橄榄叶提取物以及包含该提取物的化妆品的制作方法

橄榄叶提取物以及包含该提取物的化妆品的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种橄榄叶提取物，其中包括质量分数为5％?50％的羟基酪醇，还可以包括橄榄苦甙(Oleuropein)和毛蕊花糖苷(Verbascoside)中的任意一种或几种组合。本发明还提供一种橄榄叶提取物的制备方法以及在化妆品中的应用。本发明提供的橄榄叶提取物具有较强的抗衰老作用，这是因为其能够大幅提高人体真皮层中胶原蛋白的含量，而使人体皮肤保持弹性，从根本上抑制皱纹的出现。此外，本发明提供的橄榄叶提取物还能够明显抑制自由基(DPPH)的生成，可作为制品或添加剂应用于食品、药品、护肤品和/或化妆品中，发挥抗氧化抗衰老的双重效果。
【专利说明】
橄榄叶提取物以及包含该提取物的化妆品
技术领域
[0001] 本发明属于化学领域，涉及一种提取物及包含该提取物的化妆品，尤其涉及一种 橄榄叶提取物及包含该橄榄叶提取物的化妆品。
【背景技术】
[0002] 大剂量紫外线辐射可导致不可逆的DNA损伤，致使细胞直接发生坏死，甚至癌变； 而小剂量紫外线长期照射可诱使细胞核染色体断裂、mtDNA突变和氧化应激损伤，使得细胞 内活性氧自由基(R0S)、其他氧化应激标记物等水平升高，从而启动细胞的损伤和老化过 程。
[0003] 衰老是指机体各器官功能普遍的、逐渐降低的过程，随着年龄的增长，衰老不可避 免，但是，良好的生活习惯和保健措施可以有效地延缓衰老。目前社会上针对抗衰老的产品 也层出不穷。
[0004] 油橄榄(Olea europaea L.)属木犀科(Oleaceae)、木犀榄属(Olea)常绿乔木，油 橄榄用途广泛，果实可榨油，做罐头、蜜饯和果酱等，橄榄油可配制各种软膏、抗生素和维生 素注射剂，还可以作为添加剂，添入乳制品、肉及鱼罐头中，改善了保存性及风味。
[0005] 橄榄叶具有重要的应用价值，目前在医学领域应用较多，现已发现其对包括病原 体造成的疾病，如感冒、流感、疱疹，带状疱疹，脑膜炎，结核病，泌尿道感染，疟疾，血液中毒 和手术部位感染等具有较好的治疗作用。现在医学上还认为它有助于降低血压和促进血液 循环。此外，它还有减少坏胆固醇，同时增加好胆固醇的功效。但是其在化妆品中的应用目 前还比较少，且对其作用机理的研究也不够透彻。

【发明内容】

[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供一种橄榄叶提取物，并研究了该提取物在 化妆品领域中的应用。
[0007] 本发明的第一个方面在于提供一种橄榄叶提取物，所述橄榄叶提取物中包括羟基 酪醇，所述羟基酪醇的质量分数为5%_50%，如8%、40%，优选为10-30%，如15%、20%、 25 % 等。
[0008] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶提取物中还可以包括橄榄苦苷 (Oleuropein)和毛蕊花糖苷(Verbascoside)中的任意一种或几种组合。
[0009] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄苦苷的含量为1-10%，如2.5%，7.8% 等。
[0010] 作为本发明的一个优选实施例，所述毛蕊花糖苷的含量为1-10%，如3%，6%等。
[0011] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶提取物可以是物理粉碎粉末、浸膏中 的任意一种或几种的组合。
[0012] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶提取物可以是水提物、醇提物、油提物 和超临界C02提取物中的任意一种或几种的组合。
[0013] 作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为水提取物、乙醇提取物、甲醇提 取物中的一种或几种组合。
[0014] 本发明的第二个方面在于提供一种橄榄叶提取物的制备方法，所述制备方法包括 如下步骤：
[0015] 步骤1、提供清洁的橄榄叶粉末，以溶媒:原料= 5-20:1的体积比，提取至少1次，提 取结束后混合每次的提取液，得到混合提取液；
[0016] 步骤2、将步骤1中过滤后的提取液经过浓缩制备成所述橄榄叶提取物。
[0017] 作为本发明的一个优选实施例，所述制备方法包括如下步骤：
[0018] 步骤1、提供清洁的橄榄叶粉末，以橄榄叶粉末:溶媒=lg: (5-20)mL比例，在50°c-120°C温度下提取至少1次，每次提取0.5-10h，提取结束后混合每次的提取液，得到混合提 取液；
[0019] 步骤2、浓缩所述混合提取液，制备得到所述橄榄叶提取物。
[0020] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述橄榄叶粉末为橄榄叶经过包含二氧 化氯的清水清洗、消毒，并粉碎至200目以下得到。
[0021] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中提取橄榄叶的溶媒为水、甲醇水溶液、乙 醇水溶液等中的任意一种或几种组合。
[0022]作为本发明的一个优选实施例，所述甲醇水溶液的体积浓度为30%_100%，如 40 %、95 % ;优选为50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中体积浓度为100 %时，所述溶媒即 为无水甲醇。
[0023]作为本发明的一个优选实施例，所述乙醇水溶液的体积浓度为30%_100%，如 40 %、95 % ;优选为50 % -90 %，如60 %、70 %、80 %等，其中体积浓度为100 %时，所述溶媒即 为无水乙醇。
[0024]作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶粉末在0.2-0.8MPa压力下提取，如 0 · 3MPa、0 · 6MPa，优选为 0 · 4-0 · 5MPa，如0 · 45MPa。
[0025] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶粉末在1.2-1.8MPa压力下提取，如 1 · 3MPa、1 · 6MPa，优选为 1 · 4-1 · 5MPa，如 1 · 45MPa。
[0026] 作为本发明的一个优选实施例，所述制备方法中，步骤2为，将所述混合提取液第 一次浓缩，得到浓缩液一，所述浓缩液一经过层析柱进行纯化，第二次浓缩，得到所述橄榄 叶粉末。
[0027] 作为本发明的一个优选实施例，所述纯化过程为大孔吸附树脂纯化、液相色谱柱 层析纯化、硅胶吸附纯化中的任意一种或几种组合。
[0028] 作为本发明的一个优选实施例，所述大孔吸附树脂纯化过程的条件为:温度为25 。(:-50°C，优选为30°C-40°C，所述大孔吸附树脂的型号为AB-8型、D-101、ADS-5中的任意一 种或几种。
[0029] 作为本发明的一个优选实施例，所述大孔吸附树脂吸附过程的pH值= 3-9,优选为 pH值=4-8，更优选为pH值=5-6。
[0030] 作为本发明的一个优选实施例，大孔吸附树脂吸附后，使用乙醇和/或水的混合溶 液洗脱，所述混合溶液的体积比为乙醇:水=1: (0-10)，优选为乙醇:水=1: (1-5)。
[0031] 作为本发明的一个优选实施例，所述洗脱过程中，所述混合溶液的流速为2-4BV/ 11，洗脱温度为30°050°(：。
