专利名称：一种从银杏叶中提取分离银杏内酯b的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取银杏内酯B的方法。
背景技术：
银杏内酯是目前强有力的特异性血小板活化因子(PAF)受体阻断剂之一，银杏内酯B是银杏内酯中对PAF受体阻断作用最强的，可剂量依赖性的消除PAF所引起的血小板聚集作用，从而防止血栓的形成。药理研究表明银杏内酯B具有抗过敏、抗炎症、抗休克作用，对缺血性损伤及器官移植排斥反应也有保护作用。银杏内酯B在目前市售的银杏叶提取物中含量较低且具有特定结构，其提取分离得到高纯度、高收率的银杏内酯B难度较大。本发明者们查阅国内外文献，目前与银杏内酯B单体分离/制备方法直接相关的授权发明或者专利主要有①ZL200310104958 (《模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法》):该方法以银杏叶为原料，经过水煮得到银杏浸膏，每克银杏浸膏加入O. 8^1. 2L乙酸乙酯萃取，模拟移动床纯化、乙醇重结晶、甲醇重结晶得到纯度大于90%的银杏内酯B单体。该发明乙酸乙酯用量很大，基于移动床色谱分离银杏内酯B，成本较高。②ZL00117758. 3 (《由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A、B的方法》):该发明是向银杏叶或其浸膏加入乙醇等浸取剂，得到的浸取液经过滤、分层，取出有机相去杂，然后经浓缩、干燥得富集GA、GB，采用制备型高效液相色谱再分离A与B。该发明的特征在于加入浸取液的同时加入氯化物盐析剂及去杂过程加入加盐或钠盐，液相色谱的分离柱流动相为乙酸乙酯和石油醚混合液，固定相为硅胶。该发明的单体纯化依赖于制备色谱，不能工业化大量生产。③ZL200410061284 (《银杏叶中银杏内酯B和白果内酯的提取方法》):该发明将银杏叶用乙醇水溶液提取，上吸附柱去杂质，然后用乙酸乙酯萃取出银杏内酯，浓缩干燥后用乙醇溶解上酸性氧化铝柱，用乙醇洗脱，洗脱液分步结晶和重结晶，获得较纯的银杏内酯B和白果内酯。该发明银杏叶醇提取液采用液液萃取，用乙醇上柱，洗脱，洗脱液中杂质较多，导致最终银杏内酯B和白果内酯的纯度不是很高，收率低，时间长。④CN101701019A (申请号200910184916.6，《一种银杏内酯A、B的分离纯化方
法》):该发明以纯度>95%的银杏总内酯为起始原料，采用重结晶-超临界CO2萃取组合工艺进行纯化，得到纯度> 99. 5%的单体GA和GB。该发明对起始原料要求较高，采用超临界CO2萃取对设备要求较高。⑤CN101412725A (申请号200710050245. 5，《从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法》)该发明以银杏叶为原料，乙醇提取，提取液减压浓缩，浓缩液中加入乙酸乙酯萃取，有机相减压浓缩至浸膏；浸膏稀释后上选择性极性无孔吸附树脂柱，用乙醇洗脱，，洗脱液浓缩后用乙醇结晶得到银杏内酯类化合物，将银杏内酯类化合物结晶上硅胶柱，用正己烷和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液浓缩结晶得到银杏内酯B单体。该发明的正相柱的洗脱为混合溶剂，不容易回收。
⑥CN101041661A (申请号200710051805. 9《一种用免疫亲和层析色谱柱提取银杏内酯B的方法》):该发明以银杏叶为原料，乙醇提取，提取液减压浓缩至粘稠物，将粘稠物上免疫亲和层析色谱柱，用磷酸缓冲液冲洗三次，然后用甲醇冲洗，即得银杏内酯B。但该方法适用于实验室少量样品制备，不能进行工业化生产。⑦CN101392000A (申请号200810046162. 3《银杏内酯A、B、C、J和白果内酯单体的高效分离纯化方法》)该发明以银杏叶为原料，乙醇提取，提取液用石油醚萃取，水相加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相减压浓缩后用甲醇溶解上制备高效液相，甲醇洗脱，分段收集洗脱液。减压浓缩至干得到单体。该发明依赖制备高效液相，适用于实验室少量样品制备，不能进行工业化生产。
