专利名称：一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法
技术领域：
本发明涉及异种器官移植领域中一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法。
背景技术：
异种器官移植已成为解决供体器官不足的重要途径。进行异种器官移植，必须解决异种间的免疫排斥反应。异种器官移植将引发三种类型的排斥反应，即超急性排斥反应(Hyperacute Rejection，HAR)、延缓性排斥反应(Delayed XenograftRejection，DXR)和T-细胞介导的排斥反应(T-cell Mediated Rejection，TMR)。
HAR可在移植后几分钟到几小时之内发生。其原因是在供体猪器官的血管内皮细胞表面存在着αGal异种抗原(Gal-α1，3-Gal)，它能被人体内的天然抗体识别，抗体特异性与移植物内皮细胞抗原结合，通过补体经典途径，激活补体系统，从而启动破坏异种移植物的系列反应。表现为移植物间质出血、水肿并形成血栓，导致异种移植物坏死。因此克服HAR的关键是降低或清除供体器官上的Gal-α1，3-Gal抗原。
延缓性排斥反应(DXR)一般发生在移植后的几天。病理学上表现为移植物血管内皮细胞肿胀、组织缺血和血栓的形成。越来越多的证据表明在DXR过程中，核心事件是移植物血管内皮细胞的激活。NF-κB转录因子是细胞激活后一系列后续反应中的重要分子。在细胞静息状态下，NF-κB转录因子与其抑制因子IκB结合在一起以异二聚体的形式存在于细胞质中。在细胞激活过程中，IκB被磷酸化，进而降解，NF-κB转录因子就会游离出来，在入核序列(LNS)的引导下进入核中，激活粘附分子(E-selectin、VCAM、ICAM-1等)和细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等)基因的表达，同时细胞产生促凝血因子，打破血栓调节素的平衡，引起炎症和凝血。研究表明，向细胞导入NF-κB的天然抑制因子IκB和p65RHD可以抑制内皮细胞的活化。还有资料表明人腺病毒E1A基因可以抑制NF-κB的激活，而NF-κB的下游分子E-选择素水平下降程度是衡量克服DXR好坏的一个标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法。
本发明所提供的抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法，是将人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因导入猪体细胞，得到Gal-α1，3-Gal抗原和E-选择素表达量降低的猪体细胞，将该猪体细胞用于人异种器官移植。
所述人α1，3-半乳糖苷酶基因具有序列表中序列1的DNA序列。
所述人α1，2岩藻糖转移酶基因GenBank号为NM_000169。
所述人A20基因的GenBank号为NM_006290。
所述导入猪体细胞的三种基因中人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因的摩尔比为1∶1∶0.5-1.5，优选为1∶1∶1。
可利用任一种可以引导外源基因在动物中表达的载体，如质粒表达载体pIRESneo、pcDNA3，将所述人α1，3-半乳糖苷酶基因、人α1，2岩藻糖转移酶基因或人A20基因导入猪体细胞。
携带有人α1，3-半乳糖苷酶基因、人α1，2岩藻糖转移酶基因或人A20基因的表达载体可通过现有的将重组DNA分子导入哺乳动物细胞的方法导入猪体细胞，如脂质体介导法、电穿孔DNA转移法、显微注射法、磷酸钙转染法或DEAE-葡聚糖转染法等。
携带有所述人α1，3-半乳糖苷酶基因的表达载体可为pIRES-AGA；携带有所述人α1，2岩藻糖转移酶基因的表达载体可为pIRES-HT；携带有所述人A20基因的表达载体可为pcDNA3-A20。
所述猪体细胞可为成纤维细胞或动脉血管内皮细胞。
所述成纤维细胞可为胚胎成纤维细胞。
本发明的方法通过向猪体细胞联合转入3个人源性基因，可使猪体细胞表面的末端α-半乳糖基团(Gal-α1，3-Gal抗原)减少90％，NF-κB下游分子E-选择素的表达量降低50％，且细胞染色体数量、形态未受影响，可显著抑制人异种器官移植中免疫排斥反应，特别是超急性排斥反应和延缓性排斥反应。本发明的方法将在抑制人异种器官移植中的免疫排斥反应中发挥重要作用。