[0032]作为本发明的一个优选实施例，还包括将得到的浸膏灭菌，所述灭菌步骤采用辐 射灭菌、70%乙醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一种或几种组合。
[0033]作为本发明的一个优选实施例，所述辐射灭菌的条件为钴60-γ射线，所述浸膏的 吸收剂量为10_30kGy，如15kGy、20kGy、25kGy等，辐射灭菌后所述橄榄叶提取物的Sal值小 于等于1〇_ 5，优选为小于等于1〇_6，如2X 10-7、5Χ10Λ
[0034]作为本发明的一个优选实施例，步骤2中，第二次浓缩后，经过干燥，得到所述橄榄 叶提取物，所述干燥的方法为电加热干燥、喷雾干燥、热空气干燥中的任意一种或几种组 合，优选为喷雾干燥。
[0035]作为本发明的一个优选实施例，所述喷雾干燥过程中，高压栗在80_120MPa压力下 将所述过滤液通过雾化器形成100-200μπι的颗粒，与所述颗粒接触的热空气的温度为60-100°C，接触时间为5-50s。
[0036]本发明的第三个方面在于提供上述任意一种橄榄叶提取物的应用。
[0037]所述橄榄叶提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮肤外 表面的制品。
[0038]其中，本发明所述橄榄叶提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化妆品 和/或护肤品。
[0039]作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品中橄榄叶提取物的含量为0.001%-50%，如0.003%，40%，优选为0.005%-30%，如 10%、20%等。
[0040] 本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种橄榄叶提取物的日化用品， 优选为包含上述任意一种橄榄叶提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化妆品和/或 护肤品中，优选为化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。
[0041] 其中，所述营养性添加剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：甲壳素、壳聚 糖、丝肽、丝素、卵磷脂、表皮细胞生长因子、海藻糖、乳糖、珍珠粉、胶原蛋白、胶原水解物、 透明质酸及其盐、蛋膜素、植物留醇、氯化溶菌酶、硫酸软骨素钠、蜂乳、蜂胶、蜂蜜、甘草酸、 甘草次酸、γ-亚麻酸、曲酸及其酯、赤霉酸、甘氨酸、L-天冬氨酸及其盐、L-胱氨酸及其盐、 DL-丙氨酸、L-丝氨酸、DL-丝氨酸、L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸、L赖氨酸盐酸盐、L苏氨酸、肌醇、麦 芽醇、泛酸盐、D-泛醇、视黄醇醋酸酯、尿囊素、吡哆醇盐酸盐、可的松、烟酰胺、维生素、雌激 素、苏木素、尿酸、乳清酸、芦荟苷、壬二酸、松香酸、松萝酸、昆布氨酸、胸腺素、茜草素、柠檬 烯、黄芩黄素、脱氧胆酸、愈疮木萸、橙皮素、鞣酸、二硫化硒、茶皂苷、柠檬酸三乙酯、丁基羟 基甲苯、植酸、聚氯化二甲基二烯丙基铵。
[0042] 作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，还可以包括:表面活 性剂、香精与香料、色素、防腐剂、抗氧剂、保湿剂、紫外线吸收剂、螯合剂、收敛剂、助渗剂 和pH值调节剂中的任意一种或几种组合。
[0043] 其中，所述表面活性剂可以是：1)阴离子表面活性剂，如：(：12-14脂肪醇硫酸铵、 C12-14脂肪醇聚氧乙烯醚羧酸盐、十二烷基硫酸二乙醇胺盐、(：12- 14脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸 铵、十二烷基硫酸三乙醇胺、醇醚邻苯二甲酸单酯钠盐、酰化肽、月桂酸单乙醇酰胺硫酸钠、 正辛醇聚氧丙烯醚琥珀酸单酯磺酸盐、十六醇琥珀酸单酯磺酸盐、磺基琥珀酸单酯二钠盐、 琥珀酸单十八酯二钠盐、醇醚磺基琥珀酸单酯二钠盐、脂肪醇聚氧乙烯醚(钠)磺基琥珀酸 单酯铵盐、油酰胺磺基琥珀酸单酯二钠盐、N-酰基谷氨酸钾盐、吡咯烷酮羧酸钠、聚丙烯酸 钠、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸单酯及其盐、脂肪醇聚氧乙烯醚磷酸 单酯乙醇胺盐、烷基酚聚氧乙烯醚磷酸单酯及其盐、壬基酚醚磷酸单酯乙醇胺盐、烷基磷酸 酯盐、邻苯二甲酸单月桂醇酯盐、十一碳烯酸锌、阴离子型氨基酸表面活性剂、N-C 12-18酰基 谷氨酸钠、N-月桂酰L-丙氨酸钠、N-硬脂酰基谷氨酸单钠盐、N-椰子酰基谷氨酸单钠盐、N-混合脂肪酰基谷氨酸单钠盐、长直链烷基芳醚磺酸钠 TH;2)非离子表面活性剂，如：油醇聚 氧乙烯醚(如乳化剂V0系列）、烷基酚聚氧乙烯醚(如乳化剂ΟΡΕ系列）、硬脂酸聚氧乙烯酯、 乙二醇单硬脂酸酯、二硬脂酸乙二醇酯、聚乙二醇单硬脂酸酯、聚乙二醇双硬脂酸酯、聚乙 二醇双月桂酸酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、蔗糖硬脂酸酯、聚氧乙烯甘油醚单硬 脂酸酯、Ν-月桂酰基谷氨酸双烷醇酯、苯甲酸脂肪醇酯、山梨醇单脂肪酸酯（司盘，Span，如 司盘-20、司盘60、司盘65、司盘-80、司盘-83、司盘-85)、聚氧乙稀醚山梨醇单脂肪酸酯（吐 温，Tween，如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80 )、二乙醇胺、三乙醇胺、脂肪酸 单乙醇酰胺(如椰子油酸单乙醇酰胺、月桂酸单乙醇酰胺、棕榈酸单乙醇酰胺）、椰子油酸二 乙醇酰胺、月桂酸二乙醇酰胺、甲基葡萄糖苷硬脂酸酯、聚氧乙烯甲基葡萄糖苷硬脂酸酯、 乙二醇葡萄糖苷硬脂酸酯、丙二醇基葡萄糖苷硬脂酸酯、C 8-16烷基葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷 硬脂酸酯、琥珀酸月桂醇醚单酯、月桂醇甘油酯聚氧乙烯醚、硬脂酸甘露醇酐酯、聚氧乙烯 貂油、貂油酸甲酯、貂油酸异丙酯;3)阳离子表面活性剂，如氯化C 12-18烷基三烷基铵(如氯化 十六烷基二甲基烷基铵、氯化十八烷基三甲基铵、氯化十六烷基三甲基铵）、氯化油酰胺丙 基二羟丙基二甲基铵、氯化二羟丙基二甲基十二烷基铵、氯化二甲基二烯丙基铵/丙烯酰胺 共聚物、氯化油酰胺丙基-2,3-二羟丙基二甲基铵、乙基硫酸油酰胺丙基二甲基乙基铵、氯 化双C 12-18基二甲基铵、聚季铵-11调理剂、M-505聚季铵-7调理剂、貂油酰胺丙基胺-壳聚 糖、貂油酰胺丙基胺-水解蛋白、阳离子蛋白肽、瓜尔胶-羟丙基三甲基氯化铵盐、聚纤维素 醚季铵盐、单油酸三乙醇胺酯、DNP系列;4)两性离子表面活性剂，如C 12-18烷基二羟乙基甜菜 喊、N_Ci2-i8烷基-N_(2_轻乙基)_N_(2_甲醜胺基乙基）钱乙酸盐、Ci2-i8烷氧基轻丙基甜菜 碱、氧化椰油酰胺基丙基胺、椰油羟乙基磺酸钠、氧化十八烷基二甲基胺、椰油酰二乙醇胺 氧化胺、N-烷基-β-氨基丙酰二乙醇胺、氧化月桂酰基丙胺、N-C 12-18酰基谷氨酸、羟乙基癸酸 咪唑啉甜菜碱、羟乙基肉豆蔻酸咪唑啉甜菜碱、羟乙基棕榈酸咪唑啉甜菜碱。
