一种plga?ha?pva支架修饰ha?pva人工软骨材料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种PLGA?HA?PVA支架修饰HA?PVA人工软骨材料的制备方法，该方法是将HA?PVA初乳液注入人工软骨模具I中，进行冻融，形成预交联HA?PVA水凝胶；将所述预交联HA?PVA水凝胶置于尺寸比人工软骨模具I较大的人工软骨模具II中央；向所述人工软骨模具II中注入热PLGA?HA?PVA初乳液，进行冻融，即得生物相容性好、生物力学性能与软骨相近的新型梯度PLGA?HA?PVA支架修饰HA?PVA人工软骨材料。
【专利说明】
一种PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法
技术领域
[00011本发明涉及一种人工软骨的制备方法，特别涉及一种PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，属于医用材料制备领域。
【背景技术】
[0002] 关节软骨的损伤是骨科的临床常见疾病。目前，对于关节软骨损伤的修复的方法 有同体、异体软骨移植，微骨折技术，人工关节置换以及组织工程化软骨和人工软骨材料。 同体软骨移植的供体来源有限，而异体软骨移植存在供受体之间的免疫排斥反应等问题。 近十年来，多位学者报道微骨折技术治疗软骨缺损效果良好，但是也存在修复过程缓慢，康 复方案繁琐，修复物为纤维软骨而不是透明软骨等缺点。传统的人工关节置换不仅成本昂 贵，使用年限（10-15年)远小于自然关节软骨的使用寿命(60-70年）。组织工程化软骨被认 为是最有应用前景的关节软骨修复材料，但是通过何种方法获取数量充足，活力和分化良 好的软骨细胞，以及选择何种支架材料作为细胞载体是软骨组织工程研究的关键问题。既 往的研究表明组织工程化软骨方法在体内能够产生部分新生软骨组织，但存在与周围组织 整合困难、力学性能较差及后期退化等问题。目前仍处于继续探索阶段。
[0003] 人工软骨也是一种非常有前景的治疗方案。和组织工程不同，其不要求使软骨再 生，而是通过采用一些具有良好生物相容性，能和周围组织整合，同时具有良好的力学性能 和摩擦学性能的材料来替代软骨功能。
[0004]目前在研的人工软骨材料有：聚乙烯醇水凝胶、透明质酸水凝胶、壳聚糖水凝胶、 纤维蛋白水凝胶、藻酸盐凝胶以及多种材料制备的复合水凝胶。其中与天然关节软骨结构 与功能接近的聚乙稀醇凝胶(poly vinyl alcohol hydrogen PVA-H)被认为是一种有发展 前景的关节软骨修复材料。其优点有:①众多的研究者发现聚乙烯醇水凝胶具有与关节软 骨相似的结构。首先，其三维网络结构中含有大量大小不等的孔隙，孔隙大小大约为几个μπι 至几十个Mi数量级。这些具有微米量级的孔隙结构同自然关节软骨的微观结构非常相似， 能为骨细胞的长入提供附着面;其网状结构内含有大量水分具有可渗透性，属于微孔结构 的亲水材料，能为关节面提供润滑，避免磨肩产生;②它还有良好的生物相容性，长期植入 体内无明显的毒性反应。③在力学性能方面最接近软骨。PVA-H具有良好的粘弹性，可以像 软骨一样缓冲震荡，其拉伸和压缩弹性模量和软骨相近，明显优于聚乙烯和不锈钢等常规 人工关节材料。
[0005] 但是大量研究发现，通过现有常规的方法制备的人工软骨难以和周围软骨细胞完 全整合，限制了软骨组织材料功能的发挥。骨细胞虽然能在人工软骨周围生长但很难和它 完全结合并长入其结构内部。研究者认为人工软骨难以和周围组织整合的原因主要为：1、 微观孔隙结构不佳，目前制备的PVA水凝胶三维多孔结构联通孔太少，孔隙率和孔径太小， 不适合软骨细胞的长入。2、PVA的亲水性导致细胞的粘附能力差。
[0006] 综上所述，关节软骨损伤发病率高，治疗效果差，是临床上一个棘手的难题。人工 软骨材料是有前景的解决方案，PVA水凝胶生物力学性质好，但存在不能和周围软骨完全整 合的问题，因此研究解决这个问题的方法是个非常迫切的科学问题。
【发明内容】
[0007] 针对现有的人工软骨存在微观孔隙结构不佳及人工软骨材料亲和力差等缺陷，本 发明的目的是在于提供一种生物相容性好、生物力学性能与软骨相近的新型梯度PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料，其核心区符合生物力学要求，能完全取代软骨功能，支 架区孔隙结构明显，生物相容性好，符合组织工程支架要求，使PLGA-HA-PVA支架修饰人工 软骨能够替代软骨的承重的基础上，能良好地与周围组织整合。
[0008] 为了实现上述技术目的，本发明提供了一种PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软 骨材料的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0009] 1)将HA-PVA初乳液注入人工软骨模具I中，进行1~2次冻融，形成预交联HA-PVA水 凝胶；
