一种复合多层多孔支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种复合多层多孔支架及其制备方法，属于生物医用人工骨移植材料技术运用领域。

背景技术：

组织工程最早的研究材料是天然材料，随着时间的流逝，科学家进一步研究了天然材料和合成材料的复合，以及现在合成材料与生物材料的杂化交联等，同时，人们还合成了类天然材料，即仿生材料，但是这些材料由于种种缺陷而不能满足组织工程的需要。材料的降解率、生物相容性、理化性能、毒性、生物活性以及支架制备方法和工艺，都要满足特定的组织要求，尤其是生物相容性更是材料选择的关键，因为组织工程支架使细胞黏附与增殖的外环境。

魔芋葡甘聚糖kgm是一种天然的带有短支链的高分子多糖，其结构式如下所示：

魔芋葡甘聚糖拥有良好的溶胶凝胶性能，可形成热不可逆（热稳定）凝胶，有较好的成型性能，具有较好的力学和体内外的降解性能和生物相容性，原因主要有以下几个方面：（1）魔芋葡甘聚糖是魔芋块茎中所含的储备性多糖，一般认为由β-d-葡萄糖和β-d-甘露糖以2：3的摩尔比，主要通过β-1，4糖苷键连接起来的高分子多糖。（2）诸多文献也已对魔芋葡甘聚糖性质进行了研究。魔芋葡甘聚糖的理化性质主要有：①流变性；②增稠性；③凝胶性；④水溶性；（3）近年来采用各种手段对其进行了改性，从而使它具有适合各种用途的新功能，从而扩大其应用范围，如魔芋葡甘聚糖kgm的脱乙酰基改性、交联改性、酯化改性、氧化改性及接枝共聚改性等都能很好地改善魔芋葡甘聚糖kgm的使用性能。

魔芋葡甘聚糖拥有良好的溶胶凝胶性能，可形成热不可逆(热稳定)凝胶，有较好的成型性能，具有较好的力学和体内外的降解性能和生物相容性，原因主要有以下几个方面：(1)魔芋葡甘聚糖是魔芋块茎中所含的储备性多糖，一般认为由β-d-葡萄糖和β-d-甘露糖以2：3的摩尔比，主要通过β-1，4糖苷键连接起来的高分子多糖。(2)诸多文献也已对魔芋葡甘聚糖性质进行了研究。魔芋葡甘聚糖的理化性质主要有：①流变性；②增稠性；③凝胶性；④水溶性；(3)近年来采用各种手段对其进行了改性，从而使它具有适合各种用途的新功能，从而扩大其应用范围，如魔芋葡甘聚糖kgm的脱乙酰基改性、交联改性、酯化改性、氧化改性及接枝共聚改性等都能很好地改善魔芋葡甘聚糖kgm的使用性能。

聚己内酯pcl是一种可完全生物降解并且具有良好生物相容性的脂肪族聚酯，而且其降解产物不容易引起炎症反应，是一种合成的热塑性半结晶聚合物，柔性链段的聚己内酯比刚性链段的聚碳酸酯结晶性能强，容易结晶，具有生物活性、生物相容性、生物降解性、渗透性等优点，pcl在室温下具有良好的柔韧性、加工性和较好的热稳定性，可以作为一种良好的软骨组织工程替代材料。而细胞在其上的繁殖增长、支架的降解率和力学性能是组织工程支架需要同时满足的三大要求，选区激光烧结、熔融沉积成型、静电纺丝、3d打印等技术制备的聚己内酯组织工程支架尽管与细胞外基质结构相似有利于细胞的粘附与生长，但其力学性能较差，很难作为组织工程的承重材料。

聚乳酸pla是一种具有优良的生物相容性、无毒和可生物降解的聚合物，具有较好的化学惰性、易加工性及良好的生物相容性，是最有前途的可生物降解高分子材料之一，早在70年代，聚乳酸在人体内的降解性和降解产物的高度安全性得到确认，它作为一种新型可生物降解的应用高分子材料开始备受关注。

聚醚醚酮peek是一种全芳香半结晶高聚物，具有多种优良的综合性能：对氧高度稳定，具有坚韧、高强度、高刚性和耐蠕变的特点，以及优越的抗疲劳性、生物相容性，而且溶胀率较低，是最佳的骨关节材料。

聚乙二醇peg是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合得到的一类分子量较低的水溶性聚醚，作为一种两亲性聚合物，具有良好的生物相容性，而且具有无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，不会积累在体内，在生物医药领域具有广泛的应用前景。

