薄膜(沙朗包裹膜(SaranWarp))包裹，曝光于X光底片经历不等时间。
第8A图显示于Tris缓冲液、或Tris缓冲液加8M尿素(第1及2线道)存在下，H36.D2单克隆抗体结合天然TF的构象抗原决定部位。接受自动放射性摄影曝光40秒。但当天然TF使用8M尿素及5mM DTT变性时，H36.D2的结合显著减少或消除(第三线道)。第8B图为过度曝光自动放射性照片，显示H36.D2抗体残余结合至非天然(亦即变性)rhTF。过度曝光约曝光120秒。单独使用8M尿素处理由于TF的两个双硫键不会被还原，可能只导致天然rhTF的部分变性。也可能部分变性的TF于尿素被去除时，于后来的墨点处理过程中再折回天然构型。此等结果可明白区别不会结合变性TF的优选本发明抗体，比先前报告的抗体，先前报告的抗体不会选择性结合至构象抗原决定部位，但可结合至变性TF(参考美国专利5,437,864，其中第18图西方墨点分析显示结合至藉SDS变性的TF)。
实施例9-抗组织因子抗体的人化先前实施例说明如何制造及使用称作为H36.D2(如前文讨论，偶尔也称作为H36)的特定鼠抗体。本例显示如何制造及使用该抗体的人化版本。人化H36抗体有多种用途，包括有助于降低人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应的可能。此等非期望的反应及其它反应造成H36抗体用于人类治疗应用时的问题。
A.嵌合型抗组织因子抗体(cH36)的制备前述H36抗体为IgG2a鼠抗体。H36首先转成临床发展用鼠-人嵌合型抗体。为了达成此项目的，H36的踵链基因及轻链基因经转化(参考美国专利第5,986,065号)。重链可变区融合至人IgG4恒定(Fc)领域，轻链可变区融合至人κ轻链恒定领域。结果所得IgG4κ嵌合型抗体标示为Sunol-cH36。对于H36或cH36用于慢性病病人的多项用途，以完全人化cH36为佳，故其将减少或消除任何人抗小鼠抗体免疫反应。cH36的人化说明如后。
B.cH36抗体的人化嵌合型抗组织因子抗体cH36的人化系使用「最佳匹配」方法达成。此种方法利用具有已知氨基酸序列的大量人类IgGs可由公开数据库取得故占尽优势。于cH36的小鼠中可变区及轻可变区的个别构架与于Kabat数据库(参考http//immuno.bme.nwu.edu)的对应人构架比对。使用如下标准来选出供人化用的预定人IgG构架(1)不匹配的氨基酸数目维持尽可能低。(2)「光标」区段内部的氨基酸(此区段的氨基酸可调整CDR结构，以及微调于抗原的匹配。参考Foote，J.及Winter，G.，分子生物学期刊224，(2)487-499 )保持不变。(3)评比类似候选者时保留氨基酸取代较有利。用于此比对的匹配程序参考Kabat’s首页于immuno.bme.nwu.edu)(Johnson G，Wu T.「Kabat数据库及其应用未来方向」核酸研究(2001)29205-206)。该程序可找出小鼠序列与Kabat数据库的人序列间的同质区且校准该同质区。通过使用此种独特最佳匹配方法，预期目标IgG的人化轻链或重链可变区可具有全部四种FRs，该等FRs系衍生自少至一个人IgG分子或多达四个不同人IgG分子。
(i)人IgGκ轻链可变区构架的选择cH36 LC的各个构架的氨基酸序列系与Kabat数据库中的人IgGκ轻链可变区的对应FR的氨基酸序列比对。最佳匹配的FR系基于前述三个标准作选择。
具有Kabat数据库ID No.005191的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 LC FRI。具有Kabat数据库ID No.019308的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 LC FR2。于cH36 LC FR1作下列突变来匹配具有Kabat数据库ID No.005191的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列Q11L、L15V、E17D、S18R。对cH36 LC FR2作一个突变Q37L来匹配具有Kabat数据库ID No.019308的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列(参考表1A有关序列信息)。
具有Kabat数据库ID No.038233的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 LC FR3。具有Kabat数据库ID No.004733的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 LC FR4。于cH36 LC FR3作下列突变来匹配具有Kabat数据库ID No.038233的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列K70 D、K74T、A80P、V84A、N85T。对cH36 LC FR4作两个突变A100Q及L106I来匹配具有Kabat数据库ID No.004733的人IgGκ轻链可变区的氨基酸序列(参考表1B有关序列信息)。
(i)人IgGκ重链可变区构架的选择cH36 HC的各个构架的氨基酸序列系与Kabat数据库中的人IgGκ重链可变区的对应FR的氨基酸序列比对。最佳匹配的FR系基于前述三个标准作选择。
具有Kabat数据库ID No.000042的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 HC FR1。具有Kabat数据库ID No.023960的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 HC FR2。于cH36 HC FR1作下列突变来匹配具有Kabat数据库ID No.000042的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列E1 Q、Q5 V、P9 G、L11V、V12 K、Q19 R、T24 A。对cH36 LHC FR2作二个突变H41P及S44G来匹配具有Kabat数据库ID No.023960的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列(参考表2A有关序列信息)。
