一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架及其制备方法，属于骨组织工程支架制备领域。

背景技术：

骨损伤疾病是在临床医学中较为普遍的损伤。随着组织工程学的发展，改善了传统骨修复手段所存在的弊端。其中，支架材料在骨组织工程领域中具有相对重要的地位，利用三维支架为细胞的生长、繁殖和骨骼组织的修复提供了良好的根本和条件。单纯的一种物质并没有办法满足组织工程对支架材料的需求，因此就需要将具有多元特性的不同材料进行复合，通过将这些材料的特性进行相互混合形成全新的、能够满足实际应用的复合材料，这也是当前支架材料研究中的热点。

随着组织工程领域的飞速发展，羟基磷灰石是现如今被认为最具潜力和有医学应用可能性的骨组织代替材料，但由于缺乏抗疲劳性能与生物活性不足等因素，应用有一定的限制。

丝素是一种源于蚕丝的天然高分子材料，随着对其独特氨基酸组成及结晶结构等理化特性研究的深入，尤其是近年来蚕丝多用途开发向高新技术的渗透，国内外对丝素的应用正从传统的纺织领域积极向化妆品、食品等领域扩展，在生物医学领域的探索，如利用丝素蛋白来制造药物缓释剂、生物传感器、隐形眼镜及皮肤、血管等人工器官等，受到广泛关注，已取得了一系列的基础研究成果，显示了巨大的应用潜力，可是未见有将其用于骨支架的报道。

将丝素蛋白与羟基磷灰石机械混合形成的复合支架已有报道，但所用的丝素蛋白与羟基磷灰石机械混合形成的复合材料是通过粒滤、发泡、冷冻干燥等方法制备而成，该复合材料存在结构单一，孔径不均等技术问题，因此用该复合材料制备复合支架存在很大问题，包括支架形状结构难以控制、支架孔隙连通率低、造孔材料难以清除等。

而本发明首先由原位矿化过程在丝素蛋白分子上沉积羟基磷灰石获得有机无机复合的均一粉体材料，接着利用三维打印技术有效成型该复合的均一粉体形成具有可定制形状结构的支架，从而满足骨组织工程支架的要求。

综上，三维打印技术可以通过改变切层的网格填充方式和孔隙大小来调节支架材料的孔隙率和孔结构，制备出具有高孔隙率、较好的孔连通性，可控的力学性能的骨修复复合材料支架，从而有利于成骨诱导、分化，细胞黏附、迁移、增殖，创建适应成骨相关细胞生长需要的微环境。

因此，与现有技术的同类产品进行对比，本发明利用的三维打印技术能够更好的满足骨组织工程支架“一结构，一支架”的要求。

技术实现要素：

本发明的目的之一是为了解决上述丝素蛋白与羟基磷灰石机械混合形成的复合材料存在的结构单一，孔径不均等技术问题，首先提供一种丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，该丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体具有粒径均一等特点。

本发明的目的之二是为了解决传统的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架形状结构难以控制、支架孔隙连通率低、造孔材料难以清除等技术问题，而利用上述的丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体制备一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，该具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，由于利用三维打印技术，有效地控制最终所得的复合支架的内部结构，得到具有高孔隙率、较好的孔连通性，可控的力学性能的骨修复复合材料支架，即最终所得的复合支架具有孔径可调，形貌可控，“一结构，一支架”的优点，从而提高复合支架的生物学性能，从而有利于成骨诱导、分化，细胞黏附、迁移、增殖。克服了现有技术中存在的结构问题。

本发明的技术方案

一种丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将蚕茧浸入浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

蚕茧和浓度为0.5g/l的na2co3水溶液的用量，按蚕茧：浓度为0.5g/l的na2co3水溶液为4.3g：500ml的比例计算；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将cacl2、ch3ch2oh和去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至蚕丝完全溶解，得到丝素溶液，溶解蚕丝所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