⑧CN101054384 (申请号200710106040. 4《一种从银杏叶或银杏叶提取物中提取银杏内酯B的制备方法》)该发明采用高速逆流萃取、聚酰胺和大孔树脂两次柱层析分离、重结晶相结合的方法，得到纯度>95%的银杏内酯B。该发明涉及两次不同的层析分离、会增加脱除产品中树脂残留物的难度。⑨CN101302222 (申请号200810024206. 2《一种银杏内酯B原料及其制备方法》)该发明取银杏叶或银杏叶提取物，在盐酸溶液中浸煮，浸煮液过滤后采用有机溶剂萃取，得到的萃取液浓缩后添加10(Γ200目硅胶混合干燥，采用硅胶柱层析法收集富含银杏内酯B的洗脱液，经结晶得到银杏内酯B原料。其中，银杏内酯B原料纯度> 90%。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有方法提取银杏内酯B工艺复杂、成本高、纯度低、收率低和难于工业化生产的问题，而提供一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法。本发明的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法如下一、取银杏叶，加入1(Γ15倍质量的质量百分含量为50°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流f3h，过滤，收集滤液，减压浓缩去除乙醇，即得浓缩液A ;二、向步骤一得到的浓缩液A中加水溶解至浓缩液A含生药量为O. Γ0. 3g/mL,再在室温放置24 48h，取上层液，备用；三、将步骤二所得上层液减压浓缩至含生药量为O. 5^1. 5g/mL，然后以O. 5^3BV/h速度过大孔树脂柱，先用水以O. 5^3BV/h的速度洗脱，再采用质量百分含量为509Γ95%乙醇溶液以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集2 8BV的洗脱液，洗脱液浓缩去除乙醇，即得浓缩液B ；四、将步骤三所得浓缩液B加稀释剂混合均匀，在50°C 80°C温度下干燥，装柱，采用乙酸乙酯以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集1 5BV的洗脱液，浓缩去除乙酸乙酯，得浓缩液C；五、向步骤四得到的浓缩液C中加入5 20倍体积的无水乙醇溶解，再加水至不再析晶，然后室温静置养晶12 48h，过滤，收集固相物，得银杏内酯B粗品；六、将步骤五所得银杏内酯B粗品，加入8^20倍体积的质量百分含量为709Γ95%的乙醇溶液加热回流使溶解,过滤,收集滤液,室温放置析晶12 48h ；七、重复步骤六f 2次，得重结晶样品；再用5(Γ90倍体积的乙酸乙酯回流溶解得到的重结晶样品，过滤，收集溶液，室温放置析晶12 48h，再过滤，收集结晶产物，向结晶产物中加入8 20倍体积的量百分含量为70°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流使溶解，过滤，去除沉淀收集滤液，室温放置析晶12 48h，过滤，收集固相物得湿晶，在60°C 80°C温度下干燥后，即得成品银杏内酯B。结合现有银杏内酯B提取方法的分析，本发明包含以下有益效果I、本发明使用的大孔树脂为强极性树脂，包括ADS-2、NKA-9、SA-I、SA_2中的一种或几种混合。对于脂溶性成分(包括留体类、二萜、三萜香豆素等)的处理，现有方法均选择非极性或弱极性树脂，如D101、AB-8、HPD100, ADS-17等。而本发明的目标成分银杏内酯B属于二萜类的脂溶性成分，本发明采用了非常规技术手段——强极性树脂进行分离，本发明的方法提取的银杏内酯B收率高为98. 59Γ99. 5%，而经过现有方法采用的非极性或弱极性树脂的提取的银杏内酯B转移率仅为15°/Γ75%，且洗脱液中的杂质含量也较高，不利于后续的分离纯化工艺。采用本发明中的几种强极性树脂工艺简便，且使后续的分离纯化工艺简单易行，起到意料不到的效果；2、本发明在过大孔树脂洗脱液浓缩后干燥时加入稀释剂使浸膏在干燥过程中更好烘干，且分散性好，利于后续的纯化工艺；·3、本发明提供的方法中，所用溶剂仅为乙醇、乙酸乙酯，毒性较小，且均可回收重复使用，因此溶剂损耗量小，成本较低；与现有技术相比，本发明提供的方法工艺简单，生产成本较低，所得产品纯度高，收率较高，易于工业化生产。
具体实施例方式下面结合最佳的实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例。
具体实施方式
一本实施方式的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法如下一、取银杏叶，加入1(Γ15倍质量的质量百分含量为50°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流f3h，过滤，收集滤液，减压浓缩去除乙醇，即得浓缩液A ;二、向步骤一得到的浓缩液A中加水溶解至浓缩液A含生药量为O. Γ0. 3g/mL,再在室温放置24 48h，取上层液，备用；三、将步骤二所得上层液减压浓缩至含生药量为O. 5 I. 5g/mL，然后以O. 5^3BV/h速度过大孔树脂柱，先用水以O. 5^3BV/h的速度洗脱，再采用质量百分含量为509Γ95%乙醇溶液以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集2 8BV的洗脱液，洗脱液浓缩去除乙醇，即得浓缩液B ；