[0010] 2)将所述预交联HA-PVA水凝胶置于人工软骨模具II中央，所述人工软骨模具II内 腔形状与所述人工软骨模具I内腔一致，且所述人工软骨模具II内腔尺寸大于所述人工软 骨模具I内腔尺寸；
[0011 ] 3)向所述人工软骨模具II中注入温度为80 °C~100 °C的PLGA-HA-PVA初乳液，进行 4~6次冻融，即得PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨。
[0012] 优选的方案，每次冻融的条件为:在-25 °C~-20 °C冷冻18~24小时后，在室温下融 化2~4小时。最优选在-20°C冷冻21小时，在室温下融化3小时。
[0013] 优选的方案，步骤1)中进行1次冻融。优选进行一次冻融，能防止HA-PVA过度交联。
[0014] 优选的方案，步骤3中进行5次冻融。优选5次冻融，能使复合凝胶充分交联成型。 [0015] 优选的方案，将PVA和n-HA粉末溶于水中，在80°C~100°C温度下搅拌反应，形成 HA-PVA初乳液。最优选在90°C温度下搅拌反应。
[0016] 较优选的方案，HA-PVA初乳液中PVA含量为15~25wt%，HA含量为3~7wt%DHA-PVA初乳液中PVA含量最优选为20wt %，HA含量最优选为5wt %。在该优选范围内，获得的HA-PVA具有最佳的力学性能。
[0017] 优选的方案，将PLGA粉末溶于二氯甲烷形成PLGA初乳液，所述PLGA初乳液加入HA-PVA初乳液中，在80 °C~100 °C搅拌反应，待二氯甲烷完全挥发后，得到PLGA-HA-PVA初乳液。 最优选在90°C下搅拌反应。
[0018] 较优选的方案，将PVA和n-HA粉末溶于水中，在80°C~100°C温度下搅拌反应，形成 HA-PVA初乳液。最优选在90°C温度下搅拌反应。
[0019] 较优选的方案，PLGA-HA-PVA初乳液中PLGA含量为25~35wt%，HA含量为2~ 7wt%，PVA含量为10~20wt% WLGA-HA-PVA初乳液中PLGA含量最优选为30wt%，HA含量最 优选为5wt %，PVA含量最优选为15wt %。在该优选的范围内，获得的PLGA-HA-PVA支架材料 孔隙结构明显，生物相容性好，成软骨能力最强。
[0020] 优选的方案，所述人工软骨模具II内腔尺寸为所述人工软骨模具I内腔尺寸的 1.05~1.30倍;其中，内腔尺寸以截面半径计。最优选为所述人工软骨模具II内腔尺寸为所 述人工软骨模具I内腔尺寸的10/9倍。当人工软骨模具I的内腔尺寸与所述人工软骨模具II 的比值越接近1时，PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的生物力学性能越佳。
[0021] 本发明的技术方案的关键技术在于:先利用小尺寸的模具使HA-PVA初乳液预交联 成凝胶，将预交联的HA-PVA凝胶置于大尺寸的模具中，将温度在90 °C左右的PLGA-HA-PVA初 乳液注入大尺寸的模具中，巧妙地利用PLGA-HA-PVA初乳液的热量使HA-PVA凝胶的边缘部 分溶解，同时利用PVA水溶液具有的良好的粘接性，通过共同冻融，两部分的PVA分子相互交 织形成紧密的交联界面，制得的HA-PVA人工软骨核心区与外部修饰的PLGA-HA-PVA支架完 美结合。
[0022] 相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
[0023] 1)本发明的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料内部的人工软骨核心区由 HA-PVA材料构成，其具有优异的力学性能，符合生物力学要求，能完全取代软骨功能；而外 部的支架区由PLGA-HA-PVA材料构成，其具有丰富的孔结构，生物相容性好，符合组织工程 支架要求，使PLGA-HA-PVA支架修饰人工软骨能够替代软骨的承重的基础上，具有良好的与 周围组织整合能力。
[0024] 2)本发明的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料通过特殊的方法制备得 到，其HA-PVA人工软骨核心区与PLGA-HA-PVA支架区之间通过物理交联完美结合成整体，有 利于改善人工软骨材料的性能。
[0025] 3)本发明的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料制备方法操作简单，成本 低，易于实施，有利于大规模生产。
【附图说明】
[0026]【图1】为制备PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的流程示意图；
[0027]【图2】为PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料照片；