具有Kabat数据库ID No.037010的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 HC FR3。具有Kabat数据库ID No.000049的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列选用于人化cH36 HC FR4。于cH36 HC FR3作下列突变来匹配具有Kabat数据库ID No.037010的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列S76 T、T77 S、F80 Y、H82 E、N84 S、T87 R、D89 E、S91 T。对cH36 HC FR2作一个突变L113 V来匹配具有Kabat数据库ID No.000049的人IgGκ重链可变区的氨基酸序列(参考表2B有关序列信息)。
表1A及1BcH36与人轻链(LC)FR序列的比较表1A

表1B

表2A及2BcH36与人重链(HC)FR序列的比较表2A

表2B

一旦已经决定了期望的人构架，使用以下三项技术来于轻链及重链达成预定氨基酸取代(1)使用常规PCR来转化，导入转化部位或诊断核酸内切酶部位，以及来改变位在可变区末端的氨基酸残基。(2)以PCR为主的突变发生作用，用来一次改变多个氨基酸残基，特别此等氨基酸残基位在可变区中央。(3)部位取向突变发生，用来一次导入一或二个氨基酸取代。遵照史左基因(Stratagene’s)「快速改变部位取向突变发生试剂盒」(型号200518)所述方案进行部位取向突变发生。
于各步骤后，部分人化克隆经过定序，部分可变区随后被转化于表达载体。质体tKMC180用来表达LC突变株，以及pJRS355或pLAM356载体分别用来表达HC突变株为IgG1或IgG4。然后部分克隆经组合以及于COS细胞一过性表达，藉ELISA测定表达程度。
抗-TF重及轻可变区最终完整人化形式转化成为偶尔称作为「mege载体」，以及转移感染入CHO细胞及NSO细胞供IgG表达。然后适当细胞系用来产生足够分析量的人源化抗-TF。所得人化版本来源100％皆为人类来源(当不考虑CDR序列时)。人化IgG4κ版本标示为hFAT(人化IgG4抗组织因子抗体)，IgG1κ版本标示为hOAT(人化IgG1抗组织因子抗体)。此等完全人化的cH36版本意图用来治疗慢性适应症例如血栓、癌症及发炎病。
C.抗-TF抗体重链的人化1.PCR扩大且转化入抗-TF mAb cH36重链(HC)可变区的pGem T-easy系使用质体pJAIgG4TF.A8(嵌合型H36的表达载体)作为样板，以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2进行。引子TFHC1s2导入起始字码子上游的BsiW1部位，也将构架(FR)1的氨基酸E1改变成为Q。引子TFHC1as2将氨基酸变化L113改变成V导入FR4。此步骤获得组合物HC01。
2.使用先前组合物(HC01)其如下四个引子进行以PCR为主的突变发生，产生组合物HC02。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC7as。下游PCR使用引子TFHC7s及TFHC1as2。重叠PCR使用上游PCR产物及下游PCR产物作为样板，以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2获得HC02。使用引子TFHC7s及TFHC7as，将两种氨基酸改变导入FR2H41至P及S44至G。
3.使用HC02作为样板及如下四种引子的以PCR为主的突变发生产生组合物HC03。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC5as2。下游PCR使用引子TFHC5s及TFHC1as2。使用上游PCR产物及下游PCR产物作为样板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2的PCR，获得HC03。使用引子TFHC5s及TFHC5as2于FR3导入三种氨基酸变化T87至R、D89至E及S91至T。BglII部位也导入位置87。
4.使用引子TFHC2s及TFHC3as及HC03于pGem作为样板，进行PCR放大。TFHC2s位在pGem转化部位上游。TFHC3as位在构架3，于FR3导入两个氨基酸变化H82至E及N84至S。结果所得PCR带转化入pGem，然后适当大小的插子使用BsiW1及BglII消化。此片段转化入HC03，获得HC04。
5.使用HC04作样板及使用下列引子进行以PCR为主的突变发生，结果获得HC05。上游PCR使用引子TFHC1s2及TFHC6as。下游PCR使用引子TFHC6s及TFHC1as2。使用上游PCR产物及下游PCR产物作为样板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2进行突变发生PCR，获得HC05。此步骤导入下列氨基酸变化于FR3S76至T、T77至S及F80至Y。
6.使用HC05作为样板及下列四种引子的以PCR为主的突变发生产生HC06。上游PCR使用引子TFHC2s及TFHC2as2。下游PCR使用引子TFHC3s2及TFHC1as2。使用TFHC2as2的扩大导入氨基酸变化于FR1P9至G。引子TFHC3s2改变Q19成为R及T24成为A。使用上游及下游PCR产物作样板以及使用引子TFHC1s2及TFHC1as2的PCR获得HC06。
7.于FR1位置2由I点突变变成M，系于HC06组成期间自发导入。使用HC06作为样板，以及使用TFHC1s3及TFHC1as2作为引子的PCR扩大，可校正此种错误取代，也导入氨基酸变化于FR1Q5至V。所得组合物为HC07。
8.组合物HC08系通过使用HC07作样板以及使用下列引子进行以PCR为主的突变发生而制成。TFHC2s及TFHC2as3用于上游产物。下游产物先前使用TFHC1s3及TFHC1as2扩大(参考步骤7)。使用引子TFHC2as3于FR1导入两个氨基酸变化L11至V及V12至K。自发点突变结果于CDR2位置64导入F改变成为L。进一步筛检及定序所得组合物HC08R1，具有F正确序列于CDR2位置64。
9.藉部位取向突变由HC07产生两个组合物HC11及HC12。使用两种互补引子TFHC8sP及TFHC8asP连同使用CH07作为样板来制造CH11，CH11含有三个氨基酸变化于FR1G9 P、L11至V及V12至K。然后HC11经过甲基化及管柱纯化来用于下一回合部位取向突变发生。使用CH11作为样板、及使用互补引子TFHC9sL及TFHC0asL的PCR，产生HC12，HC12具有突变于FR1由V11至L。
10.组合物HC09系由HC12衍生而得，通过使用HC12作样板、及使用互补引子TFHC10sK及TFHC10asK进行PCR衍生。HC09含有氨基酸变化K12至V于FR1。
11.组合物HC10系由HC09制造。使用HC09作为样板及互补引子LV-1及LV-2的PCR，结果获得产生HC10，其于FR1含有突变由L11突变至V。
