专利名称：一种组织工程骨软骨支架及其制备方法
技术领域：
本发明属于软骨组织修复和组织工程领域。本发明提供了一种制备组织工程骨软 骨支架的方法，以及用该方法制备的组织工程骨软骨支架。具体而言，本发明利用松质骨为 原料，利用分层脱钙技术，制备组织工程骨软骨支架，制得的组织工程骨软骨支架可用于构 建骨软骨复合体。
背景技术：
关节软骨的损伤及病变是常见疾患，且难以自身修复。组织工程软骨是最有希望 的修复方法。但目前关节软骨组织工程研究中存在以下问题亟待解决(1)修复关节软骨 的同时往往还需修复软骨下骨。临床上单纯关节软骨的损伤比较少见，更多的是伴随软骨 下骨的病变，包括创伤引起的软骨下骨的缺损，骨软骨炎病变中软骨下骨的坏死，软骨退变 后软骨下骨的硬化、脂肪变等。因此在多数情况下，修复软骨的同时还需修复软骨下骨。(2) 组织工程关节软骨产品的固定问题未能有效解决。组织工程软骨的即时固定非常重要，如 果不能很好的固定，在关节应力(特别是剪力)的作用下，移植组织和早期修复组织与软骨 下骨出现相对位移，造成再生组织与周围正常软骨、软骨下骨交界区的应力集中，导致再生 软骨交界区整合不良，另外过度的剪切应力也可能会影响修复组织的质量。因此，需要即时 固定组织工程关节软骨，保护组织工程关节软骨免受有害应力，防止其出现脱落、撕裂。(3) 现有的组织工程软骨存在生物力学缺陷。大量研究表明，虽然以天然生物材料(如胶原、透 明质酸、藻酸、纤维蛋白胶等)为支架的工程软骨，修复效果优于化学合成支架，但是多数 天然材料支架生物力学性能差，不能提供工程软骨移植后的即时应力支撑，造成移植组织 的有害应力损害和周围软骨的异常应力集中，影响修复效果，引起周围软骨的退变。这一点 在修复负重区软骨缺损时尤为明显，这也是交界区整合不良的主要原因之一。(4)组织工程 软骨与软骨下骨间的整合较差。上述这些问题都会导致再生组织与周围软骨和软骨下骨的 交界区整合不良。随着软骨组织工程研究的深入，上述问题逐渐被人们重视。由于骨愈合的速度比 关节软骨要容易得多，愈合的质量也好，因此，如果能构建一体化的工程骨软骨，早期依靠 骨内支架提供稳定性，从而解决工程软骨的固定问题，骨愈合后依靠软骨下骨的牢固愈合， 提供并保持其上面再生软骨的力学稳定性，获得更好的交界区整合，防止远期退变；而且结 合Mosaicplasty技术(关节骨软骨移植技术，用取自自体或异体的多个骨软骨塞，移植到 关节软骨缺损或病变区，以修复关节软骨)，则既有利于关节镜下操作，又可以获得更大面 积的修复。因此研究能同时修复关节软骨和软骨下骨的一体化的组织工程——骨软骨组织 工程，是软骨组织工程研究发展的必然趋势，也是目前研究的重点。目前的组织工程骨软骨的支架一般由上、下两层组成，上层为软骨支架，下层为骨支架。其双层支架构建方法主要是两类，下层一般为适于骨组织工程的支架材料如生物玻 璃、硫酸钙、羟基磷灰石、聚乳酸/羟基乙酸类或复合材料如聚醚醚酮/羟基磷灰石、胶原、 羟基磷灰石等，上层软骨支架材料一类是凝胶类，如藻酸钙凝胶、纤维蛋白胶、透明质酸凝胶等，或符合天然材料如胶原/壳聚糖等，利用渗透作用与下层支架进行粘接，或利用冷冻 干燥法将上层软骨支架材料成分固定在下层成骨支架上；另一类表层支架则为聚乳酸/羟 基乙酸类，通过溶媒熔接或缝合的方法与下层支架连接。还有一类是利用胶原、壳聚糖、羟 基磷灰石等材料，通过三维打印的方式合成梯度材料，形成所谓功能性界面。以上述天然凝胶样材料为上层软骨支架的复合骨软骨支架存在以下问题①上层 材料力学性能差；②界面之间有力学缺陷，容易撕脱，抗剪力能力差；③凝胶类支架植入体 内后吸水变形，重新变成了凝胶样，软骨层力学性能进一步减弱；④操作相对复杂；⑤下层 羟基磷灰石降解慢，影响与周围骨的愈合。上层为聚乳酸/羟基乙酸类物质的复合支架，由于聚乳酸类等化学合成材料降解 易导致酸性产物堆积，引起关节炎症反应，且其在生产过程中可能出现毒性有机物的残留， 由于滑膜关节的代谢缓慢，因此此类材料可能并不适于用于关节软骨组织工程支架。