四、将步骤三所得浓缩液B加稀释剂混合均匀，在50°C 80°C温度下干燥，装柱，采用乙酸乙酯以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集1 5BV的洗脱液，浓缩去除乙酸乙酯，得浓缩液C；五、向步骤四得到的浓缩液C中加入5 20倍体积的无水乙醇溶解，再加水至不再析晶，然后室温静置养晶12 48h，过滤，收集固相物，得银杏内酯B粗品；六、将步骤五所得银杏内酯B粗品，加入8^20倍体积的质量百分含量为709Γ95%的乙醇溶液加热回流使溶解,过滤,收集滤液,室温放置析晶12 48h ；七、重复步骤六f 2次，得重结晶样品；再用5(Γ90倍体积的乙酸乙酯回流溶解得到的重结晶样品，过滤，收集溶液，室温放置析晶12 48h，再过滤，收集结晶产物，向结晶产物中加入8 20倍体积的量百分含量为70°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流使溶解，过滤，去除沉淀收集滤液，室温放置析晶12 48h，过滤，收集固相物得湿晶，在60°C 80°C温度下干燥后，即得成品银杏内酯B。本实施方式步骤一中所述的减压浓缩去除的乙醇以及步骤四中所述的浓缩去除乙酸乙酯，均可以回收后重复使用。本实施方式使用的大孔树脂为强极性树脂，包括ADS-2、NKA-9、SA-I、SA_2中的一种或几种混合。对于脂溶性成分(包括留体类、二萜、三萜香豆素等)的处理，现有方法均选择非极性或弱极性树脂，如D101、AB-8、HPD100、ADS-17等。而本实施方式的目标成分银杏内酯B属于二萜类的脂溶性成分，本实施方式采用了非常规技术手段——强极性树脂进行分离，本实施方式的方法提取的银杏内酯B收率高为98. 59Γ99. 5%，而经过现有方法采用的非极性或弱极性树脂的提取的银杏内酯B转移率仅为159Γ75%，且洗脱液中的杂质含量也较高，不利于后续的分离纯化工艺。采用本实施方式中的几种强极性树脂工艺简便，且使后续的分离纯化工艺简单易行，起到意料不到的效果； 本实施方式在过大孔树脂洗脱液浓缩后干燥时加入稀释剂使浸膏在干燥过程中更好烘干，且分散性好，利于后续的纯化工艺；本实施方式提供的方法中，所用溶剂仅为乙醇、乙酸乙酯，毒性较小，且均可回收重复使用，因此溶剂损耗量小，成本较低；与现有技术相比，本实施方式提供的方法工艺简单,生产成本较低,所得产品纯度高,收率较高,易于工业化生产。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的银杏叶为银杏叶粗粉。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤三中所述的大孔树脂为NKA-9、ADS-2、SA-U SA-2中的一种或几种按任意比组成的混合物。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中所述的采用质量百分含量为709Γ80%乙醇。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤三中所述的以f2BV/h的速度洗脱。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤三中所述的收集3 4BV的洗脱液。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤四中所述的以f2BV/h的速度洗脱。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤四中所述的收集2 4BV的洗脱液。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤四中所述的稀释剂加入量为每IOOkg的银杏叶提取浓缩液加入5 10kg的稀释剂。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤四中所述的稀释剂为硅藻土、微晶纤维素、碳酸氢钙、淀粉中的一种或几种按任意比混合。其它与具体实施方式
一至九之一相同。通过以下试验验证本发明的有益效果
