专利名称：一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法。
背景技术：
自上世纪50年代美国成功实施世界上首例肾移植以来，器官移植作为一项划时代的新技术在过去的50多年中得到了蓬勃发展，特别是随着八十年代末免疫抑制剂的出现，更是极大地提高了器官移植的成功率和受者的存活率，至今全球大约已经有60多万患者接受了包括肾、肝、心在内的器官移植手术。我国从上世纪60年代开展器官移植以来，至2006年全国年器官移植数已位居全球第二位，取得了长足的进步和发展。移植物发生免疫排斥反应是自器官移植出现后就一直困扰着国内外学者的最大瓶颈，虽然移植免疫机制的研究在不断深入，大量新免疫抑制药物在不断涌现，但是不可否认目前国内外依然面临着如移植后移植物发生免疫排斥机率仍然较高，免疫抑制剂费用昂贵及长期应用后发生肿瘤、感染的机会大大增加等诸多问题。 多年来的移植免疫研究表明，移植成功与否的关键取决于供、受者间组织相容性抗原是否一致或相近。一直以来，学界都将研究重点放在了经典的主要组织相容性复合体(major histocompability complex, MHC),即 MHC-I 和 MHC-II 上，并建立了经典的免疫排斥理论即同种异基因个体间移植后，受者T细胞通过直接或间接两条途径，在协同刺激因子的作用下获得激活，从而发动一系列免疫应答，且认为体液免疫是超急性排斥反应和加速急性排斥反应的主导机制；而急性排斥反应和慢性排斥反应主要由细胞免疫反应机制参与。因此以往在同种异体器官移植前往往需要进行供受体间的经典MHC交叉配型(主要是HLA-A, HLA-B和HLA-DR)试验，国内外的临床实验也证明了移植前经典MHC交叉配型阴性的受者和交叉配型阳性的受者相比，前者在移植物免疫排斥发生率上明显低于后者。但是后来有研究人员发现一些即使是经典MHC交叉配型一致的受者在移植后，也不能完全避免急性或慢性免疫排斥反应的发生，并且在一些肾移植前的受者体内发现了抗同种异型HLA抗体(IgG、IgM) [2，3]，提示这些抗体可能在移植肾免疫排斥发生机制中起重要作用。有学者据此提出了体液学说，即急性或慢性移植免疫排斥反应可能由受者体内存在的供体特异性的同种异型抗原抗体所介导，认为以供体特异性抗体与供体移植物抗原结合作为最初的触发点，引起了一系列级联反应最后导致移植物损伤、失去功能。在一些发生急性或慢性排斥反应的移植肾的病理检查中发现C4d的沉积恰好部分论证了该学说。有意思的是，在另外一些术前同样经过经典HLA交叉配型，且抗HLA抗体检测阴性却依然发生了急性或慢性排斥反应的受体体内，发现了大量激活的NK细胞和T细胞,说明细胞免疫反应机制的存在。近来美国学者在一些肾移植术前和术后患者的血清中均发现了抗MICA蛋白抗体，随后又在出现排斥反应被切除的移植肾中发现了更高滴度的该抗体，提示此类患者在肾移植前体内存在同种异型MICA抗原的预致敏，且抗MICA蛋白抗体在肾移植后发生的排斥反应中可能起着重要作用。但目前国内外尚未发现有针对MICA抑制器官移植术后慢性排斥反应的方法存在。目前国内外对于MICA移植免疫的研究仍然存在一些空白点①在封闭移植物经典MHC分子的条件下，仍然有部分移植物发生了急慢性排斥反应，表明有其它尚未知晓的因素引起或参与了该反应，而MICA可能是其中比较重要的因素之一。②虽然在一些肾移植前后体内及发生免疫排斥反应的脏器灌洗液中均发现了抗MICA抗体，但关于MICA参与的移植免疫排斥反应机制仍然不清楚，且目前大多研究主要集中在肾移植的细胞和分子水平，缺少其他器官如肝移植和大型动物的体内模型研究；③国内外研究者在肾移植患者发生急性或慢性排斥后切除的肾脏病理切片中发现了大量的C4d的沉积，说明存在经典的补体激活，即意味着体液免疫反应的出现，这表明以往细胞免疫机制介导急慢性排斥反应的单控移植免疫机制存在缺陷。
发明内容
为了克服因MICA过表达引起器官移植后慢性排斥反应的问题，本发明提供一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法，使用本发明所述的制备及纯化方法所得到的抗MICA抗体，能够通过封闭内源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制内源性MICA基因表达，从而达到阻断移植器官MICA表达的效果。 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法，包括以下步骤 步骤一
用淋巴细胞分离液收集外周血单核细胞，体外培养扩增，20ng/ml rMICA诱导培养，收集培养细胞；
步骤二
用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取单个核细胞蛋白质；
步骤三
串联高效液相层析(HPLC)纯化抗MICA抗体它利用不同分离模式的结合，使混合物中的肽得到更大程度的分离，并且降低低丰度肽的丢失；
步骤四
抗MICA抗体的鉴定利用rMICA,用Western Blot进行反向验证。有益效果利用本发明的方法所得到的抗MICA抗体，能够通过封闭内源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制内源性MICA基因表达，从而达到阻断移植器官MICA表达的效果，SP在器官移植术后有效降低供体器官中MICA基因及其蛋白的表达。
图I为本发明试验例供体抗MICA抗体封闭处理后血清MICA表达的实验结果图。
具体实施例方式本发明一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法，包括以下步骤
步骤一