利用复合材料三维打印形成的骨软骨复合支架，形成的是梯度支架，即从软骨层 逐渐过渡到成骨层，软骨层可能含有一定的钙离子，会影响软骨形成，甚至导致软骨钙化， 而且上层准确添加能形成软骨的种子细胞也比较困难，即使形成材料的骨_软骨界面，也 很难形成软骨支架/软骨种子细胞_骨支架/骨种子细胞的生物界面。理想的骨软骨组织工程支架应该满足下列要求①一体化，骨与软骨界面没有明 显力学缺陷；②力学仿生，上层构建的工程软骨其力学性能应接近正常关节软骨，下层则应 与软骨下骨的机械强度接近，有较强的支撑强度；③上下孔径不一致，软骨层孔径小，乏氧， 利于成软骨，下层孔径大，利于血管长入；④上层能促进软骨生成，下层能促进骨生成(骨 传导、骨诱导)；⑤支架内部，特别是软骨支架内，细胞分布均勻，能提供良好的营养，及时 带走代谢产物；⑥材料易于获得，制作简便，便于临床操作。近年来的大量研究证实，脱钙骨基质(DBM)是较好的软骨组织工程的支架材料。 其优越性在于①DBM是细胞外基质，主要成分是I型胶原；②具有天然孔隙结构，孔隙大 小为100um-800um，交通性好，提供了足够的内表面积和空间，利于细胞吸附、增殖、分泌的 细胞外基质沉积、营养物质和代谢产物交换，为组织工程的种子细胞提供较为良好的生长 环境并利于种子细胞的接种；③制备过程中除去了骨形成蛋白(BMP)之外的非胶原性蛋白 和有阻滞作用的脂类，抗原性显著降低，BMP的纯度也相应提高；④具有良好的软骨诱导活 性。DBM中含有的BMP，有较强的软骨诱导活性，在关节特定的微环境条件下，可促进软骨 祖细胞聚集及向软骨细胞分化，促进关节软骨细胞的生长和特异性细胞外基质合成。⑤降 解时间合理DBM在体内4周时部分降解，8-12周时完全降解，软骨形成需6-8周时间，此 时DBM已趋于大部或全部吸收，与软骨形成几乎同步，不影响新的软骨组织形成；⑥力学强 度合适松质骨以最合理、最节约的材料，获得最大的力学支撑。因此DBM这种天然交联的 I型胶原，较之合成的胶原、透明质酸或者藻酸等生物材料，有更好的力学支撑强度，而力学 支撑强度对关节软骨组织工程材料是非常重要的性能指标。应用脱钙骨基质作为软骨组织工程支架的研究和专利较多，但都是仅用于软骨组 织工程，植入体内仍然存在前述的固定问题。因此本发明设计了一种新的思路，即通过松质 骨分层脱钙技术，制备出完全一体化的组织工程骨软骨支架。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于构建骨软骨复合体的一体化的组织工程骨软骨支架。一个方面，本发明提供了一种制备组织工程骨软骨支架的方法。具体而言，本发明 提供了一种通过对松质骨柱分层脱钙，制备组织工程骨软骨支架的方法，该方法包括下列 步骤1)以动物(例如，牛)骨或者深低温冷冻人骨(例如，优选为股骨髁)为原料制备 所述松质骨柱；2)将步骤1)制得的松质骨柱进行分层脱钙，得到上层完全脱钙，下层仅表面脱钙 的组织工程骨软骨支架。在本发明所述方法中，其中所述的动物骨优选从市场采购的新鲜动物骨。本发明中，制备松质骨柱的方法是在常规方法基础上略作改进，简而言之为，取新 鲜动物骨或者深低温冷冻人骨，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片，然后 将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。然后 用0. 4-4cm直径环钻，将上述处理过的动物骨制成直径为0. 4-4cm的松质骨柱。本发明中，所述的分层脱钙技术是指，将制备得到的松质骨柱按所需比例划分为 上、下两部分，下面的部分用石蜡包埋，然后将该松质骨柱整体置于EDTA溶液中脱钙，然后 以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周，再冷冻干燥。