[0044]其中，所述香精与香料可以是选自：1)天然香料，如苦艾油、桉叶油、八角茴香油、 白柠檬油、白丁香浸膏、丁香油、白兰花油、白兰花浸膏、白兰叶油、柏木油、薄荷油、苍术硬 月旨、草木犀浸膏、橙叶油、丁香罗勒油、大花茉莉浸膏、冬青油、当归油、当归浸膏、地衣酸、地 檀香油、玳玳花油、玳玳叶油、风信子浸膏、楓香浸膏、芳樟油、黄樟油、甘松油、桂花浸膏、红 橘油、胡萝卜籽油、海狸香、黄葵油、黄兰油、藿香油、黄蒿油、九里香浸膏、金合欢浸膏、姜油、 橘子油、椒样薄荷油、菊花浸膏、枯茗油、龙涎香、留兰香油、灵猫香、腊梅油、铃兰浸膏、木香 根油、米兰花油、玫瑰香叶油、玫瑰油、茉莉浸膏、牡油、墨红浸膏、墨红油、梓檬桉叶油、梓 檬油、七里香浸膏、楠叶油、芹菜籽油、肉豆蔻油、肉桂油、山苍子油、水貂香膏酊、水仙浸膏、 松针油、树苔浸膏、素馨浸膏、麝香、麝鼠香膏、甜橙油、檀香油、晚香玉油、晚香玉浸膏、万寿 菊精油、小茴香油、血桧木油、香茅油、香叶油、康乃馨油、紫苏油、香紫苏油、香附油、香柠檬 薄荷油、岩兰草油、香薷油、香薷草浸膏、悬钩子蔷薇花油、悬钩子蔷薇花浸膏、薰衣草油、月 桂叶油、依兰依兰油、芫荽籽油、鱼香草油、岩蔷薇浸膏、岩桂油、柚皮油、鸢尾油、烟草花油、 香橼叶油、栀子花浸膏、紫穗槐油、紫罗兰叶浸膏、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创 木酚、天然香兰素、樟脑;2)合成香精，如柠檬烯、长叶烯、乙位石竹烯、异长叶烯、异长叶烯 酮、异长叶烷酮、溴代苏合香烯、二苯甲烷、二苯醚、间甲基二苯醚、丁香酚、异丁香酚、乙位 萘甲醚、乙位萘乙醚、对甲基茴香醚、异丁香酚苄醚、玫瑰醚、檀香醚、水仙醚(或茉莉醚）、降 龙涎香醚、甲基柏木醚、环氧柏木烷、埃林塔尔、埃林塔尔N、3-己烯醇、癸醇、月桂醇、苯甲 醇、苯乙醇、对甲氧基苄醇、肉桂醇、二甲基苄基甲醇、香叶醇、橙花醇、芳樟醇、玫瑰醇、松油 醇、香茅醇、消旋薄荷脑、薄荷脑、冰片、柏木醇、柏木烷酮、甲基柏木酮、3,4-二氧亚甲基苯 甲醇、α-甲基-3，4-二氢亚甲基苯丙醛、2-叔丁基-4-甲基环己醇、香紫苏醇、檀香醇、3-甲 基-5-(2'，2'，3'_三甲基环戊烯-Γ-基)戊-2-醇、苯甲醛、苯乙酮、苯乙酸、对甲基苯乙酮二 苯甲酮、月桂醛、肉桂醛、肉桂酸、戊基-β_苯基丙烯醛、苯基丙醛、铃兰醛、新铃兰醛、兔 耳草醛、3，4-二氧亚甲基苯甲醛、3，7-二甲基-6-辛烯醛、3，7-二甲基-7-羟基辛醛、柠檬醛、 乙位环高柠檬醛、艾薇醛、柑青醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、α-二氢突厥酮、β-突厥烯酮、紫 罗兰酮、6-甲基紫罗兰酮、橙花酮、香芹酮、胡椒基丙酮、覆盆子酮、药草酮、顺式茉莉酮、庚 醛乙二醇缩醛、苯乙醛二甲缩醛、辛醛二甲缩醛、α-戊基桂醛二甲缩醛、柠檬醛二甲缩醛、柠 檬醛二乙缩醛、茴香醛二甲缩醛、蘑菇醛、叶青素、风信子素、苹果酯、吉普缩酮、甲酸香叶 酯、甲酸香茅酯、阿弗曼酯、乙酸叶醇酯、乙酸苄酯、乙酸苯乙酯、乙酸肉桂酯、乙酸松油酯、 乙酸龙脑酯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸对叔丁基环己酯、乙酸邻叔丁基环己酯、乙酸香 根酯、乙酸琥珀酯、乙酸阿弗曼酯、乙酸十氢萘酯、乙酸柏木酯、丙酸香叶酯、乙酸三氯甲基 苯甲酯、丁酸苄酯、丁酸叶醇酯、丁酸香叶酯、2-甲基戊酸苯乙酯、异丁酸对甲酚酯、2-壬烯 酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸叶醇酯、苯甲酸苄酯、苯乙酸乙酯、苯乙酸对甲酚 酯、肉桂酸乙酯、水杨酸丁酯、水杨酸异丁酯、水杨酸异戊酯、水杨酸叶醇酯、水杨酸己酯、水 杨酸苄酯、水杨酸苯乙酯、水杨酸环己酯、茉莉素、茉莉酯、2-戊基环戊酮醋酸甲酯、橙花素、 γ -壬内酯、γ-十一内酯、香豆素、D引噪、3-甲基吲哚、3,7_二甲基-2,6_辛二烯腈、对甲氧基 苯甲腈、二甲苯麝香、酮麝香、2，6_二硝基-3-甲氧基-4-叔丁基甲苯、1，1_二甲基-4-乙酰 基-6-叔丁基茚满、六甲基三环异色满麝香、1，1，2,3,3,6_六甲基-5-乙酰基茚满、麝香-Τ、 麝香-Μ、麝香-L、麝香-F、ll-氧杂环十六内酯、吐纳麝香;3)香精，玫瑰香精、茉莉香精、檀香 香精、白兰香精。
[0045] 其中，所述色素可以是选自如下组分中的一种或几种:二氧化锆、醋酸铅、硝酸银、 叶绿素、叶绿素铜、亚铁氰化铁、鸟嘌呤、坚牢红、食品红I、还原红I、胭脂红、食用杨梅红、食 用樱桃红、食品红17、苋菜红、坚牢绿、食品黄3、食用柠檬黄、食用苏丹黄、食用靛蓝、食品蓝 2、焚光桃红、β_胡萝卜素、指甲花、栀子红色素、栀子绿色素、栀子蓝色素、栀子黄色素、钛云 母珠光颜料、氧化铁红、氧化铁黄、氧化铁黑、氧化铬绿、氧氯化铋、碱性桃红、银朱R、喹啉 黄、紫草宁、紫胶红色素、群青、酸性红87、酸性绿25、酸性荧光黄、酸性橙7、金光红53、立索 尔宝红ΒΚ、立索尔宝红2R、永固橙。
[0046] 其中，所述防腐剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：山梨酸及其盐、丙酸 盐、对羟基苯甲酸酯、苯甲醇、苯甲酸及其盐、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、卡松、咪唑烷基脲、脱氢醋酸及其盐、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 2,2_溴-2-硝基-1，3-丙二醇(布罗波尔）、异抗坏血酸及其盐、曲酸及其酯、壬二酸、松萝酸、 间苯二酚。
[0047] 其中，所述抗氧剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合：S0D、丁基羟基茴香 醚、没食子酸酯、抗坏血酸及其盐、异抗坏血酸及其盐、谷留醇、芦丁、生育酚。
[0048] 其中，所述保湿剂可以是选自如下组分中的一种或任意几种组合：1，2_丁二醇、山 梨醇、木糖醇、甘油、乳酸盐、聚乙二醇、DL-吡咯烷酮羧酸盐、D-葡萄糖、曲酸及其酯、尿酸、 乳清酸、果胶酸、昆布氨酸、胶原蛋白、海藻糖、12、羟基硬脂酸胆留醇酯。
[0049] 其中，所述紫外线吸收剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合:吡哆醇盐酸 盐、曲酸及其酯、芦丁、芦荟苷、咖啡氨酸、橙皮素、2-乙基己基水杨酸酯、2-乙基己基对二甲 基氨基苯酸酯、2-乙基己基对甲氧基肉桂酸酯、水杨酸苯酯、蓋基邻氨基苯甲酸酯、2-羟 基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸、2-羟基-4-辛氧基二苯甲酮。
[0050] 其中，所述螯合剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合:EDTA二钠盐、双吡啶 硫酮锌、硫代硫酸钠。
[0051] 其中，所述收敛剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合:苯酚对磺酸锌、羟基 氯化铝、硫酸铝、硫酸铝钾、硫酸锌、氯化铝、氯化锌、卡拉明。
[0052] 其中，所述助渗剂可以是选自如下组分中的一种或几种组合:二甲基亚砜、1-正十 二烷基氮杂环庚-2-酮、2-氨基乙醇。
[0053] 作为本发明的一个优选实施例，所述橄榄叶提取物作为添加剂分散于基质原料 中。
[0054] 其中，所述基质原料可以是油质原料、粉质原料、胶质原料、溶剂原料中的任意一 种或几种。