各突变步骤后，部分人化或完全人化克隆经定序，部分可变区后来转化入表达载体。pJRS355或pLAM356载体用来表达HC突变株融合至人IgG1或IgG4至Fc。
第13A图摘要说明步骤1-11，显示于FR1-4导入递增氨基酸变化。HC08的外，全部其它重链突变株及cH36含有F于CDR2的位置64。HC08于位置64具有突变由F突变成L。第13B-D图显示重链CDR序列。
用于重链人化的引子TFHC1s25’TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC3’TFHC1as25’AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG3’TFHC7s5’GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG3’TFHC7as5’CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC3’TFHC5s5’GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG3’TFHC5as25’CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC3’TFHC3as5’GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’
TFHC6s5’CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG3’TFHC6as5’CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG3’TFHC2as25’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC3’TFHC3s25’CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC3’TFHC1s35’TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC3’TFHC2as35’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC3’TFHC9sL5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG3’TFHC9asL5’CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’TFHC8sP5’GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC3’TFHC8asP5’GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3’TFHC10sK5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC3’TFHC10asK5’GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’LV-15’CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG3’LV-25’CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG3’D.抗-TF抗体轻链的人化1.使用质体pJAIgG4TF.A8(嵌合型H36的表达载体)作为样板以及引子TFLC1s2.1及TFLC1as2进行PCR扩大。此步骤导入编码区上游的转化部位AgeI。也于FR4导入L106I突变。此步骤获得组合物LC03。
2.使用互补引子TFLC5s及TFLC5as及使用LC03作为样板进行部位取向突变发生。此步骤导入突变Q37L与FR2，加入PstI部位供诊断目的。此种新组合物定名为LC04。
3.使用LC04作为样板以及使用引子TFHC2s及TFLC2as1进行PCR扩大。此步骤产生片段A其将用于步骤6。此步骤于FR1导入Q11L及L15V突变。
4.使用LC04作样板及使用引子TFLC1s2.1及TFLC1asR进行PCR扩大。如此导入KpnI部位于LC可变区末端。此PCR片段转化入pGEM，获得pGEM04K，其将用于步骤6。
5.使用LC04作为样板及使用引子TFLC2s及TFLC4as进行PCR扩大。此步骤产生片段C其将用于步骤6。此步骤导入三个突变E17D、S18R于FR1及A100Q于FR4。
6.使用片段A及片段C作为样板，及使用引子TFLC2s及TFLC4as，进行以PCR为主的突变发生，获得片段D。片段D转化入pGEM04K，获得组合物LC05。
7.使用pGEM04K作样板及使用引子TFLC1s2.1及TFLC4as，进行PCR扩大。此步骤产生片段H，其随后被转化入pGEM04K。如此导入A100Q突变于FR4，组合物定名为LC06。
8.使用LC06作为样板其使用引子TFLC1s2.1及TFLC3as，进行PCR扩大。此步骤产生片段I，其将用于步骤10。如此导入K70D及K74T突变于FR3。
9.使用LC06作为样板其使用引子TFLC3s2及TFLC4as，进行PCR扩大。此步骤产生片段F，其将用于步骤10。如此导入A80P突变于FR3。
10.使用片段I及片段F作为样板，及使用引子TFLC1s2.1及TFLC4as进行PCR，获得片段J。片段J转化入pGEM获得组合物LC07。
11.使用互补引子TFLC08sds及TFLC08sdsa及使用LC07作为样板，进行部位取向突变发生。此步骤导入突变V84A及N85T于FR3。此组合物定名为LC08。
12.来自含有突变Q11L、L15V、E17D、S18R及Q37L的LC09的AgeI至EcoO109I片段转化入LC08。如此获得组合物LC09。
13.使用LC09作为样板及使用互补引子LC105及LC103，进行部位取向突变发生。此步骤将T85N突变导入FR3，获得组合物LC10。
14.使用LC10作为样板及使用互补引子LC115及LC113，进行部位取向突变发生。此步骤将D70K突变导入FR3。如此获得组合物LC11。
15.使用LC11作为样板及使用互补引子LC125a及LC123a，进行部位取向突变发生。此步骤将K42Q突变导入FR2。如此获得组合物LC12。
于各个突变步骤后，部分人化LC克隆、或全部人化LC克隆经定序，部分可变区后来转化入表达载体tKMC180。
第12A图摘述步骤1-15，显示导入轻链FR1-4的递增氨基酸变化。第12B-D图显示轻链CDR序列。