该技术中，经脱钙处理 后，上层完全脱钙，下层由于在脱钙过程中有石蜡包埋保护，因此仅表面脱钙。其中所述所 需比例通常为1 1 1 2，优选为1 2，即石蜡包埋的下层(即不完全脱钙部分)的 长度占松质骨柱全长的2/3，上面不包埋部分(即完全脱钙部分)占松质骨柱全长的1/3。在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供了一种制备对松质骨柱分层脱钙制 备组织工程骨软骨支架的方法，该方法包括下列步骤1)采购新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片后，将 骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。然后用 4mm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为4mm的松质骨柱。2)将松质骨柱下2/3部分用石蜡包埋。将所述松质骨柱整体置于10% (w/v)EDTA 溶液中脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再用冷冻 干燥机按说明书操作冷冻干燥，即得本发明所述的分层脱钙组织工程骨软骨支架。另一方面，本发明提供了一种一体化的组织工程骨软骨支架，其可用于构建骨软 骨复合体。本发明所述的组织工程骨软骨支架是通过对松质骨分层脱钙制备而成，是一种以 松质骨为主体的组织工程支架。本发明所述组织工程骨软骨支架由于采用了基于松质骨的 分层脱钙技术，因此该组织工程骨软骨支架上层完全脱钙，可作为工程软骨支架或工程软 骨支架的框架部分；下层表面脱钙，可作为工程骨支架或骨形成材料，同时起到工程软骨的 固定支点的作用。因此，本发明所述的组织工程骨软骨支架可构建组织工程软骨或组织工 程骨软骨，用于软骨及骨软骨修复。本发明的优点在于1.本发明的组织工程骨软骨支架完全由松质骨制成，是纯天然生物材料。
2.本发明的组织工程骨软骨支架支架经过高压冲洗、脱脂、脱钙(或表面脱钙)以 及冷冻干燥等处理，除去了骨髓、骨小梁中的血管内皮组织以及骨陷窝内的骨细胞等主要 抗原，较目前使用的同种异体冷冻干燥骨更进一步降低了材料的抗原性。3.采用分层脱钙技术，支架上半部分完全脱钙成为脱钙骨基质，较其他天然材料 有更好的柔韧性及力学性能(例如，有较好的支撑力)，是很好的组织工程软骨支架，结合 凝胶类物质可达到近似关节软骨的力学性能。支架下半部分仅表面脱钙，有利于成骨，且便 于移植时嵌入受区。4.支架完全一体化，本发明所述的组织工程骨软骨支架是由一个松质骨柱整体制 作而成，因此与现有技术中由不同材料上下两部分拼接而成的支架相比，虽然上下层界面 良好，但上层支架却具有非常好的抗拉伸和抗剪切性能。5.在本发明中，所述组织工程骨软骨支架经过了高压冲洗、脱脂、以及酸性脱钙处 理，这些化学试剂能够杀灭病原菌，可有效防止疾病传播。6.本发明所述组织工程骨软骨支架无需进行额外固定等操作，因而便于在关节镜 下使用，结合Mosaicplasty技术，可以修复更大面积的软骨缺损，因此有着非常好的临床 应用前景。
图1图示的是浸泡于PBS中的分层脱钙牛松质骨支架实物。图2图示的是分层脱钙组织工程骨软骨支架树脂包埋硬组织切片HE染色大体显 微镜下拍摄的图片，如图所示，支架的上1/3部分(即一指向部分)及支架下2/3部分(即 =>指向部分)的外周表面染浅红色，表明该区域已完全脱钙脱细胞；支架的下2/3部分 的中心区域染紫蓝色，表明该区域未脱钙。图3图示的是分层脱钙组织工程骨软骨支架树脂包埋硬组织切片Masson三色法 染色大体显微镜下拍摄的图片，如图所示，支架的上1/3部分(即一指向部分)及支架下 2/3部分(即=>指向部分)的外周表面染深红色，表明该区域已完全脱钙脱细胞；支架 的下2/3部分的中心区域染亮绿，表明该区域未脱钙。