[0055] 所述油质原料可以是下述基质原料中的任意一种或几种组合:大豆油、橄榄油、 杏仁油、蓖麻油、花生油、棉籽油、茶籽油、霍霍巴油、鳄梨油、椰子油、棕榈油、可可脂、米糠 油、月见草油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、棕榈蜡、木蜡、水貂油、海龟油、蛇油、蛋黄油、牛脂、 马脂、猪脂、鹿脂、卵磷脂、羊毛脂、蜂蜡、鲸蜡、虫胶蜡、石蜡、凡士林、微晶蜡、地蜡、角鲨烷、 羊毛脂蜡、羊毛脂醇、羊毛脂醇酯化物、乙酰化羊毛脂、乙酰化羊毛脂醇、羊毛脂酸、羊毛脂 酸酯化物、聚氧乙烯羊毛脂、聚氧乙烯羊毛醇醚、聚氧丙烯羊毛醇醚、氢化羊毛脂、烷氧基化 氢化羊毛脂、硅油（如：二甲基硅油、八甲基硅油、甲基苯基聚硅氧烷）、聚硅氧烷-聚氧烷基 嵌段共聚物、甲基含氢硅油、Cn脂肪酸及其酯、Cn脂肪醇及其酯;其中，η彡10,并优选为10-24,更优选为 12-20,如 14、16、17、18。
[0056]所述Cn脂肪酸如：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、芥酸、癸酸。
[0057]所述Cn脂肪醇如：月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、异硬脂醇、油醇、椰油醇。
[0058]所述Cn脂肪酸酯、Cn脂肪醇酯如：肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、十四醇乳 酸酯、十六醇乳酸酯、棕榈酸异丙酯、棕榈树异辛酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸异辛酯、硬脂酸单 甘油脂、硬脂酸聚乙二醇酯、油酸癸酯、辛酸甘油酯、癸酸甘油酯、甘油三油酸酯。
[0059]所述粉质原料可以是下述基质原料中的任意一种或几种组合:云母、碳酸镁、钛白 粉、锌白粉、氢氧化钙、碳酸钙、高岭土、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、 氢氧化铝、焦磷酸钙、碳酸氢钙、膨润土。
[0060]其中，所述油脂原料可以是植物油质原料、动物油质原料、矿物油质原料、合成油 质原料、半合成油质原料中的任意一种或几种。如：淀粉、环糊精、黄原胶、角叉胶、瓜尔豆 胶、阿拉伯胶、黄芪胶、琼脂、虫胶、海藻酸钠、明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素 钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚纤维素醚季铵盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯 酸钠、聚氧乙烯、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物、卡波树脂、硅酸铝镁、&2-15醇苯甲酸 酯。
[0061] 所述溶剂原料可以是下述基质原料中的任意一种或几种组合:水、乙醇、丙醇、异 丙醇、异丁醇、乙二醇、1，2_丙二醇、环己烷、二氯二氟甲烷、四氟二氯乙烷、乙二醇单乙醚、 二甘醇单乙醚、丙酮、甲基异丁基甲酮、醋酸乙酯、醋酸丁酯、乙酸戊酯、邻苯二甲酸二丁酯。
[0062] 本发明提供的橄榄叶提取物具有较强的抗衰老作用，这是因为其能够大幅提高 人体真皮层中胶原蛋白的含量，而使人体皮肤保持弹性，从根本上抑制皱纹的出现。此外， 本发明提供的橄榄叶提取物还能够明显抑制自由基(DPPH)的生成，可作为制品或添加剂应 用于食品、药品、护肤品和/或化妆品中，发挥抗氧化抗衰老的双重效果。
【附图说明】
[0063] 图1为自然状态下橄榄叶提取物对I型胶原蛋白分泌的影响；
[0064] 图2为过氧化氢对细胞存活率的影响；
[0065] 图3为橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；
[0066] 图4为橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1含量的影响；
[0067]图5为橄榄叶提取物对DPPH清除率的影响；
[0068] 图6为橄榄叶提取物对透明质酸含量的影响。
【具体实施方式】
[0069] 橄榄叶提取物的制备方法
[0070] 实施例1-4
[0071] 将新采摘的橄榄叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对橄榄叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的橄榄叶，得到含水量在5%以下的干 橄榄叶，并将制备的干橄榄叶粉碎，备用。
[0072] 取粉碎后的干橄榄叶10kg，并向其中加入一定体积倍量的50%甲醇水溶液为溶 媒，65°C、1.0IMPa提取3次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合 提取液在5kPa、微沸条件下旋转蒸发0.5h，去除其中的甲醇，得到浓缩液。
[0073]使用1M的盐酸调节浓缩液至pH值=4,将浓缩液使用玻璃色谱柱层析提纯，然后用 体积比为甲醇：乙醇:水= 2:5:3的混合溶液作为洗脱液洗脱，洗脱液的流速为3BV/h，洗脱 温度为25°C。将洗脱后得到的洗脱液在60°C加热，进一步浓缩制倍橄榄叶提取物，该提取物 为溶液。
[0074]将该橄榄叶提取物加入10倍体积水稀释，使用高效液相色谱，C18色谱柱，在35°C、 282nm波长下检测，以乙腈:水= 22:78作为流动相，分析可知，各物质的含量如下：
[0075]表1、橄榄叶在不同溶媒比下的提取结果
[0076]
[0077] 由表1可知，在橄榄叶粉末与甲醇水溶液比例从lg: (5_20)mL过程中，随着甲醇水 溶液量的增加，羟基酪醇和总多酚的含量均逐渐增加，甲醇水溶液增至15mL/g橄榄叶粉末 时，羟基酪醇和总多酚的含量增加缓慢。
[0078] 实施例5-13
[0079]将新采摘的橄榄叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对橄榄叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的橄榄叶，得到含水量在5%以下的干 橄榄叶，并将制备的干橄榄叶粉碎，备用。
[0080]取粉碎后的干橄榄叶10kg，向其中加入10倍体积倍量的溶媒，110°C、1.5MPa下提 取3次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在5kPa、微沸 条件下旋转蒸发〇. 5h，得到浓缩液。
[0081 ] 使用0.8M的硫酸调节浓缩液pH值=3，将浓缩液使用D-101大孔吸附树脂在40 °C吸 附2h，吸附饱和，然后采用不同浓度乙醇梯度洗脱，洗脱液的流速为2BV/h，洗脱温度为35 °C。将洗脱后得到的洗脱液在5kPa、20°C-30°C微沸状态下浓缩去除其中的乙醇，制备橄榄 叶提取物，该橄榄叶提取物的性状为溶液。
[0082]将该橄榄叶提取物加入10倍体积水稀释，使用高效液相色谱，C18色谱柱，在35°C、 282nm波长下检测，以乙腈:水= 22:78作为流动相，分析可知，各物质的含量如下：
[0083] 表2、橄榄叶在不同种类、不同浓度溶媒下提取结果
[0084]
[0085]
[0086] 由表2可知，去离子水比甲醇水溶液和乙醇水溶液更利于提取羟基酪醇及其他多 酚类物质。
[0087] 实施例 14-18