用于轻链人化的寡核苷酸引子TFLC1as25’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG3’TFLC1s2.15’ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC3’TFLC5s5’GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG3’TFLC5as
5’CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’TFLC2as15’CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG3’TFLC1asR5’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG3’TFLC2s5’CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC3’TFLC4as5’GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG3’TFLC3as5’GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC3’TFLC3s25’CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC3’TFLC08sds5’GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG3’TFLC08sdsa5’CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC3’LC1055’CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC3’LC1035’GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG3’LC1155’CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC3’LC1135’GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG3’LC125a5’CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG3’LC123a5’CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG3’第14图显示轻链(第14A图)及重链(第14B图)的hOAT(人化cH36-IgG1)恒定区序列。第15图显示轻链(第15A图)及重链(第15B图)的hFAT(人化cH36-IgG4)恒定区序列。各图中，构架4(FR4)可变区的最末氨基酸残基连结至hOAT及hFAT的第一氨基酸残基。
实施例10人源化抗-TF抗体的表达与纯化部分人化及全部人化LC克隆及HC克隆转化入表达载体。质体tKMC180(参考第10A-B图)用来表达融合至人κ链的LC突变株，pJRS355(参考第9A-B图)或pLAM356(参考第9C-D图)载体用来表达融合至人IgG1或融合至人IgG4的Fc的HC突变株。HC克隆及LC克隆的若干组合随后共同转移感染COS细胞。于COS细胞一过性表达的IgGs藉ELISA检定分析全IgG的产量以及结合至TF。
最终抗-TF重及轻可变区(HC08与LC09的组合)的最终完全人化形式转化入苏诺(Sunol’s)Mega表达载体(pSUN34，参考第11图)，以及转移感染CHO细胞及NSO细胞供IgG表达。转化可产生IgG4κ或IgG1κ人源化抗-TF抗体的稳定转移感染细胞系。然后选出的稳定细胞系用来制造足够分析量的人源化抗-TF。所得人化版本约95％为人类来源(不考虑CDR序列)。人化IgG4κ版本标示为hFAT(人化IgG 4抗组织因子抗体)及IgG1κ版本标示为hOAT(人化IgG1抗组织因子抗体)。完全人化cH36版本意图用于治疗慢性适应症例如癌症及发炎疾病。
可表达hOAT(HC08与LC09的组合)的NSO细胞系的一(OAT-NSO-P10A7)经解冻，于15毫升试管内补充10％FBS的10毫升IMDM培养基增量及离心。细胞丸粒再悬浮于10毫升新鲜培养基，送至T25烧瓶，于37℃于5％二氧化碳培养。为了制备足量细胞来接种中空纤维生物反应器，细胞经扩大获得总量6×108细胞。生物反应器系遵照制造商的指征手册架设。收获的细胞制作成丸粒，再悬浮于60毫升含35％FBS的IMDM，注射入生物反应器的毛细管外部空间。每日监视葡萄糖及乳酸盐浓度，收获材料经离心及汇集。收获材料藉ELISA检定分析测试抗-TF抗体浓度。然后含有抗-TF抗体(hOAT)的汇集样本如后述纯化与分析。
A.重组蛋白质A西法罗司(rProtein A Sepharose)快速流层析术重组人源化抗-TF单克隆抗体系由二轻链与二重链组成。重链为小鼠可变区(未经变更或如前述经人化)与人IgG1或IgG4 Fc领域的融合；而轻链含有小鼠可变区(未变更或如前述经人化)及人类κ领域。明确了解人IgG Fc区对蛋白质A或重组蛋白质A(rProteinA)有高度亲和力。
含有人源化抗-TF抗体(hOAT)的收获汇集物通过对每毫升样本添加0.08毫升1M Tris-HCl、pH8.0而调整至pH8.0±0.1。然后样本通过低蛋白质结合0.22微米过滤膜过滤(例如那金(Nalgene)无菌抛弃式组织培养过滤单元，具有聚醚膜，来自那吉努克(Nalge Nunc)国际公司型号167-0020)。于施用样本后重组蛋白质A管柱(来自法玛西亚公司)以5倍床容积的20mM Tris-HCl、pH8.0洗涤，来去除未结合的材料如培养基蛋白质。因收获的培养基含有高含量牛血清，故使用阶段式pH梯度洗涤来由管柱去除牛IgG。阶段式pH梯度系通过提高缓冲液B(100mM乙酸于缓冲液A(100mM乙酸钠)的相对浓度而达成。典型pH阶段式洗涤系采用20％、40％及60％缓冲液B。使用100％缓冲液B洗提管柱，基于A280来收集洗提分。汇集的洗提分藉添加1M Tris碱而调整至pH8.5。
B.Q西法罗司快速流层析术阴离子离子交换层析术可根据蛋白质的电荷而极为有效地分离蛋白质。来自重组蛋白质A管柱的洗提出且pH经过调整的样本以2倍容积水稀释，检验pH且调整至8.5。然后样本载荷至5毫升(1.6×2.5厘米)Q西法罗司快速流管柱，以20mM Tris-HCl、pH8.5平衡，管柱使用(1)5倍床容积的20mM Tris-HCl、pH8.5洗涤；及(2)4倍床容积20mM Tris-HCl、pH8.5含100mM NaCl洗涤。然后使用床容积的20mM Tris-HCl、pH8.5含500mM NaCl洗提IgG。汇集蛋白质畸峰，使用超滤装置将缓冲液交换成为PBS。