透明质酸ha是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体各部位，皮肤也含有大量的透明质酸。在机体内，透明质酸是一种多功能基质，显示出多种重要的生理功能，例如调节蛋白质，协助水电解质的扩散及运转，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸由于其具有独特理化性质和生理功能，已经在医学、生物材料方面得到了广泛应用。

羟基磷灰石是目前应用最广泛的一种良好的生物活性、生物相容性、可降解性、无毒性、骨传导性等优良特性生物活性材料，其化学式为ca10(po4)6(oh)2，与人体的骨骼和牙齿无机成分的化学组成和结构类似，可以加工成三维孔隙结构，有利于成骨细胞的黏附、生长，诱导骨的成长，在体内能够逐步降解为钙磷，产生游离的ca²⁺、po4^3-，为身体带入一定量的活性成分，钙磷沉积可促进骨的生长。但它的缺点是力学强度不够，质脆，韧度不够。相对于羟基磷灰石粉体而言，羟基磷灰石晶须具有更高的的断裂韧性和抗弯抗压能力，在制备过程中不易断裂。这主要是由于材料可依靠晶须的桥接、裂纹偏转和拔出效应来吸收能量，消除裂纹尖端集中的应力；而材料受力时，通过负荷传递使应力作用于晶须，从而降低周围的基底材料所承受的应力，从而达到提高材料力学性能的目的。

技术实现要素：

本发明提供一种复合多层多孔支架，支架具有多层结构，且各层降解速率不同，由魔芋葡甘聚糖、人工合成高分子和羟基磷灰石晶须复合而成。

所述人工合成高分子为聚己内酯、聚乳酸、聚醚醚酮、聚乙二醇或透明质酸。本发明的另一目的在于提供所述复合多层多孔支架的制备方法，具体步骤如下：

(1)按照质量体积比g/ml为4-6︰400的比例，将魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)按照质量体积比g/ml为1-3︰20的比例，将人工合成高分子加入到有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器搅拌2个小时至完全混合均匀，搅拌速度为400转/分钟，得到溶液b；

(3)按照羟基磷灰石晶须占步骤(2)中人工合成高分子质量5％-15％的比例，将羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到玻璃皿中，冷冻10h，得到厚度为0.5-1.5mm的魔芋葡甘聚糖膜，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为0.5-1.5mm的溶液c成膜，冷冻10h，经过多次流延，冷冻干燥后得到一层以上魔芋葡甘聚糖膜和一层以上人工合成高分子和羟基磷灰石晶须膜组成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在交联液中交联12-24h后，取出置于蒸馏水中浸泡5-10次，每次1-2h，再冷冻干燥，最终得到魔芋葡甘聚糖/人工合成高分子/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架。

步骤(1)所述溶剂为水、乳酸和丙三醇按照体积比为400︰1.8︰1.2混合而成。

步骤(2)所述有机溶剂为甲醇与二氯甲烷按照体积比为1︰3混合的混合物。

步骤(4)所述冷冻干燥是在零下40℃的条件下进行的。

步骤(5)所述交联液为质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成。

本发明的有益效果：

(1)采用流延法制得复合多层多孔支架，其制备方法简单易操作，原料来源广泛，而且成本低廉，同时也不会破坏魔芋葡甘聚糖、聚己内酯(聚乳酸、聚醚醚酮、聚乙二醇、透明质酸)、羟基磷灰石晶须自身的优点，在软骨组织工程领域中具有很大的应用前景。

(2)所得复合多层多孔支架的降解率可调，且层与层的降解速率不同，通过改变膜的厚度、试剂的含量、孔隙率来控制降解速度。

(3)所得复合多层多孔支架植入体内后，在体内能够逐步降解为钙磷，产生游离的ca²⁺、po4^3-，为身体带入一定量的活性成分，钙磷沉积可促进骨的生长。

(4)所得复合多层多孔支架因具备较高的孔隙率，有利于细胞的黏附与增殖。

附图说明

图1是本发明实施例1魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的xrd图；

图2是本发明实施例1魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的ftir图；

图3是本发明实施例1魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的降解曲线；

图4为本发明实施例1、实施例2和实施例3复合多层多孔支架的抗压强度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、聚己内酯和羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、聚己内酯、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将5g魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将2g聚己内酯加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.3g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到直径为10cm的玻璃皿中，得到厚度为1mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为1mm的溶液c成膜，冷冻10h；经过多次流延，直至得到由8层kgm膜和7层pcl/haw膜交替流延成膜组成的厚度为15mm的kgm/pcl/haw冷冻未干燥样品，并在冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到kgm/pcl/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml的质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联18h后，取出置于蒸馏水中浸泡10次，每次1h，再冷冻干燥，最终得到kgm/pcl/haw复合多层多孔支架。