[0088]将新采摘的橄榄叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对橄榄叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的橄榄叶，得到含水量在5%以下的干 橄榄叶，并将制备的干橄榄叶粉碎，备用。
[0089]取粉碎后的干橄榄叶10kg，向其中加入10体积倍量的去离子水为溶媒，65°C、不同 压力下提取3次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液在 5kPa、微沸条件下旋转蒸发0.5h，去除其中的甲醇，得到浓缩液。
[0090] 使用0.8M的硫酸调节浓缩液pH值=3，将浓缩液使用玻璃色谱柱层析提纯，然后用 体积比为甲醇：乙醇:水=1:3:6的混合溶液作为洗脱液多次洗脱，洗脱液的流速为2BV/h， 洗脱温度为35°C。将洗脱后得到的洗脱液加热，进一步浓缩制备浸膏，采用辐射法对制备的 浸膏灭菌30min，灭菌的浸膏经喷雾干燥，制备得到橄榄叶提取物，该橄榄叶提取物的Sal值 为5X 10-6。
[0091] 其中，喷雾干燥的条件为：高压栗在lOOMPa压力下将灭菌的浓缩液经雾化器形成 100μπι的颗粒，雾化后的小颗粒在80°C热空气条件下干燥20s。
[0092] 将该橄榄叶提取物加入10倍体积水稀释，使用高效液相色谱，C18色谱柱，在35 °C、282nm波长下检测，以乙腈:水= 22:78作为流动相，分析可知，各物质的含量如下：
[0093]表3、橄榄叶在不同压力下提取结果
[0094]
[0095] 由表3可知，压力偏离大气压越多，得到的橄榄叶提取物中总多酚和羟基酪醇的含 量相对更高。
[0096] 实施例 19-23
[0097]将新采摘的橄榄叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对橄榄叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的橄榄叶，得到含水量在5%以下的干 橄榄叶，并将制备的干橄榄叶粉碎，备用。
[0098]取粉碎后的干橄榄叶10kg，向其中加入10体积倍量的去离子水为溶媒，65 °C、 0.2MPa下提取3次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液 在5kPa、微沸条件下旋转蒸发0.5h，得到浓缩液。
[0099] 使用0.8M的硫酸调节浓缩液pH值=3，将浓缩液使用D-101型大孔吸附树脂吸附 2h，吸附温度为40°C，然后使用不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，乙醇水溶液的流速为2BV/ h，洗脱温度为35°C。将洗脱后得到的洗脱液在10kPa、20°C下旋转蒸发lh，以除去其中的乙 醇。进一步浓缩制备浸膏，采用钴60-γ射线，控制浸膏的吸收剂量为10-30kGy福射灭菌lh， 灭菌的浸膏经喷雾干燥，制备得到橄榄叶提取物，该橄榄叶提取物的Sal值为5X 10-6。
[0100]其中，喷雾干燥的条件为：高压栗在120MPa压力下将灭菌的浓缩液经雾化器形成 300μπι的颗粒，雾化后的小颗粒在80°C热空气条件下干燥20s。
[0101] 将该橄榄叶提取物加入10倍体积水稀释，使用高效液相色谱，C18色谱柱，在35 °C、282nm波长下检测，以乙腈:水= 22:78作为流动相，分析可知，各物质的含量如下：
[0102] 表4、橄榄叶提取物在不同洗脱液下的浓度
[0103]
[0104] 表4中所述"洗脱液经浓缩后二次洗脱"是指浓缩液经过不同浓度的乙醇及其水溶 液洗脱后，取得到的洗脱液，二次浓缩去除其中的乙醇，将经过二次浓缩的溶液在相同的纯 化条件下纯化。
[0105]由表4可知，经低浓度的乙醇水溶液洗脱，得到的橄榄叶提取物中总多酚和羟基酪 醇的含量相对更高。
[0106] 实施例24-28
[0107] 将新采摘的橄榄叶，清水清洗2次，清洗时向清水中注入浓度为lOOppm的二氧化 氯，对橄榄叶清洗、杀菌，并使用65°C热风干燥清洗过的橄榄叶，得到含水量在5%以下的干 橄榄叶，并将制备的干橄榄叶粉碎，备用。
[0108] 取粉碎后的干橄榄叶10kg，向其中加入10体积倍量的去离子水为溶媒，1.8MPa、不 同温度下提取2次，每次2h，提取结束后，混合每次的提取液，得到混合提取液，混合提取液 在5kPa、微沸条件下旋转蒸发0.5h，得到浓缩液。
[0109] 使用0.8M的硫酸调节浓缩液pH值=3,将浓缩液使用D-101型大孔吸附树脂吸附 2h，吸附温度为40°C，然后使用不同浓度的乙醇水溶液洗脱，乙醇水溶液的流速为2BV/h，洗 脱温度为35°C。将洗脱后得到的洗脱液在10kPa、20°C下旋转蒸发lh，以除去其中的乙醇。进 一步浓缩制备浸膏，采用钴60-γ射线，控制浸膏的吸收剂量为10-30kGy辐射灭菌lh，灭菌 的浸膏经喷雾干燥，制备得到橄榄叶提取物，该橄榄叶提取物的Sal值为5X 10-6。
[0110] 其中，喷雾干燥的条件为：高压栗在120MPa压力下将灭菌的浓缩液经雾化器形成 300μπι的颗粒，雾化后的小颗粒在80°C热空气条件下干燥20s。
[0111] 将该橄榄叶提取物加入10倍体积水稀释，使用高效液相色谱，C18色谱柱，在35°C、 282nm波长下检测，以乙腈:水= 22:78作为流动相，分析可知，各物质的含量如下：
[0112] 表5、橄榄叶提取物在不同温度下的提取结果
[0113]
[0114] 由表5可知，反应温度越高，得到的橄榄叶提取物中羟基酪醇和总多酚的含量越 尚。
[0115]综合考虑温度和压力对提取物的影响，选择在较高的压力和较高的温度下提取橄 榄叶。
[0116] 对比实施例
[0117] 取10kg含水量在4%以下的干橄榄叶除杂后，去离子水清洗2次，使用65°C热风干 燥，然后粉碎，并用10倍体积的稀盐酸水溶液浸提2h，稀氢氧化钠水溶液中和多余的盐酸， 离心过滤，滤液经旋蒸脱水后经过AB-8大孔吸附树脂吸附纯化，吸附的温度为35°C，吸附 2h。然后使用无水乙醇以3BV/h的流速洗脱。经纯化的滤液在5kPa、20 °C下旋蒸，除去其中的 乙醇，剩余提取液经真空干燥得到含15%羟基酪醇的橄榄叶提取物。其中，真空干燥过程 中，先将剩余提取液在_l〇°C预冻4h，冻结成固态，然后于-10°C、20Pa条件下干燥至恒重，得 到含总多酚35%、羟基酪醇15%的橄榄叶提取物。
[0118] 橄榄叶提取物对人HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0119] 材料与试剂
[0120] MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）； 人真皮成纤维细胞（HDF) I型胶原蛋白 96孔细胞培养板 细胞培养箱 离心机 酶标仪：
[0121] 吸光度测量仪 超声波细胞粉碎机 BCA蛋白检测试剂盒 加热锅 细胞培养液 DMSO
[0122] 测试步骤
[0123] 取对数生长期的浓度为105个/mL的人HDF细胞或Hacat细胞，将细胞接种于96孔板 中，每孔细胞液lOOyL。
[0124] 将96孔板置于37°C的细胞培养箱中贴壁培养6h。
[0125] 将终浓度为lmg/mL、0 . lmg/mL和0.01mg/mL的本发明提供的橄榄叶提取物加入到 96孔板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37°C、包含5%C02的细胞培养箱中孵育 48h；
