专利名称：组织工程骨/软骨双层支架及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时适用于骨和软骨生长的双层支架，尤其涉及一种用 于引导骨和软骨复合组织再生的组织相容性双层支架及其构建方法，本发明 还涉及该双层支架在医学中的用途，属于组织工程学领域。
背景技术：
组织工程学是涉及细胞生物学、材料科学、工程学以及生物反应器的一 门交叉学科，利用生命科学和工程学的基本原理和方法，构建人体所需要组 织，用于修复、替代因创伤、疾病而无功能的组织(器官)。组织工程研究的 主要内容包括种子细胞、支架材料、生长因子。种子细胞包括软骨细胞、 骨髓基质干细胞、脂肪源性干细胞以及经过基因工程改造的细胞等。用于构 建骨、软骨的支架材料多种多样，包括无机材料(如羟基磷灰石、生物陶瓷、 生物玻璃等)、有机材料(聚乳酸、聚羟基乙酸以及两者的共聚物等)以及有 机无机构建的复合材料。早期常采用同种支架材料在不同区域分别接种成骨 细胞和软骨细胞而构建骨、软骨复合体，但是由于骨与软骨组织构建时对生 物材料种类、性能有不同要求。后来又采用两种不同支架材料分别构建组织 工程骨、软骨组织，然后组装到一起的方法构建组织工程骨一软骨复合体。 组装的方法包括纤维蛋白凝胶粘合、无创伤缝线缝合方法或者聚乳酸棒粘合 固定等，但是构建出的骨一软骨复合体存在骨、软骨界面结合欠佳的问题(Schaefer D， Martin I, Shastri P， et al. In vitro generation of osteochondral composites. Biomaterials JT. Biomaterials, 2000,21:2599-606)。
最近国外有用松质骨和包裹软骨细胞的琼脂糖凝胶体外培养出骨、软骨 复合体，利用琼脂糖凝胶能渗入松质骨的特性，组织工程软骨部分和骨支架 达到良好的结合，但是凝胶的力学特性较差，达不到体内负重的要求(Hung CT: Lima EG, Mauck RL， et al. Anatomically shaped osteochondral constructs for articular cartilage repair. J Biomech JT - Journal of biomechanics, 2003,36:1853-64)。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种骨支 架和软骨支架结合良好并且分别适合骨和软骨生长要求的一体化的组织工程 骨/软骨双层支架。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种适合骨和软骨生长的组织工程双层支架，该双层支架的上层为软骨
脱细胞基质三维多孔海绵支架(CACM )，下层为脱细胞骨支架(ACBM)。 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述组织工程骨/软
骨双层支架的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种构建上述组织工程骨/软骨双层支架的方法，包括将脱细胞骨支架
浸入到脱细胞软骨基质微丝的悬液中，冷冻冻干后，交联，经再次冻干，即 得。
本发明人通过系列的试验发现，如果将脱细胞骨支架浸入脱细胞软骨基质微丝悬液中的深度保持在0.5 4mrn (更优选为1 2mm)，相比于其它的深 度，具有更好的技术效果。
此外，上述方法中所述的冷冻冻干优选在-2(TC -8(TC温度下冻干1 48 小时。
所述的交联可采用以下任意一种方法进行真空干热物理方法交联；紫 外线交联；或者在醛类化合物交联lh 48h，在碳化二亚胺类化合物交联lh 48h，或在碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中交联lh 48h;
优选的，所述真空干热物理方法交联(重度脱氢法)按照下述条件进行
交联温度为80。C 13(TC,时间为l 48h;
所述紫外线交联条件优选为紫外线波长为258nm，距离光源5 10cm， 交联时间15min 8h;