使用相同转移感染法、细胞培养法及纯化法，也制造hFAT且经纯化。
实施例11人源化抗-TF抗体的性质A.藉人源化抗-TF抗体抑制TF功能抗-TF抗体的关键性质的一系可抑制组织因子引发血液凝固的能力。纯化后的hOAT及hFAT于标准PT检定分析测定其抑制TF活性的能力。PT检定分析广用来量测组织因子相依性凝血时间。本检定分析原理为组织因子TF与血浆因子VIIa形成复合物。然后此种复合物活化因子X成为FXa；然后FXa将凝血酶原于因子Va及磷脂质存在下转成凝血酶。凝血酶最终导致形成血块。于标准PT检定分析，脂质化TF添加至血浆来引发凝血，藉欧嘉农泰尼卡(OrganonTeknika)Coag-A-Mate凝血分析仪或其相当装置记录凝血。
抗-TF抗体H36藉独特机转抑制人TF活性。H36结合至TF(自由态或复合因子VIIa)，让因子X及因子IX结合至TFVIIa复合物受抑制，如此FX及FIX藉TFVIIa的活化受阻断(参考美国专利第5,986,065号)。于PT试验，添加至人血浆的抗-TF抗体凝血时间的延长，明白指征此种TF相依性凝血受抑制。凝血时间系与TF活性量有关。通过测定一系列稀释的TF的PT凝血时间，产生TF标准曲线。由TF标准曲线资料，测定TF活性受抗-TF抗体的抑制作用。
试剂印奴文(型号68100-392)及西拙凝血控制第一级(型号68100-336)系来自VWR。脂质化重组人TF系如实施例3所述制造。
方法PT试验系使用凝血分析仪于37℃进行。PT反应的引发系通过添加0.2毫升脂质化重组人组织因子(例如印奴文)至含0.1毫升缓冲液(50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA)或抗-TF抗体的0.1毫升人血浆(西拙控制第一级)而引发。
1.根据制造商指征添加纯水至印奴文小瓶。试剂温热至37℃。储存于4-8℃，试剂可稳定数日。
2.添加1毫升纯水至各个西拙小瓶。混合至溶解。若使用多于一个小瓶，则将多个小瓶组合入一个容器(例如一根10毫升试管)。1毫升西拙可进行5次检定分析(各次检定分析使用2×0.1毫升＝0.2毫升)。西拙可储存于冰上维持数小时时间。
3.由抗-TF抗体备料，使用50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA制造一系列抗-TF抗体溶液(200mM至1600mM)。
4.添加10微升50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA或10微升稀释后的抗-TF至双孔容器的各孔，孔内含有0.1毫升西拙。使用具有0.1毫升梢端的滴量管来混合各孔。确保孔内无气泡。于抗-TF(缓冲液)与血浆(西拙)混合后，藉添加0.2毫升印奴文至血浆于10分钟以内测定凝血时间。
5.用于TF标准曲线，首先使用50mM Tris-HCl、pH7.5、0.1％BSA将印奴文(100％ TF)稀释成20％、10％、5％及2.5％。然后如步骤4但使用稀释后的印奴文样本进行PT检定分析。
表3为cH36、hOAT及hFAT对PT凝血时间的影响摘要。与表4资料比较，cH36、hOAT及hFAT显示极为强力的TF功能抑制作用。于蛋白质浓度高于12.9nM时，全部抗体皆达成约95％抑制。表3结果也指征通过前述方法，抗-TF的人化亦即cH36的人化不会对cH36的抑制活性造成显著影响，原因在于如对cH36所见，hFAT及Hoat显示抑制TF相依性凝血能力极为类似。
表3.藉嵌合型抗体(cH36)及人源化抗-TF抗体(hFAT及hOAT)#对凝血酶原时间的影响

#全部检定分析皆使用表4的相同100％TF活性(浓度)样本表4.凝血时间及相对组织因子活性(浓度)

B.亲和常数的测定人源化抗-TF抗体对TF的亲和力系使用表面质粒基因体共振(BIAcore来自法玛西亚生物传感器公司)测定，该传感器具有重组人组织因子共价制动于CM5传感器芯片上。亲和常数为藉BIAcore计算机软件，由四种抗-TF单克隆抗体浓度(0.125nM、0.25nM、0.5nM及1nM)求出的平均资料。表5指征通过前述方法抗-TF的人化亦即cH36的人化不会对cH36与TF的亲和力造成任何显著影响，原因在于cH36与hFAT对TF有类似的亲和力的故。
表5.抗-TF抗体的名目亲和力及解离常数


已经参照优选具体实施例说明本发明的细节。但本领域普通技术人员考虑此处揭示了解可于本发明的精髓及范围内做出修改及改良。
权利要求
1.一种特异性结合至人组织因子(TF)以形成复合物的人源化抗体，其中因子X或因子IX与复合物结合，而且FX或FIX被TF:FVIIa的活化受抑制。
2.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该抗体具有对TF的解离常数(Kd)小于约0.5nM。
3.根据权利要求1或2项的人源化抗体，其中该抗体的进一步特征为通过标准凝血酶原(PT)凝血检定分析，于抗体浓度小于15nM，可延长凝血时间达至少约5秒。
4.根据权利要求1或2项的人源化抗体，其中该抗体具有对TF的结合特异性约等于或大于从ATCC保藏号HB-12255保藏的细胞系H36.D2.B7所得的抗体。
5.根据权利要求1或2项的人源化抗体，其中该抗体具有对TF的结合亲和力约等于或大于以ATCC保藏号HB-12255保藏的细胞系H36.D2.B7所得的抗体。
6.根据权利要求1或2项的人源化抗体，其中该抗体包含至少一个完全小鼠互补决定区(CDR)。
7.根据权利要求1或6项的人源化抗体，其中该抗体包含至少一个完全人构架(FR)区。
8.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该抗体与人抗体具有至少约90％氨基酸序列同源性。
9.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该人源化抗体的可变区具有与人抗体可变区至少约70％氨基酸序列同源性。
10.根据权利要求1项的人源化抗体，其中各构架(FRs)1、2、3及4具有与第12A图(SEQ ID NO._)所述轻链(FR)序列至少约95％氨基酸序列同源性。
11.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该抗体包含一个轻链恒定区，其具有与第14A或15A图(SEQ ID NO._)所示序列至少约95％氨基酸序列同源性。
12.根据权利要求1项的人源化抗体，其中各构架(FRs)1、2、3及4具有与第13A图(SEQ ID NO._)所述重链序列至少约95％氨基酸序列同源性。
13.根据权利要求12项的人源化抗体，其中该抗体进一步包含一个重链恒定区，其具有与第14B或15B图(SEQ ID NO._)所示序列至少约95％氨基酸序列同源性。
