一种组织工程骨软骨复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物材料工程技术领域，涉及人体关节软骨的组织工程支架制备技术。
【背景技术】
[0002]目前，因创伤、感染、肿瘤及退变等导致的可动关节端软骨缺损是骨科临床常见疾病，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者可丧失运动功能，并且软骨损伤会导致进一步的软骨磨损和关节面的损坏。由于关节软骨没有血管、神经和淋巴系统，直径超过2?4mm的软骨缺损几乎不能完全自我修复;且临床上单纯关节软骨损伤比较少见，更多的是伴随软骨下骨的病变，包括创伤引起的软骨下骨的缺损，骨软骨炎病变引起的软骨下骨的坏死，软骨退变引起的软骨下骨的硬化、脂肪变等。因此，在修复软骨的同时还需修复软骨下骨。传统治疗方法均存在诸多明显缺陷:关节清理术暂时缓解症状，不能阻止病程发展;关节融合术、关节切除成形术使关节功能严重丧失;人工关节置换术存在远期骨溶解和假体松动等问题;关节镜下骨软骨移植术，自体移植造成供体区域缺损且来源有限、异体移植则存在排斥反应及潜在传染疾病等弊端;难以实现关节软骨及软骨下骨的自然修复再生。组织工程技术的迅速发展，为关节软骨及软骨下骨缺损的再生修复提供了新的解决方案。
[0003]用组织工程学方法修复关节软骨及软骨下骨，在临床研究或动物实验研究中取得了一定的临床效果，使得全层的关节损伤修复成为可能。目前组织工程骨软骨支架材料设计主要分为以下几类:1)骨采用支架而软骨不采用支架，即在骨支架上方直接种植上高密度的软骨细胞或成软骨细胞，经体外培养后植入或者不经体外培养直接植入体内对关节软骨及软骨下骨缺损进行修复;2)采用适合骨、软骨构建的两种支架材料，分别在体外培养形成组织工程骨和软骨，然后粘合、或手术缝合、或顺序植入等方法将组织工程骨和软骨部分组装成组织工程骨软骨复合体；3)骨和软骨部分皆采用相同的支架材料的一体化单层支架;4)骨软骨部分分别采用两种不同的支架材料构建的一体化的双层支架。而其中一体化双层支架，其骨和软骨支架层的成分及结构是根据骨和软骨生长的需要而设计的，因而这种一体化的组织工程骨软骨复合支架具有更优良的特性。
[0004]组织工程骨软骨支架材料存在的主要问题是构建的骨和软骨的界面结合较差以及支架种植体与周围宿主骨软骨整合性能不佳，而且关节软骨构建后的功能不理想。导致以上问题的主要原因与目前支架材料的设计缺陷有关。纵观自然关节组织的构造，它包含了软骨区、软骨钙化区和骨化区等多个区域，其组织和结构是逐渐过渡的，没有明显的界面，因而力学结构稳定。反观目前组织工程骨软骨体支架材料的设计，骨和软骨部分没有过渡区，在界面处杨氏模量无法匹配，因而界面处容易导致应力集中。此外，这种设计亦难以实现种植体与周围宿主骨软骨较好的整合。这足以说明软骨钙化层是组织工程骨软骨支架材料设计不可缺少的要素。因此，要解决骨和软骨界面的结合问题，必须在骨和软骨间引入过渡层，即软骨钙化层。软骨钙化层的引入不仅有利于骨和软骨界面的杨氏模量的匹配，也由于种植体与周围宿主骨软骨组织结构更加相似而有助于种植体与周围宿主骨软骨间的界面整合。此外，作为骨软骨过渡界面的软骨钙化层是一种物理屏障，还起到了阻断血管侵入软骨的作用，是防止全层缺损骨化及软骨修复不可缺少的条件。目前为此，软骨钙化层研究主要大多聚焦在深层软骨细胞的研究中，或通过深层软骨细胞在矿化基质的培养构建软骨钙化层，或是通过深层软骨细胞在单层矿化基质的培养构建软骨钙化层，这些研究发现矿化基质以及含有磷酸钙颗粒的基质有利于软骨钙化层的形成。这些研究仅孤立地对软骨钙化层进行研究而忽略了骨层和浅层软骨细胞层及其代谢对软骨钙化层的影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种组织工程骨软骨复合支架，它能有效地解决关节软骨及软骨下骨的重建问题，有利于体内关节软骨及软骨下骨全层缺损的修复。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法。它能有效地解决组织工程骨软骨复合支架制备成形问题。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0008]一种组织工程骨软骨复合支架，通过分别制备其复合溶胶，复合支架的软骨支架层为上层复合溶胶，它是在接枝了 RGD(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸三肽序列)的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入生长因子和纳米同轴短纤维及软骨细胞悬浮液的方式，并对生长因子进行联合序贯使用构建而成;复合支架的软骨钙化层为中间层复合溶胶，它是在接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与N-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中均匀混入微米羟基磷灰石、载生长因子的纳米同轴短纤维和软骨肥大细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成;复合支架的骨支架层为底层复合溶胶，它是在接枝了 RGD的氧化海藻酸钠-海藻酸钠与钙离子交联形成的溶胶基体中均匀混入纳米羟基磷灰石、生长因子的纳米同轴短纤维和成骨细胞悬浮液的方式，对生长因子进行缓释构建而成;将上述三种功能层复合溶胶组装在一起，构成一体化组织工程骨软骨复合支架，同时，在中间层和底层之间通过静电纺丝的方式制备孔径小于5μπι的多孔的细胞隔断膜。