试验I本试验的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法是按照以下步骤进行的取IOkg的银杏叶粗粉，加入15倍体积的质量百分含量为50%的乙醇，加热至回流2h，过滤，收集滤液，再向滤液中加9倍体积的质量百分含量为50%的乙醇提取lh，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，加水至浓缩液含生药量为O. lg/mL,以O. 5BV/h速度上ADS-2树脂，用水以lBV/h的速度洗至流出液无杂质后，再用质量百分含量为50%的乙醇洗脱，洗脱速度为lBV/h，收集5倍柱体积的洗脱液，洗脱液减压浓缩至稠浸膏，然后与O. 5kg淀粉混匀，在80°C的温度下干燥，得提取物；将干燥后的提取物装柱，用乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为O. 5BV/h,共收集洗脱液1BV,乙酸乙酯洗脱液浓缩至无乙酸乙酯味，加入400mL无水乙醇溶解，再加入IOOmL水，室温静置析晶12h，再采用布氏漏斗抽滤，收集固相物得银杏内酯B粗品；将银杏内酯B粗品， 用10倍体积的质量百分含量为70%乙醇回流溶解银杏内酯B粗品，过滤，收集滤液，室温放置12h，析出结晶，重复将内酯B粗品溶解、过滤和析晶的操作广2次，得结晶粗品；然后用70倍体积的乙酸乙酯回流溶解上述得到的结晶粗品，回收乙酸乙酯至有结晶析出，室温冷却析晶12h，将得到的结晶物再用15倍体积的质量百分含量为70%乙醇回流溶解，过滤，收集滤液，室温放置12h，析出结晶，滤过，干收集固相物，在60°C干燥，即得有关物质为I. 6%，得到3. Og的银杏内酯B。本试验得到的银杏内酯B的纯度为98. 5%。试验2本试验的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法是按照以下步骤进行的取IOkg的银杏叶粗粉，加入9倍体积的质量百分含量为50%的乙醇，加热回流提取2h，过滤，收集滤液，再向滤液中加7倍体积的质量百分含量为80%的乙醇提取lh，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，加水至浓缩液含生药量为O. 2g/mL，然后以2BV/h速度上NKA-9树脂，用水以lBV/h的速度洗至流出液无杂质后，再用质量百分含量为95%的乙醇洗脱，洗脱速度为O. 5BV/h，收集IBV的洗脱液，洗脱液减压浓缩至稠浸膏，然后与O. 5kg微晶纤维素混匀，在70°C的温度下干燥，得提取物；将干燥后的提取物装柱，用乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为O. 5BV/h,共收集洗脱液1BV,乙酸乙酯洗脱液浓缩至无乙酸乙酯味，加入350mL无水乙醇溶解，再加入350mL水，室温静置析晶12h，再采用布氏漏斗抽滤，收集固相物得银杏内酯B粗品；将银杏内酯B粗品，用18倍体积的质量百分含量为85%乙醇回流溶解银杏内酯B粗品，过滤，收集滤液，室温放置12h，析出结晶，重复将内酯B粗品溶解、过滤和析晶的操作广2次，得结晶粗品；然后用90倍体积的乙酸乙酯回流溶解上述得到的结晶粗品，回收乙酸乙酯至有结晶析出，室温冷却析晶12h，将得到的结晶物再用8倍体积的质量百分含量为85%乙醇回流溶解，过滤，收集滤液，室温放置12h，析出结晶，滤过，干收集固相物，在65°C干燥，即得有关物质为I. 5%，得到3. 2g的银杏内酯B。本试验得到的银杏内酯B的纯度为98. 8%。试验3本试验的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法是按照以下步骤进行的取IOkg的银杏叶粗粉，加入12倍体积的质量百分含量为50%的乙醇，加热回流提取2h，过滤，收集滤液，再向滤液中加5倍体积的质量百分含量为95%的乙醇提取lh，过滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，加水至浓缩液含生药量为O. 15g/mL，然后以2BV/h速度上SA-2树脂，用水以lBV/h的速度洗至流出液无杂质后，再用质量百分含量为80%的乙醇洗脱，洗脱速度为3BV/h，收集3倍柱体积的洗脱液，洗脱液减压浓缩至稠浸膏，然后与O. 5kg硅藻土混匀，在70°C的温度下干燥，得提取物；将干燥后的提取物装柱，用乙酸乙酯洗脱，洗脱速度为O. 5BV/h,共收集洗脱液2BV,乙酸乙酯洗脱液浓缩至无乙酸乙酯味，加入400mL无水乙醇溶解，再加入IOOmL/K，室温静置析晶12h，再采用布氏漏斗抽滤，收集固相物得银杏内酯B粗品；将银杏内酯B粗品，用16倍体积的质量百分含量为95%乙醇回流溶解银杏内酯B粗品，过滤，收集滤液，室温放置12h，析出结晶，重复将内酯B粗品溶解、过滤和析晶的操作f 2次，得结晶粗品；然后用90倍体积的乙酸乙酯回流溶解上述得到的结晶粗品，回收乙酸乙酯至有结晶析出，室温冷 却析晶24h，将得到的结晶物再用10倍体积的质量百分含量为95%乙醇回流溶解，过滤，收集滤液，室温放置24h，析出结晶，滤过，干收集固相物，在70°C干燥，即得有关物质为I. 0%，得到2. 9g的银杏内酯B。本试验得到的银杏内酯B的纯度为99. 5%。
权利要求