[0126] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的细胞培养箱中黑 暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波 长，检测吸光光度值；
[0127] 计算细胞存活率，结果如表6所示：
[0128] 表6，橄榄叶提取物对人HDF细胞和HaCat细胞存活率的影响
[0129]
LU1W」 以细腿仔沽卒咼t80%为对人HUK细腿尤苺的称准，佛足橄榄叶提取物对HUK细 胞无毒的最高浓度〇. 01mg/mL，以细胞存活率高于80 %为对人HaCat细胞无毒的标准，确定 橄榄叶提取物对HaCat细胞无毒的最高浓度为0.1mg/mL，两者选取浓度较低的一个，即选取 橄榄叶提取物浓度〇. 01mg/mL为后续的试验浓度。
[0131]橄榄叶提取物的抗衰老性能
[0132] 自然状态下橄榄叶提取物对HDF细胞胶原蛋白分泌的影响
[0133] 本测试分为实验组、对照实验组、空白组和标准组。
[0134] 取对数生长期浓度为105个/mL细胞，每孔100yL，于37°C、含有⑶2的细胞培养箱中 培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。
[0135] 向实验组中加入10yL上清液和40yL本发明提供的橄榄叶提取物的稀释液，向对照 实验组中加入l〇yL上清液和40yL采用对比实施例所述方法制备的橄榄叶提取物的稀释液， 空白组中不加样品，向标准组中加入50yL标准液，分别于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0136] 向四组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50yL，于37°C温育30min，洗涤5 次。
[0137] 向四组样品中分别加入50yL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于37 °C温育 30min，洗涤5次。
[0138] 向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，轻轻震荡混匀，于37°C避光孵 育30min，向四组样品中加入终止液50yL。
[0139] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度。并根据标 准品对应的I型胶原蛋白的含量，计算出橄榄叶提取物中的胶原蛋白-I的含量，结果如表7 和图1所示。
[0140]表7、橄榄叶提取物对HDF细胞胶原蛋白分泌的影响
[0141]
[0142] 胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提 高是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了 I型胶原蛋白的表达及I型胶 原蛋白被基质金属蛋白酶MMP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含 量减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。
[0143 ]由表7和图1可知，向人HDF细胞中添加本发明提供的橄榄叶提取物后，皮肤中的I 型胶原蛋白含量比未添加橄榄叶提取物时提高了 21%，采用现有技术制备的橄榄叶提取物 在促进I型胶原蛋白分泌方面比未添加橄榄叶提取物时提高了6.58%，说明采用本发明提 供的制备方法得到的橄榄叶提取物对I型胶原蛋白的分泌具有更显著的促进作用，能够显 著促进I型胶原蛋白的表达，是潜在的抗老化添加剂。
[0144] 过氧化氢对HDF细胞存活率的影响
[0145] 选取不同浓度的过氧化氢，如 50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法检测不同浓度的过氧化氢对HDF 细胞存活率的影响。
[0146] 材料与试剂
[0147] 96孔细胞培养板 MTT
[0148] 细胞培养液 细胞培养箱
[0149] DMS0 吸光度测量仪
[0150] 测试步骤
[0151] 取培养至浓度为105个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL。于37 °C、含有C02的培养箱中贴壁培养6h。
[0152]使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h;向每个样品孔中加入浓度为 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。
[0153] 去除上清液，向样品中加入150yL DMS0,震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照 波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。
[0154] 细胞存活率晒 则R午备铤啜光度均逋 ^
[0155] 测试结果如图2所示，人HDF细胞于浓度为50-800μΜ的过氧化氢共孵育3-9h后，人 HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μΜ时，细胞存活率低于50% dOOyM过氧化 氢作用6h后，细胞存活率降到70 %。
[0156] 橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0157] 本试验分为空白组、实验组、阳性对照组和对照试验组。
[0158] 取培养至密度为105个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100yL，每孔设3个复孔。 于37°C，含有C0 2的培养箱中贴壁培养6h。
[0159] 空白组中不加入样品，实验组中加入本发明提供的橄榄叶提取物，对照实验组加 入对比实施例制备的橄榄叶提取物，阳性对照组中加入维甲酸。
[0160] 实验组、阳性对照组和对照实验组利用过氧化氢损伤建模。
[0161] 向四组试验中的每孔加入0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、5%C02的黑暗条件下孵 育4h。去除上清液，加入DMS0 150yL，震荡检测吸光度，计算细胞存活率，细胞存活率采用如 下计算公式：
[0162]
[0163] 其中，空白组既未加入过氧化氢，也未加入橄榄叶提取物。
[0164] 表8,橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响
[0165]
[0166] 由表8阴性对照组数据可知，经过过氧化氢损伤后，HDF细胞的存活率降低至70% 以下，而向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入维甲酸后，HDF细胞的存活率提高至89%，如 表8中阳性对照组所述。向经过过氧化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的橄榄叶提取物 后，人HDF细胞的存活率达到85.75%，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备 的橄榄叶提取物后，人HDF细胞的存活率为76%，即本发明提供的橄榄叶提取物相对于现有 技术制备的橄榄叶提取物，其修复受损肌肤的能力与维甲酸接近，能够显著修复过氧化氢 对HDF细胞造成的损伤。