[0009]所述纳米同轴纤维的内轴为载生长因子的聚乙二醇，外轴为聚ε-己内酯。
[0010]所述的纳米同轴短纤维在骨组织支架层复合溶胶、软骨组织钙化层复合溶胶和软骨组织支架层复合溶胶所载的生长因子分别为BMP-2、Wnt/i3-catenin和FGF-2。
[0011 ]本发明的另一个目的是通过以下技术方案来实现的:一种组织工程骨软骨复合支架的制备方法，包括以下步骤:
[0012]步骤一:载生长因子的纳米同轴短纤维的制备，将聚ε-己内酯溶于氯仿配成质量分数为20%的聚合物溶液作为外轴，流速设置为0.5mL/h，将聚乙二醇溶于蒸馏水配成质量分数为40 %的聚合物溶液并加入生长因子作为内轴，流速设置为0.lmL/h，外加直流高电压为20kV，以转速为1200r/min的高速转动的滚筒作为接收器，喷射针头的外针头内径为
1.1mm,内针头外径为0.6mm，内针头内径0.3mm和滚筒边缘的距离为15cm，制备得到定向的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维，真空干燥，将聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴纤维在-20°C环境下固定并用冰冻切片包埋剂包埋，再将包埋的聚乙二醇/聚己内酯纳米同轴纤维在-70°C下冷冻5min，通过冰冻切片机在-20°C环境下进行冰冻切割。将冰冻切割后的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维立即混悬于蒸馏水中，然后离心15min分离聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维;再抽滤洗涤三遍，将得到的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维冷冻干燥，灭菌，备用。
[0013]步骤二:纳米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v%硝酸钙溶液和6.58w/v%的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH=11，然后向混合溶液中加入4?8g乙二胺四乙酸并在180°C条件下水热6小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用。
[0014]步骤三:微米羟基磷灰石的制备，将硝酸钙和磷酸氢二铵分别溶于蒸馏水中配成质量体积比分别为11.8w/v%硝酸钙溶液和6.58w/v%的磷酸氢二铵溶液，将硝酸钙溶液与磷酸氢二铵溶液在搅拌下混合均匀并加入氨水调节至PH=11，然后向混合溶液中加入6?9g乙二胺四乙酸二钠并在180°C条件下水热10小时，然后抽滤、清洗、烘干，灭菌，备用。
[0015]步骤四:软骨组织支架层的构建，无菌条件下，将步骤一得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维以及生长因子和软骨细胞悬浮液依次均匀地分散于接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与Ν-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用。
[0016]步骤五:软骨组织钙化层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、微米羟基磷灰石和软骨肥大细胞悬浮液均匀地分散于接枝了 RGD的硫酸肝素蛋白聚糖、氧化海藻酸钠与Ν-琥珀酰壳聚糖复合形成的溶胶基体中，备用。
[0017]步骤六:多孔的细胞隔断膜的构建，将质量比为20:1的聚乙二醇:聚ε_己内酯溶于体积比为1:9的Ν，Ν-二甲基甲酰胺:二氯甲烷混合溶剂中，配成质量分数为20%的聚合物溶液，流速设置为0.5mL/h，外加直流高电压为15kV，以转速为200r/min滚筒作为接收器，针头和接收装置的距离为15cm，制备得到一层纤维膜，真空干燥，灭菌，备用。
[0018]步骤七:骨组织支架层的构建，无菌条件下，将上述步骤得到的且已灭菌的载生长因子的聚乙二醇/聚ε-己内酯纳米同轴短纤维、纳米羟基磷灰石和成骨细胞悬浮液均匀地分散于接枝了 RGD的氧化海