所述的醛类化合物优选为甲醛或者戊二醛，它们的浓度优选为0.01% 2.5%，更优选为0. 05 0. 25%;
所述的碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合水溶液优 选由浓度为0. 001 1M的碳化二亚胺与浓度为0. 001 1M的N-羟基琥珀酰亚 胺按照任意重量比例组成，更优选由浓度为0. 01 0. 3M的碳化二亚胺与浓度 为0. 005 0. 2M的N-羟基琥珀酰亚胺按照任意重量比例组成。
所述的脱细胞骨支架优选按照以下方法制备得到将新鲜骨按照以下步 骤依次在下述溶液中进行浸泡处理①用NaN3在0-4"C的低温条件下进行浸 泡处理(所述浸泡处理的时间可视情况而定，时间长一点或短一点都可，作 为参考，处理时间可为20-32小时，优选为24小时)；②用体积比为1: 1 的氯仿/甲醇在室温(该室温的温度范围可以为10-3(TC的温度范围)条件下进行浸泡处理(其中，所述浸泡处理的时间可视情况而定，时间长一点或短 一点都可，作为参考，浸泡处理时间可为l-6h，更优选为4小时)；③用重
量体积比为3% Triton-100浸泡处理(所述浸泡处理的时间可视情况而定， 时间长一点或短一点都可，作为参考，浸泡处理时间可为6-20h，更优选为 12小时)； 7%脱氧胆酸钠浸泡处理(所述浸泡处理的时间可视情况而定， 时间长一点或短一点都可，作为参考，浸泡处理时间可为12-32h，更优选为 24小时)；⑤将步骤③和④重复操作一遍；⑥去离子水反复冲洗，即得。
上述方法中，更优选的，步骤(2)中氯仿/甲醇混合溶液与骨的体积/重 量比为30: 1。
所述的脱细胞软骨基质微丝悬液优选按照以下方法制备得到(1)、将新 鲜关节软骨在0-4'C低温下浸泡于Tris—HCL缓冲液(优选的，该缓冲液的浓 度为50mmol/L ， pH值为7. 5，最好该缓冲液中还含有0. 035 mmol/L的蛋白 酶抑制物PMSF)中浸泡处理；
(2) 、粉碎；采用密度梯度离心法取直径为100nm-5um左右的软骨微丝；
(3) 、 0-4'C下加入含0.5-2%TritonX-100的Tris—HCL缓冲液中(优选 的，该缓冲液的pH值为7.5，该缓冲液中还含有0.035mmol/L的蛋白酶抑制 物PMSF)持续振荡24 72h去除细胞成分；
(4) 用DNase I和RNase A在37。C下消化2 3小时，离心，将沉淀用 蒸馏水反复冲洗，按重量比配成0.5% 5%的白色乳悬液，即得。
本发明制备支架所用的材料为天然软骨材料和骨材料，包括异体(人) 或者异种(牛、猪)天然软骨和骨。
本发明对于组织工程骨软骨双层支架软骨部分，采用软骨脱细胞基质材 料。本发明人对以前的大块天然软骨脱细胞方法(张建党，卢世璧，黄靖香，等.人关节软骨脱细胞基质的制备.中国矫形外科杂志，2005，13:276 — 7)进行 改进，将之粉碎成直径为100nm-5um左右的微丝，在进行软骨脱细胞去除抗 原性的基础上，采用简单的冷冻冻干法制备成三维多孔海绵状支架，保留了 软骨的生化成分，具有合适的孔径和孔隙率，有利于细胞的种植、粘附以及 营养物质的供应和代谢废物的排出。
对于组织工程骨软骨双层支架骨部分，本发明采用脱细胞骨基质材料。 采用性质比较温和的去垢剂Triton X—IOO和脱氧胆酸钠，去除了天然骨的细 胞成分但没有改变骨组织的天然结构。
本发明方法所采用的材料均属于天然生物材料，具有良好的生物相容性 和可降解性，而且材料来源广泛。通过去细胞去处抗原成分，并且冷冻进一 步降低支架的抗原性。采用冷冻一冻干法可以通过调节冷冻温度、降温速率、 脱细胞微丝悬液的浓度等因素可控制多孔支架的微结构，制备出具有适宜孔 径和孔隙率的三维多孔支架。经过物理或化学的方法交联以调节多孔支架的 生物力学特性和降解速率。通过将悬液注入不同形状和大小的模具中，可根 据临床软骨缺损制备合适的支架。通过本发明制备脱细胞软骨基质/脱细胞骨 双层支架结合组织工程的方法可以应用于骨软骨联合缺损以及关节缺损的修 复和重建。
本发明骨/软骨(CACM /ACBM)双层支架的主要优点如下
① 骨、软骨支架部分分别由天然骨、软骨脱细胞材料制成，保留了天然 材料的细胞外基质成分，生物相容性好。