[0167] 橄榄叶提取物对过氧化氢损伤HDF细胞MMP-1分泌量的影响
[0168] 材料与试剂
[0169] 细胞培养液 24孔细胞培养板
[0170] 细胞培养箱 过氧化氢
[0171] 离心机 ELISA试剂盒
[0172] 测试步骤
[0173 ] 本测试分为实验组、对照实验组、阴性对照组、阳性对照组、空白组和标准组。
[0174] 取对数生长期的浓度为105个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔lmL，于37 °C，含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0175] 向实验组加入本发明提供的橄榄叶提取物，向对照实验组中加入采用对比实施例 所述方法制备的橄榄叶提取物，向标准组加入50yL标准液，阳性对照组加入维甲酸，阴性对 照组中不加样品，诱导建立过氧化氢损伤模型。
[0176] 空白组不加样品，不建立过氧化氢损伤模型。
[0177] 小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书，取10此细胞悬液进行实验。以 空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光度。根据标准品对应的 MMP-1的浓度及对应的吸光度值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的吸光度 值，在回归方程上计算出实验组中MMP-1的浓度，结果如表9和图4所示。
[0178] 表9,橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1表达的影响
[0179]
[0180] 经过过氧化氢刺激后，HDF细胞中的MMP-1水平显著上升至空白组的1.67倍，见表9 和图4中的阴性对照组;加入维甲酸后，MMP-1的值降低至空白组的1.25倍，见表9中阳性对 照组；向HDF细胞中加入本发明提供的橄榄叶提取物后，MMP-1的含量降低至空白组的1.27 倍，与阳性对照组接近，而加入采用现有技术制备的橄榄叶提取物后，MMP-1的含量为空白 组的1.46倍，明显高于实验组中的MMP-1的浓度。这说明，在氧化应激条件下，本发明提供的 橄榄叶提取物与现有技术制备的橄榄叶提取物相比，具有更优异的抑制匪P-1表达的性 能，能够更有效的修复受损皮肤。
[0181] 橄榄叶提取物对过氧化氢损伤HDF细胞内MDA含量的影响
[0182] MDA在酸性条件下加热时，可与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物3，5，5-三 甲基恶唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸(TBA)，故称此法为 TBA 法。
[0183 ] 本测试分为实验组、对照实验组、阳性对照组、阴性对照组和空白组。
[0184] 取对数生长期、浓度为105个/mL的HDF细胞，接种于6孔细胞培养板，每孔2mL，培养 6h〇
[0185] 向实验组加入经新鲜培养基稀释的本发明制备的橄榄叶提取物，向对照实验组加 入采用对比实施例所述方法制备的橄榄叶提取物，阳性对照组加入维甲酸，阴性对照组不 加样品，诱导建立过氧化氢损伤模型。
[0186] 空白组不加样品，不建立过氧化氢损伤模型。
[0187] 以lOOOrpm离心10min，收集培养基上清液中的细胞及贴壁细胞，在细胞沉淀中加 入500yL PBS，轻轻颠倒混匀，于4°C下，以2000rpm离心10min，弃除上清液留存底部沉淀。向 沉淀中加入500yL PBS，超声破碎细胞(400A，5s/次，间隙10s反复3~5次），制备细胞匀浆；
[0188] 按照试剂盒说明书进行实验。将试剂混匀，用保鲜膜将试管口扎紧，用针头刺孔透 气，用锅开盖煮沸40min，取出后流水冷却，以4000rpm离心10min，使沉淀完全。取上清液，采 用分光光度法测定532nm波长处的吸光度;利用BCA蛋白检测试剂盒，按照说明书方法将本 发明提供的橄榄叶提取物稀释适当倍数，测定细胞中的蛋白质含量；
[0189] 表10,橄榄叶提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MDA含量的影响
[0190]
[0191] 由表10和图5可知，将正常HDF细胞的MDA含量记为100,过氧化氢损伤后，MDA浓度 快速上升，6h时MDA含量增加至正常状态的326%，如表10中阴性对照组所示;而加入维甲酸 后MDA含量的增加得到抑制，MDA浓度降低至262%，如表10中阳性对照组所示；向经过过氧 化氢损伤的HDF细胞中加入本发明提供的橄榄叶提取物后，MDA含量明显降低至224%，明 显低于阳性对照组中MDA的含量;而加入采用现有技术制备的橄榄叶提取物后，经过氧化氢 损伤的HDF细胞中MDA的含量为257%，这说明本发明提供的橄榄叶提取物对人HDF细胞损伤 具有显著的修复作用，且对HDF细胞的修复作用明显优于现有技术制备的橄榄叶提取物。
[0192] 橄榄叶提取物去除自由基的性能
[0193] 1，1_二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性 主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能 发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，其可以清除其他的自由基。目前广泛 用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处 有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使 其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行 快速的定量分析。
[0194] 材料与试剂
[0195] DPPH 无水乙醇
[0196] dd 水 200yL 吸头
[0197] 96孔板 8通道加样枪
[0198] 酶标仪
[0199] 测试步骤
[0200]用无水乙醇配置0.2mmol/L的DPPH溶液，避光保存，配置0.01mg/mL的表没食子儿 茶素没食子酸酯(EGCG)溶液，。
[0201]向实验组添加20uL浓度为0 .Olmg/mL本发明提供的橄榄叶提取物溶液和0.2mmol/ L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组1中添加180uL无水乙醇与20uL本发明提供的 橄榄叶提取物溶液，向标准组中添加180uL DPPH溶液与20uL蒸馏水，每孔设置至少3个复 孔，分别摇匀，室温下暗处静置30min，测定各组的吸光度。
[0202]向对照试验组添加20uL浓度为0.0 lmg/mL采用现有技术制备的橄榄叶提取物溶液 和0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液180uL至96孔板中，向空白组2中添加180uL无水乙醇与20uL 采用现有技术制备的橄榄叶提取物溶液，每孔设置至少3个复孔，分别摇匀，室温下暗处静 置30min，测定各组的吸光度。
[0203] DPPH白由甚的谙除能力桉T忒丟元.