14.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该抗体具有IgG1(hOAT)及IgG4(hFAT)同基因型。
15.一种根据权利要求1项的人源化抗体的人组织因子结合片段。
16.根据权利要求15项的人组织因子结合片段，其中该片段为Fab、Fab’或F(ab)2。
17.一种人源化抗体，包含至少一个鼠互补决定区(CDR)，其中该抗体特异性结合至人组织因子(TF)来形成一种复合物，其中因子X或因子IX结合至TF或TF:FVIIa，并且由TF:FVIIa激发的活化受抑制。
18.根据权利要求17项的人源化抗体，其中全部互补决定区(轻链及重链)皆为鼠互补决定区。
19.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该抗体进一步包含至少一个人构架(FR)区。
20.根据权利要求19项的人源化抗体，其中全部构架(轻链及重链)的氨基酸序列皆为人构架，或2个氨基酸取代以内为人构架。
21.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第一CDR(CDR1)是与第13B图(SEQ ID NO._)所示CDR1的氨基酸序列至少95％相同。
22.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第二CDR(CDR2)系与第13C图(SEQ ID NO._)所示CDR2的氨基酸序列至少95％相同。
23.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第三CDR(CDR3)系与第13D图(SEQ ID NO._)所示CDR3的氨基酸序列至少95％相同。
24.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第一CDR(CDR1)系与第12B图(SEQ ID NO._)所示CDR1的氨基酸序列至少95％相同。
25.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第二CDR(CDR2)系与第12C图(SEQ ID NO._)所示CDR2的氨基酸序列至少95％相同。
26.根据权利要求17项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第三CDR(CDR3)系与第12D图(SEQ ID NO._)所示CDR3的氨基酸序列至少95％相同。
27.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第一构架(FR1)系与第13A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
28.根据权利要求27项的人源化抗体，其中该FR1包含下列氨基酸变化中的至少一种E1至Q；Q5至V；P9至G；L11至V；V12至K；Q19至R；及T24至A。
29.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第二构架(FR2)系与第13A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
30.根据权利要求29项的人源化抗体，其中该FR2包含下列氨基酸变化中的至少一种41H至P；以及44S至G。
31.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第三构架(FR3)系与第13A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
32.根据权利要求31项的人源化抗体，其中该FR3包含下列氨基酸变化中的至少一种76S至T；77T至S；80F至Y；82H至E；84N至S；87T至R；89D至E；以及91S至T。
33.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该重链超可变区的第四构架(FR4)系与第13A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
34.根据权利要求33项的人源化抗体，其中该FR4包含如下氨基酸变化113L至V。
35.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该轻链超可变区的第一构架(FR1)系与第12A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
36.根据权利要求35项的人源化抗体，其中该FR1包含下列氨基酸变化中的至少一种11QL至L；15L至V；17E至D；以及18至R。
37.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该轻链超可变区的第二构架(FR2)系与第12A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
38.根据权利要求37项的人源化抗体，其中该FR2包含如下氨基酸变化37Q至L。
39.根据权利要求19项的人源化抗体，其中该轻链超可变区的第三构架(FR3)系与第12A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
40.根据权利要求39项的人源化抗体，其中该FR3包含如下氨基酸变化70K至D、74K至T、80A至P、84A至V及85N至T。
41.根据权利要求40项的人源化抗体，其中该轻链超可变区的第四构架(FR4)系与第12A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
42.根据权利要求41项的人源化抗体，其中该FR4包含如下氨基酸变化100A至Q；及106L至I。
43.一种根据权利要求17项的人源化抗体的人组织因子结合片段。
44.根据权利要求43项的人组织因子结合片段，其中该片段为Fab、Fab’或F(ab)2。
45.一种人源化抗体，其包含至少一个鼠互补决定区(CDR)，其中该抗体特异性结合至人组织因子(TF)而形成一种复合物，以及进一步其中因子X或因子IX结合至TF或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，在重链上该抗体包含a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，d)第一构架(FR1)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，e)第二构架(FR2)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，f)第三构架(FR3)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，以及g)第四构架(FR4)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同。