② 骨、软骨支架部分结构不同，分别适合骨、软骨生长的不同要求。
③ 骨、软骨部分结合良好，解决了在体外培养或者体内植入时骨、软骨 分层的问题。④可利用CAD设计和制造技术制备与骨软骨缺损或者关节缺损的形状、 大小相同的双层支架材料，可个体化应用于病人。
图l 本发明组织工程骨软骨双层支架的示意图。
图2 组织工程骨软骨双层支架；上层为CACM，下层为ACBM。
图3 本发明双层支架软骨部分番红O染色阳性，无细胞及细胞碎片残留 (x20)。
图4 本发明双层支架软骨部分甲苯胺兰染色阳性，无细胞及细胞碎片 残留(x20)。
图5 本发明双层支架软骨部分II型胶原免疫荧光染色阳性，无细胞及 细胞碎片残留(x20)。
图6 本发明双层支架软骨部分II型胶原染色阳性，无细胞及细胞碎片 残留(x20)。
图7 本发明双层支架HE染色显示脱细胞骨支架无细胞及细胞碎片残留 (x20)。
图8 扫描电镜观察下脱细胞软骨支架结构。
图9 扫描电镜观察下脱细胞骨支架结构。
图IO扫描电镜观察下双层支架结构(骨软骨部分结合良好)。
图ll 倒置显微镜观察下软骨细胞呈球形附着在软骨支架。
图12 倒置显微镜观察下成骨诱导的BSSCs呈梭形附着在骨支架部分。
图13 电镜下软骨细胞呈球形附着在软骨支架。
图14 电镜下软骨细胞呈球形附着在软骨支架。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成 任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均 落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、 制备0.5% 5%浓度的软骨脱细胞微丝悬液
将人关节软骨(解放军总医院骨组织库提供)用生理盐水冲洗干净后， 浸泡于50mmol/L的Tris—HCL缓冲液(pH7. 5)中，缓冲液内含有蛋白酶抑制 物PMSF (0.035 mmol/L)，经粉碎机粉碎，采用密度梯度离心法取100nm-5 u m 左右的软骨微丝，4。C下加入1%的TritonX-100的Tris—HCL缓冲液(pH7. 5)， 缓冲液内同样含有蛋白酶抑制物PMSF (0. 035 mmol/L)，室温下持续震荡48小 时，用DNaseI、 RNase A在37。C下消化2 3小时，并不断搅拌，离心后用 三蒸水反复冲洗，配成0.5% 5% (重量比)的乳状悬液；
2、 制备脱细胞骨支架
以新鲜的人松质骨(解放军总医院骨组织库提供)为原料，制成直径为 8mm的骨柱，然后进行脱细胞处理，流程如下①3mmolNaN3， 4'C处理24h。 ②1: l氯仿甲醇中室温处理4h(重量体积比30: 1)。③3% Triton-100 (重 量体积比30: l)处理12h。
7%脱氧胆酸钠处理24h。⑤重复③、 过程 一遍⑥去离子水反复冲洗，备用；
3、 骨软骨双层支架的构建和交联采用简单的冷冻冻干法，将软骨脱细胞基质微丝充分混匀后倒入容器中，
ACBM位于其上方(见图1),控制溶液渗入到ACBM中的深度保持在0. 5 4mm， —2(TC冷冻，使其完全凝固，然后将样品放入冷冻冻干机内，冷冻干燥24小 时以上；再用258nm紫外线照射60min，然后浸入14mM EDAC及5. 5mM NHS溶 液交联2h， PBS冲洗3遍后将支架冷冻冻干，消毒，得双层支架(见图2)。
4、 所制备的双层支架的病理组织学检查、电镜检査 病理组织学检查、电镜检查结果表明，本发明双层支架的脱细胞软骨基
质海绵部分，脱细胞彻底，保留了软骨的生化成分，蕃红0染色可见细胞外 基质微丝相互连接，形成均匀一致的网状结构，细胞外基质微丝上软骨细胞 消失，支架均呈红染(图3)，甲苯胺蓝染色呈阳性，网状结构均呈蓝色(图4)。 II型胶原免疫荧光染色阳性，支架呈绿色荧光(图5); II型胶原免疫组织化 学染色阳性，网状支架呈棕色(图6)。骨部分脱细胞彻底，支架天然结构未 见改变(图7);扫描电镜显示，软骨、骨支架均呈多孔网状(图8，图9)， 骨、软骨层结合良好(图10)。
5、 支架的生物相容性