[0204]
[0205]其中，计算实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为实验组的吸光度，空白组吸光 度分别为空白组1的吸光度；
[0206]计算对照实验组的DPPH清除率时，测试样吸光度为对照实验组的吸光度，空白组 吸光度为空白组2的吸光度；
[0207]清除率越大表明抗氧化能力越强，结果如图6所示，当溶液中不存在DPPH自由基 时，空白组的DPPH清除率为0，EGCG对DPPH自由基的去除率为47.23%，本发明提供的橄榄叶 提取物对DPPH自由基的去除率为76.15%，采用现有技术制备的橄榄叶提取物对DPPH自由 基的去除率不足60%，说明橄榄叶提取物具有非常强的去除DPPH自由基的能力，且相对于 现有技术，本发明制备的橄榄叶提取物具有更优异的DPPH清除率。
[0208] 橄榄叶提取物对HDF细胞保湿能力的影响
[0209] 橄榄叶提取物对HDF细胞透明质酸(HA)分泌的影响
[0210] 皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮 下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤 对水的维持作用：
[0211] 1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；
[0212] 皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重 要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的 细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚 韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。
[0213] 2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。
[0214]在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比 例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它 对皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。
[0215] 材料与试剂
[0216]细胞培养液 24孔细胞培养板
[0217] 细胞培养箱 离心机
[0218] ELISA试剂盒 吸光度测量仪
[0219] 测试步骤
[0220] 本测试分为实验组、对照实验组、空白组和标准组。
[0221]取对数生长期的浓度为105个/mL的人HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液lmL，于37°C、含有C02的细胞培养箱中培养6h。
[0222] 向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的橄榄叶提取物，置于37°C、含有5% C02及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h;
[0223] 小心收集上清培养基，离心后得到上清液，备用。
[0224] 向标准组中加入50yL标准液，向实验组中加入10yL上清液和40yL本发明提供的橄 榄叶提取物的稀释液，向对照实验组中加入l〇yL上清液和40yL采用对比实施例所述方法制 备的橄榄叶提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0225] 向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，于37°C避光孵育30min，向四组 样品中加入终止液50yL。
[0226] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光光度值。
[0227] 根据标准组的HA的含量与对应的吸光光度值，计算标准曲线的线性回归方程，再 根据样本的吸光光度值，在回归方程上计算出实验组中HA的含量，结果如表11和图6所示。
[0228] 表11，橄榄叶提取物对HA分泌的影响
[0229]
[0230]由表11可知，添加本发明提供的橄榄叶提取物后，人HDF细胞的HA分泌量比未加入 橄榄叶提取物时提高了 8.5%，比采用现有技术制备的橄榄叶提取物也更利于HA的分泌，说 明本发明提供的橄榄叶提取物能够促进HDF细胞分泌HA，可以向化妆品中加入本发明提供 的橄榄叶提取物，以起到更强的保湿能力。
[0231]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述化妆品和/或护肤品中包含橄榄叶提取 物，所述橄榄叶提取物的含量为0.001 % -50 %。2. 根据权利要求1所述的化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述橄榄叶提取物中包括 羟基酪醇，橄榄叶提取物中所述羟基酪醇的质量分数为5 % -50 %。3. -种橄榄叶提取物，其特征在于，所述橄榄叶提取物中包括羟基酪醇，所述羟基酪醇 的质量分数为5 %-50 %。4. 根据权利要求3所述的橄榄叶提取物，其特征在于，所述橄榄叶提取物还包括橄榄苦 甙和毛蕊花糖苷中的任意一种或两种组合。5. 根据权利要求3所述的橄榄叶提取物，其特征在于，所述橄榄叶提取物为水提物、醇 提物、油提物、超临界C02提取物中的任意一种或几种的组合。6. -种如权利要求3-5任一项所述的橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，所述方法 包括如下步骤： 步骤1、提供原料清洁的橄榄叶粉末，以溶媒:原料= 5-20:1的体积比，在一定温度下提 取，经过滤得到提取液； 步骤2、将步骤1中过滤后的提取液浓缩、层析，得到层析液，将层析液进一步浓缩后制 备成浸膏，即得到所述橄榄叶提取物。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，将层析液制备成浸膏后，还 包括灭菌步骤，所述灭菌步骤采用热空气灭菌、水蒸气灭菌、辐射灭菌、5%石炭酸、70%乙 醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一种或几种组合。8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中还包括将制备得到的浸膏进 一步干燥，得到所述橄榄叶提取物，所述干燥的方法为电加热干燥、喷雾干燥、热空气干燥 中的任意一种或几种组合，优选为喷雾干燥。9. 一种如权利要求3-5任一项所述的橄榄叶提取物的应用，其特征在于，所述橄榄叶提 取物应用于制备涂覆于皮肤外表面的制品。10. 根据权利要求9所述的橄榄叶提取物的应用，其特征在于，所述制品中橄榄叶提取 物的含量为0.001 %-50 %。
【文档编号】A61K8/97GK105997703SQ201610520560
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】洪民华, 刘丹, 赵兆, 洪奇, 吕智, 卢艳花, 何浩
【申请人】上海相宜本草化妆品股份有限公司, 华东理工大学