或将步骤（1）所得的蚕丝溶于9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加热，充分搅拌直至蚕丝完全溶解，然后利用透析袋（截留分子量：8000-14000）进行透析得到丝素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：9.3mol/l的libr水溶液为1g:15ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将(nh4)2hpo4溶于去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，滴加过程中通过滴加质量百分比浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为400rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400-800目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径在19-38微米之间，然后密封保存备用。

利用上述的丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体制备一种丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体复合支架，具体包括如下步骤：

（1）、在上述所得的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，搅拌均匀后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为3.0~10.0：1的计算；

所述的粘结剂为聚乙烯醇、海藻酸钠、聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚酯或泊洛沙姆的水溶液，优选为质量百分比浓度为10-15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量为146000-186000，或优选为质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液，所述的海藻酸钠的分子量为216；

或所述的粘结剂为聚己内酯溶于三氯甲烷而得的有机溶液，聚己内酯和三氯甲烷的用量，按质量比体积计算，聚己内酯：三氯甲烷为1：3的比例计算，其中聚己内酯的平均分子量为8000；

（2）、将步骤（1）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为100~1000微米，优选为400微米，启动三维打印程序，调节气压为2.5~4.0bar，打印速度为3.0~8.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为0°~180°，孔径为50~1200微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后控制温度为-90℃进行冷冻干燥，得到丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

本发明的各实施例中仅以45°~190°，孔径为400微米进行举例说明，但并不限制墨水相邻两层走向夹角为0°~180°，孔径为50~1200微米的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备；

所述的三位打印程序是通过cad、ug或solidworks等三维绘图软件绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

本发明的有益效果

本发明的一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，首先通过原位矿化过程在丝素蛋白分子上沉积羟基磷灰石，获得有机无机复合的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体，所得复合粉体材料的粒径均一，通过控制丝素蛋白、氯化钙和磷酸氢二铵在分散相中的比例，可以调控所得复合粉体的微观结构。进一步，通过三维打印技术将该粒径均一的复合粉体材料制备成具有特定结构的复合支架，因此所得的复合支架具有“一结构，一支架”的技术效果。

进一步，本发明的一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法，由于可以通过三维打印技术改变切层的网格填充方式和孔隙大小，因此可以方便的调节复合支架的孔隙率和孔结构，从而制备出具有高孔隙率、较好的孔连通性，可控的力学性能的骨修复复合材料支架，从而有利于成骨诱导、分化，细胞黏附、迁移、增殖，创建适应成骨相关细胞生长需要的微环境。

附图说明

图1a、实施例1所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架扫描电镜照片；

图1b、实施例2所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架扫描电镜照片；

图1c、实施例3所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架扫描电镜照片；

图2、实施例1所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的光学照片；

图3、实施例2所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的光学照片；

图4a、图4b、实施例6所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的光学照片。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明的实施例做详细说明，但并不限制本发明。

本发明的实施例中所用的三维打印机是第四代3-dbioplotter™(envisiontecgmbh,germany)，本发明所用的三维打印程序可由autocad、ug、solidworks等三维绘图软件绘制。

实施例1

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，得到丝素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为400rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为3.0：1的计算；

所述的粘结剂为质量百分比浓度为15%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量为146000-186000；

质量百分比浓度为15%的聚乙烯醇水溶液的配制：即将7.5g分子量为146000-186000的聚乙烯醇溶于42.5g的去离子水中，控制温度为90℃水浴加热磁力搅拌至完全溶解即得质量百分比浓度为15%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为2.5~3.0bar,打印速度为4.0~6.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为60°，孔径为800微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后进行冷冻干燥，得到具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过solidworks制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

采用feiquanta450型场发射扫描电镜，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行扫描，所得的sem图如图1a所示，从图1a中可以看出通过三维打印技术制备的复合支架层与层之间，线与线之间均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于细胞的黏附、迁移、增殖。