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架交联前(步骤(5)得到的多层多孔支架d)和交联后(步骤(6)最终得到kgm/pcl/haw复合多层多孔支架)的xrd分析，如图1所示，从图中可以看出2θ为21.4°和23.8°附近均出现两个明显的衍射峰，说明支架中聚己内酯的存在，在2θ为20°可以看出明显的馒头峰，表明支架中含有魔芋葡甘聚糖，另外，可以明显看到ha峰的存在，例如：各衍射峰(2θ＝25.9°，2θ＝31.7°，2θ＝45.6°)的位置与标准卡片(jcpds)相符，说明所制备的kgm/pcl/haw复合多层多孔支架中有ha的存在。

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架交联前(步骤(5)得到的多层多孔支架d)和交联后(步骤(6)最终得到kgm/pcl/haw复合多层多孔支架)的ftir分析，如图2所示，由图2可看出红外特征峰与kgm、pcl和haw完全吻合，如3440cm^-1附近的峰为-oh，2928cm^-1附近为甲基中的c-h，882cm^-1和807cm^-1附近的kgm特征吸收峰，1637cm^-1附近的吸收峰为c＝o键的特征峰，1150cm^-1和573cm^-1附近为p-ocm^-1键的吸收峰，说明最后得到的复合多层多孔支架中含有kgm、pcl和haw。

本实施例制备得到的魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架降解曲线如图3所示，本降解实验通过把样品浸泡于人体模拟体液(sbf)溶液中来评价其降解性，由图3可知复合多层多孔支架在前7天为增重过程，随着浸泡时间的增加逐渐表现为失重，分析可知增重是由于降解产物的生成，例如羟基磷灰石晶须中钙磷盐的沉积；另外一个原因为人体模拟体液中活性物质的沉积，但浸泡7-10天后，支架材料降解导致的失重大于沉积产物造成的增重，因此显示出失重的降解曲线。

如下表1为用mtt法对实施例1制备得到的kgm/pcl/haw复合多层多孔支架的细胞毒性分析的细胞增殖度(rgr)值，本实验将293t细胞(转染腺病毒e1a基因的人肾上皮细胞)作为实验细胞，依据国家标准(gb/t16886.12-2005)，检测细胞在待测材料的培养液中的增殖情况，根据国家标准(gb/t14233.2-2005)从而判定其毒性等级，细胞毒性结果表明，支架浓度在0.05-0.4g/ml时，细胞增殖度均在100-120之间，细胞毒性为0级，说明制备的魔芋葡甘聚糖/聚己内酯/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架无细胞毒性。

表1复合多层多孔支架的细胞增殖度

如图4所示，本实施例制备的kgm/pcl/haw复合多层多孔支架抗压强度高达8.65mpa，满足软骨组织要求；另外，采取称重法测出其孔隙率为82.46％，证明该支架具有较高的孔隙率。

实施例2

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、聚乳酸和羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/聚乳酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、聚乳酸、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚乳酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将4g魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将1g聚乳酸加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.05g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到直径为10cm的玻璃皿中，得到厚度为0.5mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为0.5mm的溶液c成膜，冷冻10h，冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到厚度为1mm的kgm/pla/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联12h后，取出置于蒸馏水中浸泡5次，每次2h，再冷冻干燥，最终得到kgm/pla/haw复合多层多孔支架。

如下表2为用mtt法对实施例1制备得到的kgm/pla/haw复合多层多孔支架的细胞毒性分析的细胞增殖度(rgr)值，本实验将293t细胞(转染腺病毒e1a基因的人肾上皮细胞)作为实验细胞，依据国家标准(gb/t16886.12-2005)，检测细胞在待测材料的培养液中的增殖情况，根据国家标准(gb/t14233.2-2005)从而判定其毒性等级，细胞毒性结果表明，支架浓度在0.05-0.4g/ml时，细胞增殖度均在100-120之间，细胞毒性为0级，说明制备的魔芋葡甘聚糖/聚乳酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架无细胞毒性，同时，