用淋巴细胞分离液(天津TBD)收集外周血单核细胞，体外培养扩增，20ng/ml rMICA诱导培养，收集培养细胞。具体做法是，体外外周静脉血30ml，先用生理盐水稀释后，然后使用淋巴细胞分离液分离出灰白色淋巴细胞层，用PBS液对所述灰白色淋巴细胞层洗涤，在该过程中，使用台盼兰计数单个核细胞活性；利用TRIZOL (新型总RNA抽提试剂)提取经步骤一处理的灰白色淋巴细胞的RNA,利用PCR技术(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)合成和扩增特异性MICA基因片段，KpnI和XboI限制性内切酶切取所需要片段克隆入pEnter_3C质粒，经过序列筛选后利用Baculovirus Expression System and Gateway技术直接植入杆状病毒基因组内，重组的杆状病毒DNA转染S9f昆虫细胞，收集病毒后放入无血清的EXPRESS FIVE SFM 培养基中，3 天后用 50mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0.溶液透析，离心获取上清后用镍亲和力琼脂糖提取MICA蛋白，利用CENTRIC0N超滤器过滤(具体方法详见本申请人于2011年I月10日的专利申请《一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法》，申请号为 201110003536. 5)。步骤二 用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所提供)提取单个核细胞蛋白质
a.每20微升细胞沉淀加入200微升细胞浆蛋白抽提试剂A；
b.最高速剧烈震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开；
c.冰浴15分钟；
d.加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈震荡5秒，冰浴I分钟；
e.最高速剧烈震荡5秒，4°C12，000-16，OOOg离心5分钟；
f.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。步骤三
串联高效液相层析(HPLC)纯化抗MICA抗体它利用不同分离模式的结合，使混合物中的肽得到更大程度的分离，并且降低低丰度肽的丢失。步骤四
抗MICA抗体的鉴定利用rMICA,用Western Blot进行反向验证
a.将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白；
b.蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜；
c.PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合蛋白，封闭过的膜加入抗MICA—抗，室温孵育I. 5小时，抗原抗体结合，加入HRP标记的二抗，室温孵育膜I小时；
d.pvdf膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，图片扫描保存为电脑文件。试验例
肝移植动物实验和血清中MICA及其mRNA检测
I.选取经检测体内不含抗MICA和抗MHC抗体的香猪40只，体重15_20kg，雌雄不限，分开圈养于洁净级实验室中，动物相关权利和实验步骤符合国内外有关法律和条例规定。
2.以对供受体不同的实验条件为限分四组(表I.)，每组10只，供受体各5只，体重相近设空白对照组，供受体均不予任何处理；受体猪术前10天以rMICA (参考申请人于2011年I月10日的专利申请《一种可溶性人重组MICA蛋白的制备方法》，申请号为201110003536. 5)皮下注射刺激，供肝分别予以组I :空白处理；组2 :抗MICA抗体封闭处理；组3 MICA siRNA灌注；组4 :抗MICA抗体+ MICA RNAi处理。术前及术中分别保留供体血清及肝组织于一 80度冰箱中。表I.猪原位肝移植的分组与处理
权利要求
1. 一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法，其特征在于包括以下步骤 步骤一 用淋巴细胞分离液收集外周血单核细胞，体外培养扩增，20ng/ml rMICA诱导培养，收集培养细胞； 步骤二 用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取单个核细胞蛋白质； 步骤三 串联高效液相层析(HPLC)纯化抗MICA抗体它利用不同分离模式的结合，使混合物中的肽得到更大程度的分离，并且降低低丰度肽的丢失； 步骤四 抗MICA抗体的鉴定利用rMICA,用Western Blot进行反向验证。
全文摘要
本发明公开了一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法，包括以下步骤步骤一，用淋巴细胞分离液收集外周血单核细胞，20ng/mlrMICA诱导培养；步骤二，用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取单个核细胞蛋白质；步骤三，串联高效液相层析(HPLC)纯化抗MICA抗体；步骤四，抗MICA抗体的鉴定利用rMICA，用WesternBlot进行反向验证。利用本发明的方法所得到的抗MICA抗体，能够通过封闭内源性MICA蛋白、MICA siRNA抑制内源性MICA基因表达，从而达到阻断移植器官MICA表达的效果，即在器官移植术后有效降低供体器官中MICA基因及其蛋白的表达。
文档编号C07K16/18GK102911270SQ20111022352
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者曹利平, 丁国平 申请人:浙江大学