46.根据权利要求45项的抗体，在轻链上进一步包含h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，k)第一构架(FR1)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，l)第二构架(FR2)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，m)第三构架(FR3)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，以及n)第四构架(FR4)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同。
47.根据权利要求45项的抗体，进一步包含第14A图(SEQ ID NO._)或第15A图(SEQ ID NO._)的轻链恒定序列。
48.根据权利要求45项的抗体，进一步包含第14B图(SEQ ID NO._)或第15B图(SEQ ID NO._)的重链恒定区。
49.一种根据权利要求45项的人源化抗体的人组织因子结合片段。
50.根据权利要求45项的人组织因子结合片段，其中该片段为Fab、Fab’或F(ab)2。
51.一种人源化抗体，其在重链上包含a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，d)第一构架(FR1)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，e)第二构架(FR2)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，f)第三构架(FR3)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及g)第四构架(FR4)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及以及在轻链上h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，k)第一构架(FR1)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，l)第二构架(FR2)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，m)第三构架(FR3)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，以及n)第四构架(FR4)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同。
52.根据权利要求51项的抗体，进一步包含第14A图(SEQ ID NO._)或第15A图(SEQ ID NO._)的轻链恒定序列。
53.根据权利要求51项的抗体，进一步包含第14B图(SEQ ID NO._)或第15B图(SEQ ID NO._)的重链恒定序列。
54.根据权利要求51项的人源化抗体，其中该抗体具有IgG1或IgG4同基因型。
55.一种权利要求4项的人源化抗体的人组织因子结合片段。
56.根据权利要求55项的人组织因子结合片段，其中该片段为Fab、Fab’或F(ab)2。
57.根据权利要求1项的人源化抗体，其中该抗体为单克隆抗体。
58.一种单链抗体，包含权利要求1项的抗体的超可变区。
59.一种经分离的核酸，其编码权利要求1项的人源化抗体的重链或轻链中的至少一种。
60.一种重组载体，其包含权利要求59项的经分离的核酸。
61.一种宿主细胞，其包含权利要求60项的重组载体。
62.一种组合物，包含权利要求1项的人源化抗体，以及至少一种医药上可接受的载剂。
63.一种抑制哺乳类动物血液凝固的方法，该方法包含对该哺乳类动物投予有效量的权利要求1项的人源化抗体或其片段，其系特异性结合至人组织因子(TF)而形成复合物，其中因子X或因子IX结合至TF或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，该方法进一步包括介于抗体与TF间形成一种特定复合物来抑制血液的凝固。
64.一种于哺乳类抑制血液凝固的方法，该方法包含对该哺乳类动物投予有效量的根据权利要求7项的人源化抗体或其片段，其中该抗体或其片段特异性结合至人组织因子(TF)而形成复合物，以及进一步其中因子X或因子IX结合至TF或TF:FVIIa以及藉TF:FVIIa的活化受抑制，该方法进一步包括介于抗体与TF间形成一种特定复合物来抑制血液的凝固。
65.一种抑制哺乳类动物血液凝固的方法，该方法包含对该哺乳类动物投予有效量的人源化抗体或其片段，其中该抗体特异性结合至人组织因子(TF)而形成一种复合物，而且其中因子X或因子IX结合至组织因子(TF)或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，该抗体或片断在重链上包含a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，d)第一构架(FR1)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，e)第二构架(FR2)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，f)第三构架(FR3)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，g)第四构架(FR4)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同；以及于轻链，h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，k)第一构架(FR1)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，l)第二构架(FR2)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，m)第三构架(FR3)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，n)第四构架(FR4)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)至少为95％相同，o)轻链恒定区，，其与第14A图(SEQ ID NO._)或第15A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同，以及p)重链恒定区，，其与第14B图(SEQ ID NO._)或第15B图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列至少95％相同。