[0028]【图3】为PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨材料压缩应力随应变的变化关 系曲线；
[0029]【图4】为PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料各组成部分的扫描电镜图；
[0030] 【图5】为软骨细胞体外共培养免疫组化、Π 型胶原免疫组化软骨细胞体外共培养 及体内成软骨免疫组化、Π 型胶原免疫组化图。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例旨在进一步说明本
【发明内容】
，而不是限制本发明权利要求的保护范 围。
[0032] 实施例1
[0033] 1)HA-PVA初乳液制备方法:秤取一定量的PVA和n-HA粉末置入烧杯中，加入对应量 的双蒸水，置于恒温磁力搅拌器上水浴加热至90°C，进行磁力搅拌，形成HA-PVA初乳液，其 中，PVA含量为20wt%，HA含量为5wt%。
[0034] 2)PLGA-HA-PVA初乳液制备方法:秤取PLGA粉末，加入5mL二氯甲烷中，持续超声波 震荡，待PLGA完全溶解，形成均质的乳白色初乳液;将初乳液加入按上述方法制备的HA-PVA 初乳液中，加热至90°C继续磁力搅拌10分钟，使得二氯甲烷完全挥发，制备出PLGA-HA-PVA 初乳液，其中，PLGA含量为30wt%，HA含量为5wt%，PVA含量为15wt%。
[0035] 3)将HA-PVA初乳液注入模具I，冻融1次(-20°C冷冻21小时，室温融化3小时）形成 未充分交联的人工软骨核心区，然后将此HA-PVA水凝胶置入半径稍大的模具II中，模具II 的截面半径为模具I截面半径的10/9倍，注入90°C的PLGA-HA-PVA初乳，注入的溶液散发的 热量使HA-PVA凝胶的边缘部分溶解，同时PVA水溶液具有良好的粘接性，使得两部分相互交 织形成交界部，再次，冻融5次(_20°C冷冻21小时，室温融化3小时，重复5次），两部分的PVA 分子形成紧密的物理交联，从而制备出PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨。
[0036]制备的PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨如图2所示。制备的软骨材料其表 面光滑，内部的HA-PVA人工软骨核心区与外部的PLGA-HA-PVA支架完全融合成一整体，无法 分呙。
[0037]人工软骨性能测试数据如下：
[0038] 1、生物力学检测:对于人工软骨PVA-HA部分(起承重作用，通过测试其生物力学即 压缩力学实验）：测试发现制备的PLGA-HA-PVA修饰的HA-PVA人工软骨为一种粘弹性材料。 通过制备不同半径比的PLGA-HA-PVA修饰的HA-PVA人工软骨材料，由图3可知，制备的各组 HA-PVA人工软骨压缩应力随应变的变化为非线性关系，表现为指数函数的变化规律，说明 我们所制备的此种新型人工软骨为一种粘弹性材料。
[0039]
[0041 ] 2、扫描电镜观察:PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨不同部位环境扫描电 镜照片如图4所示:从图中看出制备的PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨各构成部分 都有明显的多孔结构。支架部孔隙结构明显，孔径约几十微米至一百多微米。孔隙主要结构 由PVA构成，内部孔隙的边缘附着有PLGA微球，粒径约30-40微米，纳米级羟基磷灰石均匀分 布于PVA构成的支架内部。交界部孔隙结构减少，孔径约几十微米，PLGA微球分布明显减少。 核心部孔隙结构明显减少，孔径约为十微米量级，未见PLGA微球存在。
[0042] 3、体外实验：
[0043] 体外实验（14天）：PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨材料冷冻干燥后，环氧 乙烷消毒备用。0.25 %胰酶消化收集2代软骨细胞，用含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养液制 成细胞悬液，每个PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨材料滴细胞浓度为5 X 106个/mL 的细胞悬液300yL，放入细胞培养箱中培养。2h后，各种均加入DMEM培养液2mL，继续放入细 胞培养箱中培养。隔天换液一次，14天后支架复合人工软骨经4%多聚甲醛固定24h，石蜡包 埋，切成约5μπι的薄片。行苏木素-伊红(HE)染色，Π 型胶原免疫组化，光镜下观察。
[0044] HE染色结果如下:HE染色均呈阳性，细胞分泌基质较多，并有软骨样基质形成，陷 窝结构成片状或巢状，如图5(A)。
[0045] Π型胶原免疫组化:支架材料内部可见Π型胶原免疫组化棕黄色阳性表达，细胞 成颗粒状分布;如图5(B)。