图1a为转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞表面异种抗原αGal的表达情况中的不加IB4的荧光本底图1b为未转基因的猪胚胎成纤维细胞表面异种抗原αGal的表达情况图1c为转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的两个不同克隆的表面异种抗原αGal的表达情况图2a为检测未转基因的猪胚胎成纤维细胞受TNF刺激后A20下游分子E-selectin的表达情况图2b为检测转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20猪胚胎成纤维细胞受TNF刺激后A20下游分子E-selectin的表达情况图3a为未转基因的猪胚胎成纤维细胞的RT-PCR检测电泳图谱图3b为αGal抗原清除率＞90％且E-选择素表达量降低50％以上的转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的RT-PCR检测电泳图谱图4a为未转基因的猪胚胎成纤维细胞的染色体数量及形态照片图4b为αGal抗原清除率＞90％且E-选择素表达量降低50％以上的转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的染色体数量及形态照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法1、用于转基因的人源基因表达质粒构建1)人α1，3-半乳糖苷酶基因的克隆和表达质粒的构建取人胎肝组织提取总RNA；以Oligo dT为引物反转录合成cDNA第一链；以反转录产物为模板、用人α1，3-半乳糖苷酶基因特异性全长引物PCR扩增其全长cDNA；其中，人α1，3-半乳糖苷酶基因特异性全长引物为上游引物5’-CGGAATTCGTGACAATGCAGC-3’(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)，下游引物5’-CGGGATCCATTAAAGTAAGTCTT-3’(带下划线的碱基为BamHI识别位点)。将目的片段克隆到pGEMT载体，在PCR及酶切鉴定基础上进行序列测定，将序列正确的克隆命名为pGEMT-AGA。
质粒pGEMT-AGA、pIRESneo(Clontech)分别用EcoRI和BamHI酶切，回收人α1，3-半乳糖苷酶基因(1.3kb)片段和pIRESneo酶切产物中5.3kb片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，转化大肠杆菌感受态DH5α。挑取抗性克隆，用EcoRI和BamHI酶切鉴定，鉴定正确的克隆(含有人α1，3-半乳糖苷酶基因)命名为pIRES-AGA。
2)人α1，2岩藻糖转移酶基因表达载体的构建以人胎肝组织cDNA为模板、用人α1，2岩藻糖转移酶基因特异性全长引物PCR扩增其全长cDNA；其中，人α1，2岩藻糖转移酶基因特异性全长引物为上游引物5’-CGCTCGAGGCCATGGGCTC-3’(带下划线的碱基为XhoI识别位点)，下游引物5’-CGGGATCCATTTACAAGGCTTAG-3’(带下划线的碱基为BamHI识别位点)。将目的片段克隆到pGEMT载体中，在PCR及XhoI和BamHI酶切鉴定基础上进行序列测定，将序列正确的克隆命名为pGEMT-HT。
提取质粒pGEMT-HT，XhoI酶切后用T4DNA聚合酶补平3’凹陷；之后用BamHI酶切，纯化回收酶切产物中α1，2岩藻糖转移酶基因(1.1kb)片段。pIRESneo用EcoR I酶切后，用T4DNA聚合酶补平3’凹陷后用BamHI酶切，回收酶切产物中5.3kb片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，转化大肠杆菌感受态DH5α。挑取抗性克隆，扩增后提取质粒，进行BamHI和EcoRV酶切鉴定，鉴定正确的克隆(含有人α1，2岩藻糖转移酶基因)命名为pIRES-HT。
3)人A20基因真核表达载体的构建以人胎肝组织cDNA为模板、用人A20基因特异性全长引物PCR扩增其全长cDNA；其中，人A20基因特异性全长引物为上游引物5’CGCTCGAGATGGCTGAACA-3’(带下划线的碱基为XhoI识别位点)，下游引物5’CGCTCGAGTTAGCCATACAT-3’(带下划线的碱基为XhoI识别位点)。将目的片段克隆到pGEMT载体中，在PCR及酶切鉴定基础上进行序列测定，将序列正确的克隆命名为pGEMT-A20。
提取pGEMT-A20和pcDNA3质粒，分别用XhoI酶切，回收酶切产物(A20基因2.4kb、pcDNA3 5.4kb)，用T4DNA连接酶连接两个片段，转化大肠杆菌感受态DH5α。挑取抗性克隆，扩增后提取质粒，进行PCR和XhoI酶切鉴定，鉴定正确克隆(含有人A20基因)命名为pcDNA3-A20。
4)准备原代猪胚胎成纤维细胞屠宰一妊娠3个月的小香猪，将整个子宫运回实验室，取出胎儿，以PBS和70％酒精清洗数遍后分别从胎儿皮肤、输卵管、卵巢取出组织样，剪碎成1mm3的小块，DMEM/F12清洗2次后，分批植块于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％CO2培养箱培养6-7天，每2天换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化传代2-3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO冻存。