1.一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法如下 一、取银杏叶，加入1(Γ15倍质量的质量百分含量为50°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流r3h,过滤，收集滤液，减压浓缩去除乙醇，即得浓缩液A ； 二、向步骤一得到的浓缩液A中加水溶解至浓缩液A含生药量为O.Γ0. 3g/mL，再在室温放置24 48h，取上层液，备用； 三、将步骤二所得上层液减压浓缩至含生药量为O.5^1. 5g/mL，然后以O. 5^3BV/h速度过大孔树脂柱，先用水以O. 5^3BV/h的速度洗脱，再采用质量百分含量为509Γ95%乙醇溶液以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集2 8BV的洗脱液，洗脱液浓缩去除乙醇，即得浓缩液B ； 四、将步骤三所得浓缩液B加稀释剂混合均匀，在50°C 80°C温度下干燥，装柱，采用乙酸乙酯以O. 5^3BV/h的速度洗脱，收集1 5BV的洗脱液，浓缩去除乙酸乙酯，得浓缩液C ； 五、向步骤四得到的浓缩液C中加入5 20倍体积的无水乙醇溶解，再加水至不再析晶，然后室温静置养晶12 48h，过滤，收集固相物，得银杏内酯B粗品； 六、将步骤五所得银杏内酯B粗品，加入8^20倍体积的质量百分含量为709Γ95%的乙醇溶液加热回流使溶解，过滤，收集滤液，室温放置析晶12 48h ； 七、重复步骤六广2次，得重结晶样品；再用5(Γ90倍体积的乙酸乙酯回流溶解得到的重结晶样品，过滤，收集溶液，室温放置析晶12 48h，再过滤，收集结晶产物，向结晶产物中加入8 20倍体积的量百分含量为70°/Γ95%的乙醇溶液，加热回流使溶解，过滤，去除沉淀收集滤液，室温放置析晶12 48h，过滤，收集固相物得湿晶，在60°C 80°C温度下干燥后，即得成品银杏内酷B。
2.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤一中所述的银杏叶为银杏叶粗粉。
3.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤三中所述的大孔树脂为NKA-9、ADS-2、SA-U SA-2中的一种或几种按任意比组成的混合物。
4.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤三中所述的采用质量百分含量为70°/Γ80%乙醇。
5.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤三中所述的以l 2BV/h的速度洗脱。
6.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤三中所述的收集3 4BV的洗脱液。
7.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤四中所述的以f 2BV/h的速度洗脱。
8.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤四中所述的收集2 4BV的洗脱液。
9.根据权利要求I所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤四中所述的稀释剂加入量为每IOOkg的银杏叶提取浓缩液加入5 10kg的稀释剂。
10.根据权利要求I或9所述的一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其特征在于步骤四中所述的稀释剂为硅藻土、微晶纤维素、碳酸氢钙、淀粉中的一种或几种按任意比混合。
全文摘要
一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，本发明公开了一种从银杏叶提取分离银杏内酯B的方法，其工艺步骤如下银杏叶用乙醇提取，提取液减压浓缩得浸膏。浸膏加水稀释后过大孔树脂柱吸附，乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得稠膏，稠膏与稀释剂拌匀后烘干，将干膏装柱，用乙酸乙酯洗脱，乙酸乙酯洗脱液浓缩至无乙酸乙酯味，加入乙醇溶解，用乙醇结晶得到粗结晶，粗结晶用乙醇、乙酸乙酯重结晶即可得到纯度≥98%的银杏内酯B。本发明提供的方法工艺简单，生产成本较低，所得产品纯度高，收率较高，易于工业化生产。
文档编号C07D493/22GK102887909SQ20121044101
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者宁树一, 魏凯, 马仁强, 周清 申请人:黑龙江天宏药业股份有限公司