[0046]体外实验结果证实该材料具有良好的细胞亲和力，可以使软骨细胞长入其中。 [0047] 体内成软骨实验（12周）：PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨料冷冻干燥后 环氧乙烷消毒备用。0.25%胰酶消化收集2代软骨细胞，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养 液制成细胞悬液，PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨滴细胞浓度为5X10 6个/mL的细 胞悬液300yL，放入细胞培养箱中培养，培养7天，隔天换液一次。取4周龄健康裸鼠，备皮后， 消毒背部皮肤，在无菌条件下将PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨材料-软骨细胞复 合物植入裸鼠背部皮肤，6周后PLGA-HA-PVA支架修饰的HA-PVA人工软骨经4 %多聚甲醛固 定24h，石蜡包埋，切成约5μπι的薄片。行苏木素-伊红(HE)染色，Π 型胶原免疫组化，光镜下 观察。
[0048] HE染色:支架内阳性表达，胞核蓝染，细胞外基质红染，如图5(C)。
[0049] Π型胶原免疫组化:细胞外基质内有棕黄色阳性异染区，轮廓清晰，分布均匀，如 图 5(D)。
[0050] 体内实验可见支架材料外有类软骨样物质生成，HE染色及二型胶原免疫组化证实 该材料有较好的体内成软骨能力。
【主权项】
1. 一种PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特征在于:包括以下 步骤： 1) 将HA-PVA初乳液注入人工软骨模具I中，进行1~2次冻融，形成预交联HA-PVA水凝 胶； 2) 将所述预交联HA-PVA水凝胶置于人工软骨模具II中央;所述人工软骨模具II内腔形 状与所述人工软骨模具I内腔一致，且所述人工软骨模具II内腔尺寸大于所述人工软骨模 具I内腔尺寸； 3) 向所述人工软骨模具II中注入温度为80 °C~100 °C的PLGA-HA-PVA初乳液，进行4~6 次冻融，即得PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨。2. 根据权利要求1所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:每次冻融的条件为:在-25°C~_20°C冷冻18~24小时后，在室温下融化2~4小时。3. 根据权利要求1所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:将PVA和n-HA粉末溶于水中，在80 °C~100 °C温度下搅拌反应，形成HA-PVA初乳液。4. 根据权利要求3所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:HA-PVA初乳液中PVA含量为15~25wt%，HA含量为3~7wt%。5. 根据权利要求1所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:将PLGA粉末溶于二氯甲烷形成PLGA初乳液，所述PLGA初乳液加入HA-PVA初乳液中， 在80 °C~100 °C搅拌反应，待二氯甲烷完全挥发后，得到PLGA-HA-PVA初乳液。6. 根据权利要求5所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:将PVA和n-HA粉末溶于水中，在80 °C~100 °C温度下搅拌反应，形成HA-PVA初乳液。7. 根据权利要求5所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法，其特 征在于:PLGA-HA-PVA初乳液中PLGA含量为25~35wt%，HA含量为2~7wt%，PVA含量为10~ 20wt% 〇8. 根据权利要求5或6所述的PLGA-HA-PVA支架修饰HA-PVA人工软骨材料的制备方法， 其特征在于:所述人工软骨模具II内腔尺寸为所述人工软骨模具I内腔尺寸的1.05~1.30 倍;其中，内腔尺寸以截面半径计。
【文档编号】A61L27/26GK106039418SQ201610584777
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月22日 公开号201610584777.6, CN 106039418 A, CN 106039418A, CN 201610584777, CN-A-106039418, CN106039418 A, CN106039418A, CN201610584777, CN201610584777.6
【发明人】胡懿郃, 苏伟平, 谢杰, 李明清, 曾敏, 汪龙
【申请人】胡懿郃