2、转染在6孔板内进行。转染前一天将猪胚胎成纤维细胞传代，细胞在无血清、无抗菌素的培养基(高糖DMEM，GIBCO)37℃、5％CO2条件下培养。当细胞覆盖率达90％时，用Lipofectamin 2000(Invitrogen)进行质粒转染。将步骤1中的三种质粒(pIRES-AGA，pIRES-HT和pcDNA3-A20)混合(摩尔数1∶1∶1)后同时转染，6孔板中每孔转染质粒总量为4μg，其中pIRES-AGA 1μg、pIRES-HT 1μg、pcDNA3-A202μg。转染后5小时换成含血清培养液(高糖DMEM，GIBCO 10％FCS，)，48小时后将细胞稀释3倍，加入G418(600μg/ml)筛选，待单克隆长成后，镜下挑选、扩增，用于抗原清除率检测。
3、抗原清除率检测以荧光标记的凝集素Griffonia simplicifolia isoform B4(IB4)(sigma)作为αGal抗原的标记物(25℃1hr)，通过流式细胞技术检测转pIRES-AGA、pIRES-HT和pIRES-A20基因的猪胚胎成纤维细胞阳性细胞αGal抗原表达量，以未转基因的猪胚胎成纤维细胞为阳性对照。
αGal抗原表达量与荧光强度呈正相关。若细胞表面存在αGal抗原表位，IB4则与之结合，加以荧光标记物即可在流式细胞仪上检测到荧光信号，信号越强表明抗原表达量越高，此方法是检测细胞表面抗原及其它分子的常规方法。结果如图1a-图1c所示，表明与未转基因的猪胚胎成纤维细胞相比，转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的αGal抗原的表达量均降低90％以上。图1a-图1c中，M1表示阳性对照αGal抗原表达区域。该检测结果表明，本方法显著清除了αGal抗原。
4、E-selectin的表达量检测将转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞和未转基因的猪胚胎成纤维细胞分别接种于6孔板中，接种量为1×105个/孔，同时加入2400IU/ml的TNFα，2小时后收获细胞，用PBS洗三次后加入小鼠抗人血管内皮细胞表面E-selectin抗体鼠抗人CD62E-UNLB(sigma)(sigma)，25℃2hr，PBS洗三次后加入FITC标记的羊抗鼠二抗(中杉生物试剂公司)，25℃1hr，PBS洗三次后，用流式细胞仪检测荧光强度。
在TNF的刺激下NF-κB被激活，引发激活粘附分子(E-selectin、VCAM、ICAM-1等)和细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等)等高表达，同时细胞产生促凝血因子，打破血栓调节素的平衡，引起炎症和凝血，将引起移植物的缺血坏死，引发延缓性排斥反应。A20基因具有抑制NF-κB激活的功能，因此检测在TNF刺激下NF-κB的下游分子E-selectin的表达改变可间接反应A20克服异种器官移植延缓性排斥反应的作用。荧光强度越高，E-选择素表达量越高。结果如图2a和图2b所示，表明转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的E-选择素(NF-κB的下游分子)的表达量均降低50％以上。该检测结果表明，本方法显著抑制人异种器官移植中延缓性排斥反应。图2a和图2b中，M1表示未转基因的猪胚胎成纤维细胞E-选择素表达区域。
5、RT-PCR检测外源基因整合效果PCR扩增引物α1，3-半乳糖苷酶的PCR鉴定引物有两对，PAGA1(AGA 5’)CTTCCTGGCCCTCGTTTCCTG和(AGA3’)GGTCTGGGCATCAATGTCGTAGTA；PAGA2(AGA5’)CCTCTTTATATGTGGCCCTTTCAA和(AGA3’)CCAATCTCCTGCCGGTTTATCAT)。
α1，2岩藻糖转移酶的PCR鉴定引物有两对PHT1(HT5’)CCGCCGGGCCTTTATCCTG和(HT3’)CCACGGTGTAGCCTCCTGTCCATC；PHT2(HT5’)AATGGCCGGTTTGGTAATCAGA和(HT3’)ACGTGGACGCCGACAAAGGTG)。
A20基因的PCR鉴定引物一对PA20FAATGCCCGCAAAGTTGGATGAAGC和PA20RGTGAAGTTGCCGGGCGTTGTGG。
使用β-actin作内对照(Pβ-actinup 5’GCT CAC CAT GGA TGA TGA TAT CGC和Pβ-actindo 5’GAC CTG GCC GTC AGG CAG CTC G)。
培养αGal抗原清除率)90％且E-选择素表达量降低50％以上的转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞和未转基因的猪胚胎成纤维细胞，用TRIzol提取总RNA。用SuperscriptTM First-strand synthesis system forRT-PCR(Invitrogen)反转录获得第一链cDNA，用rTaq(宝生物公司)和上述引物进行PCR，同时设立β-actin内对照，检测比较外源基因的表达水平。结果如图3a和图3b所示，表明αGal抗原清除率)90％且E-选择素表达量降低50％以上的猪胚胎成纤维细胞中均扩增出424、467bp的α1，3-半乳糖苷酶DNA片段，553、401bp的α1，2岩藻糖转移酶DNA片段，570bp的A20 DNA片段，α1，3-半乳糖苷酶、α1，2岩藻糖转移酶DNA表达量比β-actin高，A20的表达量与β-actin相近。未转基因的猪胚胎成纤维细胞中只扩增出等量的β-actin未扩增出其它转基因条带。图3a和图3b中，泳道1为β-actin基因扩增产物，泳道2为A20基因扩增产物，泳道3、4为α1，2岩藻糖转移酶基因扩增产物，泳道5、6为α1，3-半乳糖苷酶基因扩增产物，泳道M为DNA分子量标准(DL2000，博大生物试剂公司)。