采用华为手机加外置鱼眼镜头，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行拍摄，所得的光学照片如图2所示，从图2中可以看出支架结构完好，线与线之间间距均匀，孔径分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架结构完整。

实施例2

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，得到丝素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为800rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后控制，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为5.0：1的计算；

所述的粘结剂为质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量为146000-186000；

质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即将5g分子量为146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去离子水中，控制温度为90℃水浴加热磁力搅拌至完全溶解即得质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为2.5~3.5bar,打印速度为3.0~5.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为60°，孔径为800微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后进行冷冻干燥，得到具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过solidworks制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

采用feiquanta450型场发射扫描电镜，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行扫描，所得的sem图如图1b所示，从图1b中可以看出通过三维打印技术制备的复合支架层与层之间，线与线之间均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于细胞的黏附、迁移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率存在差异。

采用华为手机加外置鱼眼镜头，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行拍摄，所得的光学照片如图3所示，从图3中可以看出支架结构完好，线与线之间间距均匀，层与层呈90度堆叠孔径分布良好。由此表明了支架孔隙率高，支架结构完整，利用三维打印技术能够灵活的控制打印参数。

实施例3

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，得到丝素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为800rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为10.0：1的计算；

所述的粘结剂为质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液，所述的聚乙烯醇的分子量为146000-186000；

质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液的配制：即将5g分子量为146000-186000的聚乙烯醇溶于45g的去离子水中，控制温度为90℃水浴加热磁力搅拌至完全溶解即得质量百分比浓度为10%的聚乙烯醇水溶液；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为3.5~4.0bar,打印速度为4.0~6.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为60°，孔径为800微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后冷冻干燥，得到具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过solidworks制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

采用feiquanta450型场发射扫描电镜，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行扫描，所得的sem图如图1c所示，从图1c中可以看出通过三维打印技术制备的复合支架层与层之间，线与线之间均存在一定的空隙，具有高孔隙率，支架表面具有一定的粗糙度有利于细胞的黏附、迁移、增殖，且不同比例的支架表面粗糙度、孔隙率均存在差异。

实施例4

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，得到丝素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为800rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为5.0：1的计算；

所述的粘结剂为质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液，所述的海藻酸钠的分子量为216；

质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液的配制：即将2g分子量为216的海藻酸钠溶于18g的去离子水中，控制温度为90℃水浴加热磁力搅拌至完全溶解即得质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为2.5~3.0bar,打印速度为6.0~8.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为45°，孔径为600微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后进行冷冻干燥，得到丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过solidworks制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

实施例5

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

首先，将11.10gcacl2、9.20gch3ch2oh和14.4g去离子水按摩尔比计算，即cacl2：ch3ch2oh：去离子水为1：2：8的比例进行混合均匀，得到三元混合溶液；

然后将步骤（1）所得的蚕丝全部溶于上述所得的三元混合溶液中，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，得到丝素溶液；

溶解所用的三元混合溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：三元混合溶液为1g:8ml的比例计算；

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为800rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h搅拌均匀后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为5.0：1的计算；

所述的粘结剂为1g聚己内酯溶于3ml三氯甲烷而得的有机溶液，聚己内酯和三氯甲烷的用量，按质量比体积计算，聚己内酯：三氯甲烷为1：3的比例计算，其中聚己内酯的平均分子量为8000；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为2.8~3.5bar,打印速度为3.0~5.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为90°，孔径为800微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，然后进行冷冻干燥，得到具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过ug制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

实施例6

一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，通过包括如下步骤的方法制备而成：

（1）、蚕茧去除蚕蛹，清理蚕茧表面杂物

将4.3g蚕茧浸入500ml的浓度为0.5g/l的na2co3水溶液中，100℃水煮60min进行脱胶，取出脱胶后所得的蚕丝，用去离子水洗涤3次，然后60℃真空干燥24h，得到蚕丝，室温下干燥保存备用；