由图4可知该支架的抗压强度为11.25mpa，达到了软骨的强度要求。

表2复合多层多孔支架的细胞增殖度

如图4所示，最终所得支架的抗压强度为11.25mpa，达到了软骨的强度要求；采取称重法测出其孔隙率为83.15％，说明该支架具有较高的孔隙率。

实施例3

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、聚醚醚酮、羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/聚醚醚酮/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、聚醚醚酮、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚醚醚酮/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将4g魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将2g聚醚醚酮加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.2g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到玻璃皿中，得到厚度为1mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为1mm的溶液c成膜，冷冻10h；经过多次流延，直至得到6层kgm膜和4层peek/haw膜的厚度为10mm的kgm/peek/haw冷冻未干燥样品，6层kgm膜和4层peek/haw膜是先一层kgm膜，然后一层peek/haw膜，再一层kgm膜，两种膜交替叠加，最上面是两层kgm膜，样品在冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到kgm/peek/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml的质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联12h后，取出置于蒸馏水中浸泡8次，每次1.5h，再冷冻干燥，最终得到kgm/peek/haw复合多层多孔支架。

如图4所示，本实施例制备的kgm/peek/haw复合多层多孔支架由于含有较多的羟基磷灰石晶须，抗压强度高达12.37mpa，满足软骨组织要求；采取称重法测出其孔隙率为86.29％，说明该支架具有较高的孔隙率。

实施例4

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、聚乙二醇和羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/聚乙二醇/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、聚乙二醇、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/聚乙二醇/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将6g的魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将3g的聚乙二醇加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.15g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到直径为10cm的玻璃皿中，得到厚度为0.5mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为1mm的溶液c成膜，冷冻10h；经过多次流延，直至得到6层kgm膜和4层peg/haw膜的厚度为20mm的kgm/peg/haw冷冻未干燥样品，6层kgm膜和4层peg/haw膜是先一层kgm膜，然后一层peg/haw膜，再一层kgm膜，两种膜交替叠加，最上面是两层kgm膜，样品在冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到kgm/peg/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联15h后，取出置于蒸馏水中浸泡6次，每次2h，再冷冻干燥，最终得到kgm/peg/haw复合多层多孔支架。

实施例5

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、透明质酸和羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/透明质酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、透明质酸、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/透明质酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将6g魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将2g透明质酸加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.3g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到直径为10cm的玻璃皿中，得到厚度为1mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为1.5mm的溶液c成膜，冷冻10h；经过多次流延，直至得到10层kgm膜和10层ha/haw膜交替叠加的厚度为25mm的kgm/ha/haw冷冻未干燥样品，并在冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到kgm/ha/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml的质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联24h后，取出置于蒸馏水中浸泡9次，每次1h，再冷冻干燥，最终得到kgm/ha/haw复合多层多孔支架。

实施例6

本实施例一种复合多层多孔支架，由魔芋葡甘聚糖、透明质酸和羟基磷灰石晶须复合而成，魔芋葡甘聚糖/透明质酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架制备所用的化学物质材料为：魔芋葡甘聚糖、透明质酸、二氯甲烷、羟基磷灰石晶须、去离子水、丙三醇、乳酸、甲醇、质量分数25％的氨水、无水乙醇，其准备用量如下：

本实施例魔芋葡甘聚糖/透明质酸/羟基磷灰石晶须复合多层多孔支架的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将1.2ml丙三醇和1.8ml乳酸依次加入400ml去离子水中混合均匀得到溶剂，再将6g魔芋葡甘聚糖kgm加入到搅拌速度为500转/分钟的溶剂中，魔芋葡甘聚糖顺着溶剂搅拌时形成的漩涡缓慢加入，常温环境下搅拌3个小时至完全混合均匀，微波加热4min，真空脱泡，去除表面和杯壁的固化液，即得到溶液a；

(2)将3g透明质酸加入到15ml二氯甲烷和5ml甲醇混合而成的有机溶剂中，常温环境下用磁力搅拌器以400转/分钟的速度搅拌2个小时至完全混合均匀，得到溶液b；

(3)将0.45g羟基磷灰石晶须加入到步骤(2)制得的溶液b中，常温环境下搅拌2个小时，超声震荡20min，使其混合均匀，得到溶液c；

(4)取步骤(1)制得的溶液a流延到直径为10cm的玻璃皿中，得到厚度为1.5mm的魔芋葡甘聚糖kgm膜，冷冻10h，再在魔芋葡甘聚糖膜上流延厚度为1.5mm的溶液c成膜，冷冻10h；经过多次流延，直至得到10层kgm膜和10层ha/haw膜交替叠加的厚度为30mm的kgm/ha/haw冷冻未干燥样品，并在冷冻干燥机中在零下40℃的条件下冷冻干燥得到kgm/ha/haw复合而成的多层多孔支架d；

(5)将步骤(4)所得的多层多孔支架d在280ml质量分数25％的氨水与无水乙醇按照体积比1︰3混合而成的交联液中交联18h后，取出置于蒸馏水中浸泡8次，每次1.5h，再冷冻干燥，最终得到kgm/ha/haw复合多层多孔支架。