6、αGal抗原清除率)90％且E-选择素表达量降低50％以上的转pIRES-AGA、pIRES-HT和pcDNA3-A20的猪胚胎成纤维细胞的染色体检测用秋水仙素(终浓度0.2ug/ml)使未转基因的猪胚胎成纤维细胞和αGal抗原清除率)90％且E-选择素表达量降低50％以上的猪胚胎成纤维细胞处于分裂中期；用0.075M的KCl使细胞处于低渗状态；固定、制片，以10％(质量百分含量)Giemsa染色，镜下观察染色体数目和形态。结果表明联合转入α1，3-半乳糖苷酶基因，α1，2岩藻糖转移酶基因和A20基因未改变细胞形态以及染色体的数量和形态(图4a和图4b)。
序列表<160>1<210>1<211>1290<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260atgcagatgt cattaaaaga cttactttaa 1290
权利要求
1.一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法，是将人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因导入猪体细胞，得到Gal-α1，3-Gal抗原和E-选择素表达量降低的猪体细胞，将该猪体细胞用于人异种器官移植。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述导入猪体细胞的三种基因中，人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因的摩尔比为1∶1∶0.5-1.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述导入猪体细胞的人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因的摩尔比为1∶1∶1。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述方法中利用质粒表达载体或病毒表达载体将所述人α1，3-半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因导入猪体细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述质粒表达载体为pIRESneo、pcDNA3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于携带有所述人α1，3-半乳糖苷酶基因的表达载体为pIRES-AGA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于携带有所述人α1，2岩藻糖转移酶基因的表达载体为pIRES-HT。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于携带有所述人A20基因的表达载体为pcDNA3-A20。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述猪体细胞为成纤维细胞或动脉血管内皮细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述成纤维细胞为胚胎成纤维细胞。
全文摘要
本发明公开了一种抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法。本发明所提供的抑制人异种器官移植中免疫排斥反应的方法是将人α1，3－半乳糖苷酶基因，人α1，2岩藻糖转移酶基因和人A20基因导入猪体细胞，得到Gal－α1，3－Gal抗原和E－选择素表达量降低的猪体细胞。本发明的方法可使猪体细胞表面的末端α－半乳糖基团(Gal－α1，3－Gal抗原)减少90％，NF－κB下游分子E－选择素的表达量降低50％，且细胞染色体数量、形态未受影响，可显著抑制人异种器官移植中免疫排斥反应，特别是超急性排斥反应和延缓性排斥反应。本发明的方法将在抑制人异种器官移植中的免疫排斥反应中发挥重要作用。
文档编号A61K48/00GK1698904SQ20051007215
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者宫锋, 贾延军, 鲍国强, 由英, 王颖丽, 田曙光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所