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅 用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科 技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一 专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例实施例1用新鲜牛股骨髁为原料制备组织工程骨软骨支架从市场采购新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片 后，将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。 然后用4mm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为4mm的松质骨柱。将松质骨柱 下2/3部分用石蜡包埋。将所述松质骨柱整体置于10% (w/v)EDTA溶液中脱钙2周，然后 以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再用冷冻干燥机按说明书操作冷冻干燥，即得本发明所述的分层脱钙组织工程骨软骨支架。实施例2用新鲜牛股骨髁为原料制备组织工程骨软骨支架从市场采购新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片 后，将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。 然后用Icm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为Icm的松质骨柱。将松质骨柱 下2/3部分用石蜡包埋。将下2/3部分包埋石蜡后的松质骨柱置于10% (w/v)EDTA溶液中 脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再冷冻干燥，。实施例3用新鲜牛股骨髁为原料制备组织工程骨软骨支架从市场采购新鲜牛股骨髁，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨片 后，将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风干。 然后用2cm直径环钻，将上述处理过的牛股骨髁制成直径为2cm的松质骨柱。将松质骨柱 下2/3部分用石蜡包埋。将下2/3部分包埋石蜡后的松质骨柱置于10% (w/v)EDTA溶液中 脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周以上，再冷冻干燥。实施例4用深低温冷冻人股骨髁为原料制备组织工程骨软骨支架取深低温冷冻人股骨髁(解放军总医院骨库提供)，剔除其上附着的肌肉及韧带 组织，锯成2cm厚的骨片，高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚 脱脂，风干，Icm直径环钻制备成Icm直径的松质骨柱，将松质骨柱下2/3以石蜡包埋，放入 10% (w/v)EDTA溶液中脱钙2周，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周 以上，再冷冻干燥。实施例5HE染色鉴定组织工程骨软骨支架的脱钙效果将实施例1-4中制得的组织工程骨软骨支架分别进行树脂包埋，硬组织切片，HE 染色后，置于大体显微镜下拍照观察，如图2所示。结果显示支架的上层(即支架的上1/3 部分)支架的下层(即支架的下2/3石蜡包埋部分)的外周染浅红色，支架的下层(即支 架的下2/3石蜡包埋部分)的中央区域染紫蓝色，上、下层之间的界面非常清晰。