66.一种抑制哺乳类动物血液凝固的方法，该方法包含对该哺乳类动物投予有效量的人源化抗体或其片段，其中该抗体特异性结合至人组织因子(TF)而形成一种复合物，以及进一步其中因子X或因子IX结合至组织因子(TF)或TF:FVIIa以及由TF:FVIIa的活化受抑制，该抗体在重链包含a)第一CDR(CDR1)其与第13B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，b)第二CDR(CDR2)其与第13C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，c)第三CDR(CDR3)其与第13D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，d)第一构架(FR1)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，e)第二构架(FR2)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，f)第三构架(FR3)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，g)第四构架(FR4)，其与第13A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同；以及在轻链包含h)第一CDR(CDR1)其与第12B图所示CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，i)第二CDR(CDR2)其与第12C图所示CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，j)第三CDR(CDR3)其与第12D图所示CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，k)第一构架(FR1)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，l)第二构架(FR2)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，m)第三构架(FR3)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，n)第四构架(FR4)，其与第12A图所示氨基酸序列(SEQ ID NO._)完全相同，o)轻链恒定区，，其与第14A图(SEQ ID NO._)或第15A图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列完全相同，以及p)重链恒定区，，其与第14B图(SEQ ID NO._)或第15B图(SEQ ID NO._)所示氨基酸序列完全相同。
67.一种在生物样本检测组织因子(TF)的方法，该方法系于可形成复合物的条件下，让一种生物样本与权利要求1项的抗体接触，以及检测该复合物作为组织因子在生物样本的指征。
68.一种制造权利要求1项的人源化抗体的方法，其中该方法包含提供一宿主细胞，该宿主细胞经以下列任一者转化1)一编码该人源化抗体或其片段轻链的第一表达载体，以及一编码该人源化抗体或其片段重链的第二表达载体，或2)编码该人源化抗体或其片段的轻链与重链二者的单一表达载体；将该宿主细胞保持在可表达各链的生长条件下；以及分离该人源化抗体或其片段。
69.一种制造人源化抗体的方法，其中该抗体包含a)比较来自啮齿类动物抗体的轻链构架的氨基酸序列与相应人类抗体构架序列的集合，b)由该集合选出与相应啮齿类动物轻链构架具有最大氨基酸序列同源性的人类构架序列，c)突变编码啮齿类动物轻链构架的DNA片断来编码一种人源化轻链构架，其具有氨基酸序列是与步骤b)选定的人类构架序列实质相同，d)对啮齿类动物轻链的个别构架重复步骤a)至c)，来产生多个DNA序列，其中各个序列编码一种人化轻链构架，其中于步骤b)选定的对应人类构架序列个别是由相同或不同的人抗体制备，e)将步骤d)制造的编码人化构架序列的DNA序列，组装成为一第一载体，其编码至少啮齿类动物抗体的轻链可变区；以及f)于足够制造人源化抗体的条件下，将组装后的载体导入一适当宿主内。
70.根据权利要求69项的方法，其中该方法进一步包含g)比较来自啮齿类动物抗体的重链构架的氨基酸序列与对应人类抗体构架序列的集合，h)由该集合选出与对应啮齿类动物重链构架具有最大氨基酸序列同源性的人类构架序列，i)突变编码啮齿类动物重链构架的DNA片断来编码一种人化重链构架，其具有氨基酸序列是与步骤h)选定的人类构架序列实质相同；以及j)对啮齿类动物重链的个别构架重复步骤g)至i)，来产生多个DNA序列，其中各个序列编码一种人化重链构架，其中于步骤h)选定的对应人类构架序列个别系由相同或不同的人抗体制备。
71.根据权利要求70项的方法，其中该方法进一步包含将步骤j)制造的编码人源化构架序列的DNA序列，组装成为一第二载体，其编码至少啮齿类动物抗体的重链可变区；以及在足够制造人源化抗体的条件下，将组装后的第一及第二载体导入宿主内。
72.根据权利要求70项的方法，其中该方法进一步包含将步骤j)制造的编码人源化构架序列的DNA序列，组装成编码至少啮齿类动物抗体的重链可变区及轻链可变区的第一载体；以及进一步将组装后的第一载体在足够制造人源化抗体的条件下导入宿主内。
全文摘要
本发明包括抗体，该抗体通过以高度亲和力及特异性结合天然人类TF而提供优异抗凝血活性。本发明的抗体可于体内有效抑制血液凝固。本发明抗体可结合天然人类TF，或为单独TF、或呈TFFVIIa复合物形式存在，有效防止因子X或FIX结合至TF或该复合物，因而减少血液的凝固。优选本发明抗体可特异性结合天然人类TF的主要构象抗原决定部位，该抗原决定部位提供意想不到的强力抗原决定簇。本发明也提供结合至该TF的人源化抗体及其片段。
文档编号C07K16/36GK1599624SQ02824258
公开日2005年3月23日 申请日期2002年10月29日 优先权日2001年10月29日
发明者焦建安, H·C·王, E·L·涅韦斯, L·A·莫斯克拉 申请人:苏诺尔分子公司