将骨髓基质干细胞分别向软骨以及成骨诱导后，分别种植到支架的软骨、 骨部分，倒置显微镜、电镜观察。BMSCs成软骨诱导后呈球形黏附于软骨支 架孔隙中(图ll，图13)， BMSCs成骨诱导后呈梭形黏附于骨支架孔隙中以及 表面(图12，图14)
权利要求
1、一种适合骨和软骨生长的组织工程骨/软骨双层支架，其特征在于该双层支架的上层为软骨脱细胞基质三维多孔海绵支架，下层为脱细胞骨支架。
2、 按照权利要求1所述的组织工程骨/软骨双层支架，其特征在于所 述的软骨或骨包括异体人或者异种牛、猪的天然软骨或骨。
3、 一种构建权利要求1或2所述组织工程骨/软骨双层支架的方法，包 括将脱细胞骨支架浸入到脱细胞软骨基质微丝的悬液中，冷冻冻干后，交 联，经再次冻干，即得。
4、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的脱细胞骨支架按 照以下方法制备得到将新鲜骨按照以下步骤依次在下述溶液中进行浸泡处 理(1 )、用NaN3在0-4°C的低温条件下进行浸泡处理；(2) 、用体积比为1: 1的氯仿/甲醇在室温条件下进行浸泡处理；(3) 、用重量体积比为3% Triton-100浸泡处理；(4) 、 7%脱氧胆酸钠浸泡处理；(5) 、将步骤(3)和(4)重复操作一遍；(6) 、去离子水反复冲洗，即得。
5、 按照权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)中氯仿/甲醇 混合溶液与骨的体积/重量比为30: 1。
6、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的脱细胞软骨基质 微丝悬液按照以下方法制备得到(1)、将新鲜关节软骨在(HTC低温下浸泡于Tris—HCL缓冲液中浸泡处理；(2) 、粉碎；采用密度梯度离心法取直径为100nm-5um左右的软骨微丝；(3) 、 0-4。C下加入含0. 5-2%Triton X-100的Tris—HCL缓冲液中持续 振荡24 72h;(4) 、用DNase I和RNase A消化后，离心，将沉淀用蒸馏水按重量比 配成0.5% 5%的白色乳悬液，即得。
7、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于将脱细胞骨支架浸入脱 细胞软骨基质微丝悬液中的深度保持在0. 5 4mm。
8、 按照权利要求7所述的方法，其特征在于将脱细胞骨支架浸入脱 细胞软骨基质微丝悬液中的深度保持在1 2mm。
9、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的冷冻冻干在-2(TC -8(TC温度下冻干1 48小时。
10、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的交联可采用以下 任意一种方法进行真空干热物理方法交联；紫外线交联；或者在醛类化合 物交联lh 48h，在碳化二亚胺类化合物交联lh 48h，或在碳化二亚胺类化 合物与N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液中交联lh 48全文摘要
本发明公开了一种组织工程骨/软骨双层支架及其构建方法和在医学中的用途。本发明采用天然软骨和骨为材料，通过脱细胞分别去除软骨和骨的抗原性，采用冷冻—冻干法，制备同时适合骨、软骨两种组织生长的双层支架。具体制备方法包括将脱细胞骨浸入软骨脱细胞基质微丝的悬液中，采用冷冻—冻干法和交联法，制备出上层为软骨脱细胞基质三维多孔海绵支架，下层为脱细胞骨支架的双层支架材料。本发明双层支架软骨脱细胞基质海绵支架部分可以引入促进成软骨的因子，脱细胞骨部分可以引入促进成骨的因子，分别接种成软骨或成骨的细胞，构建有生命的组织工程骨软骨复合体，用于临床上修复骨软骨复合缺损或者全关节缺损。
文档编号A61L27/40GK101574540SQ20081010613
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者卢世璧, 军 姚, 孙明学, 莉 张, 江 彭, 强 杨, 汪爱媛, 玥 田, 翔 眭, 许文静, 斌 赵, 郭全义, 黄靖香 申请人:中国人民解放军总医院