（2）、蚕丝溶液的制备

浓度为9.3mol/l的libr水溶液的配制：即取40glibr溶于50ml去离子水，得到浓度为9.3mol/l的libr水溶液；

将步骤（1）所得的蚕丝溶于上述所得的浓度为9.3mol/l的libr水溶液，75℃水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，然后利用透析袋（截留分子量：8000-14000）进行透析，得到丝素溶液；

溶解所用的9.3mol/l的libr水溶液的量，按制备蚕丝所用的蚕茧：9.3mol/l的libr水溶液为1g:15ml的比例计算

（3）、(nh4)2hpo4水溶液的配置

首先将7.92g(nh4)2hpo4溶于120ml去离子水中，得到浓度为0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液；

然后，采用注射泵控制滴加速率为0.5ml/min的速率将上述所得的0.5mol/l的(nh4)2hpo4水溶液逐滴加入步骤（2）所得丝素溶液中，滴加过程控制转速为800rpm，温度为75℃，过程中通过滴加浓度为26%的氨水维持丝素溶液的ph为9.5-10.5，待(nh4)2hpo4水溶液滴加完，继续控制搅拌转速800rpm持续搅拌24h得到乳浊液；

上述滴加(nh4)2hpo4水溶液的量，按(nh4)2hpo4水溶液中的(nh4)2hpo4：制备丝素溶液所用的蚕丝的质量比计算，即(nh4)2hpo4：蚕丝为1.85：1；

（4）、将步骤（3）所得的乳浊液控制转速为800rpm进行离心，所得的沉淀用去离子水洗涤4次后，控制温度为-90℃进行冷冻干燥，过400目筛子，得到丝素蛋白/羟基磷灰石白色复合粉体，其粒径均一，均小于38微米，然后密封保存备用；

（5）、在步骤（4）得到的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中加入粘结剂，控制搅拌转速为500rpm搅拌2h后得到打印墨水，密封保存备用；

粘结剂的加入量，按丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体：粘结剂的质量比为10.0：1的计算；

所述的粘结剂为质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液，所述的海藻酸钠的分子量为216；

质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液的配制：即将2g分子量为216的海藻酸钠溶于18g的去离子水中，控制温度为90℃水浴加热磁力搅拌至完全溶解即得质量百分比浓度为10%的海藻酸钠水溶液；

（6）、将步骤（5）得到的打印墨水装进三维打印机的料筒中，针头直径为400微米；启动三维打印程序，调节气压为3.0~3.5bar，打印速度为6.0~8.0mm/s，墨水相邻两层走向夹角为60°，孔径为800微米，将打印墨水以层层堆积的方式沉积在载物平台的玻璃培养皿中，冷冻干燥，得到具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架；

所述的三位打印程序是通过autocad制图技术绘制而成的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架图形。

采用华为手机加外置鱼眼镜头，对上述所得的具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架进行拍摄，所得的光学照片如图4a、4b所示，从图4a、4b中可以看出支架结构完好，线与线之间间距均匀，层与层呈90度堆叠，孔径分布良好，支架高度、形状可调。由此表明了支架孔隙率高，支架结构完整，利用三维打印技术能够灵活的控制打印参数。

综上所述，本发明提供的一种具有三维结构的丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备方法，首先通过仿生矿化，制备出粒径均一的丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体，该丝素蛋白在丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉体中的含量，按质量百分比计算可达10%-80%，进一步，利用三维打印技术，可制备出具有高孔隙率、较好的孔连通性，可控的力学性能的骨修复复合材料支架，从而有利于成骨诱导、分化，细胞黏附、迁移、增殖。通过三维打印技术，可以灵活调节打印针头直径、打印气压、打印速度、支架孔径和结构等参数，能够满足骨组织工程支架“一结构，一支架”的要求。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，例如：基本参数的改变（针头直径、打印气压、打印速度等）、打印墨水的配比、粘结剂的改变、粉体和支架的处理方法等，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。