由此可见，通过本发明所述的分层脱钙处理，制得的组织工程骨软骨支架的上层 (即上1/3部分)脱钙、脱细胞完全，支架的下层(即下1/3石蜡包埋部分)仅表面脱钙，中 心区域未脱钙。实施例6MaSSOn三色法染色鉴定组织工程骨软骨支架的脱钙效果将实施例1-4中制得的组织工程骨软骨支架分别进行树脂包埋，硬组织切片，Masson三色法染色后，置于大体显微镜下拍照观察，如图3所示。结果显示支架的上层 (即支架的上1/3部分)支架的下层(即支架的下2/3石蜡包埋部分)的外周染深红色，支 架的下层(即支架的下2/3石蜡包埋部分)的中央区域染亮绿色，上、下层之间的界面非常 清晰。由此可见，通过本发明所述的分层脱钙处理，制得的组织工程骨软骨支架的上层 (即上1/3部分)脱钙、脱细胞完全，支架的下层(即下1/3石蜡包埋部分)仅表面脱钙，中 心区域未脱钙。
权利要求
一种用于软骨及骨软骨修复的一体化的组织工程骨软骨支架，其特征在于该组织工程骨软骨支架是通过对松质骨柱分层脱钙制备而成，上层完全脱钙，是工程软骨支架或工程软骨支架的框架部分；下层表面脱钙，是工程骨支架或骨形成材料，同时起工程软骨的固定支点的作用。
2.权利要求1所述的组织工程骨软骨支架，其中所述的完全脱钙的上层和仅表面脱钙 的下层长度之比为1 1 1 2，优选为1 2。
3.一种制备组织工程骨软骨支架的方法，该方法包括1)以动物骨或者深低温冷冻人骨为原料制备松质骨柱；2)将步骤1)制得的松质骨柱进行分层脱钙，得到上层完全脱钙，下层仅表面脱钙的组 织工程骨软骨支架。
4.权利要求3所述的制备组织工程骨软骨支架的方法，其中所述的制备松质骨柱的 方法为取动物骨或者深低温冷冻人骨，剔除其上附着的肌肉及韧带组织，锯成2cm厚的骨 片，然后将骨片用高压水枪三蒸水冲洗洗去骨髓，剪除骨皮质，无水乙醇脱水，乙醚脱脂，风 干后，用环钻动物骨制成直径为0. 4-4cm的松质骨柱。
5.权利要求3或4所述的制备组织工程骨软骨支架的方法，其中所述的动物骨为新鲜 的牛骨。
6.权利要求3至5中任一项所述的制备组织工程骨软骨支架的方法，其中所述的分层 脱钙为将制备得到的松质骨柱按所需比例划分为上、下两部分，下面的部分用石蜡包埋， 然后将该松质骨柱整体置于EDTA溶液中脱钙，然后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓 冲液浸泡1周，再冷冻干燥。
7.权利要求3至5中任一项所述的制备组织工程骨软骨支架的方法，其中所述的所需 比例为1 1 1 2，优选为1 2。
8.一种用于制备组织工程骨软骨支架的分层脱钙方法，其特征在于，将松质骨柱划分 为上、下两部分，下面的部分用石蜡包埋，然后将该松质骨柱整体置于EDTA溶液中脱钙，然 后以二甲苯和梯度酒精去除石蜡，PBS缓冲液浸泡1周，再冷冻干燥。
全文摘要
本发明属于软骨组织修复和组织工程领域。本发明提供了一种组织工程骨软骨支架及其制备方法。具体而言，将异体或异种松质骨，去骨髓、脱脂、制得实验或临床所需直径的松质骨柱，然后通过分层脱钙，得到上层完全脱钙、下层仅表面脱钙的组织工程骨软骨支架。支架上层作为组织工程软骨支架或工程软骨支架的框架部分，下层作为骨形成支架、工程骨支架和工程软骨的固定支点，可用于构建一体化的组织工程骨软骨，或直接移植用于软骨或骨软骨修复。与现有组织工程骨软骨支架相比，具有一体化(无界面力学缺陷)、孔隙结构及组织相容性良好的优点，且有较好的抗压、抗拉伸和抗剪切性能，便于关节镜下微创手术操作。
文档编号A61L27/36GK101822851SQ201010107478
公开日2010年9月8日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者余方圆, 刘海容, 马远征, 黄利虹 申请人:余方圆