一种血管化组织工程骨及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种由成骨细胞膜片和成血管内皮细胞膜片构建的血管化组织工程骨及其制备方法。

背景技术：

严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的大块骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战,一直是人类几个世纪以来不断深入研究和探索的重要课题。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。自体骨移植是公认的骨组织修复的金标准，但是患者要经受自体组织移植手术的创伤，而且供区有限，因此,自体骨移植不能视为理想的大面积骨缺损的修复方法；异体骨移植存在免疫排斥反应、疾病传播等风险，有时甚至危及病人生命；人工骨植入容易导致异物排斥反应、感染等。因此,有必要寻找一种新的大块骨缺损的修复手段。

在此情况下，组织工程学的兴起和发展,为骨缺损的修复提供了新的可能，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望。

近年来,骨组织工程的研究取得了很大进展,应用组织工程技术在小型哺乳动物体内构建骨组织，修复小尺寸的骨缺损的方法已基本成熟，但是对于大型哺乳动物大范围或受区血供不佳的骨缺损，由于移植物早期没有独立的血液供应，营养渗透不足，骨痂形成缓慢等原因，成骨效果仍不稳定。有研究表明,决定和制约组织工程骨修复骨缺损疗效的关键是其在体内血管化的速度和程度。sahota等也认为组织工程植入物失败的主要原因在于血管化的迟滞。因此，如何建立有效的血液供应,在体内构建能及时血管化的组织工程骨,缩短骨愈合时间是目前骨组织工程研究的一个重要方向，也是制约组织工程骨大规模临床应用的关键。

目前组织工程骨的血管化策略主要包括：支架的设计开发、应用生长因子、体内埋植、体内动脉小室和整体培养系统等。尽管这些方法在一定程度解决了组织构建时的血管化问题，但均存在不足。比如，在支架的制作过程中，对材料内部的孔隙大小和相互连接进行修饰,可有利于血管网的长入，但存在炎症反应、潜在的免疫原性风险等,而且血管化速度不理想；促血管生长因子应用时存在调控问题，生长因子在体内半衰期较短,大剂量应用又有致畸可能，并且可能加速某些病理过程，如血管瘤的发生等；体内埋植和体内动脉小室均需二次手术，供体选择困难，有潜在的疾病传播风险等，限制了临床应用；整体培养系统为完善的“人造器官”，但技术难度高，实现困难。

近年，国内外研究人员通过血管内皮细胞与成骨细胞联合培养的技术方法，构建出血管化组织工程骨，即可形成骨组织又可同时血管化。但传统的“细胞－支架”策略的不足之处在于：种子细胞在种植到支架材料的过程中，有30-40％的细胞不能粘附于支架而流失，细胞附着率低、利用率差；细胞之间相互作用少，难以形成体内细胞应有的微环境，细胞支架复合物植入体内后，骨形成总是发生在支架的外周，影响成骨的大小和质量。为了解决上述问题，人们研究出细胞膜片技术。它是通过体外对细胞进行高密度培养,使细胞生长成为多层并分泌大量细胞外基质,形成由细胞和细胞外基质构成的细胞膜片。细胞膜片技术应用于组织工程中主要有三方面优势:一、膜片的形成能够减少组织构建过程中细胞的流失和损伤,提高细胞利用率；二、细胞膜片具有一定的机械强度,能够在无支架的情况下进行组织构建,避免了支架材料引起的组织相容性问题,且易于操作、价格低廉；三、丰富的细胞外基质为细胞提供适合的生长环境,并在发育过程中储存和激活生长因子,为组织的发育提供结构和功能帮助。所以，如能将成骨细胞膜片联合内皮细胞膜片，通过合适的方法构建血管化组织工程骨，预计将较成骨细胞与内皮细胞共培养更具血管化和成骨优势。

脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是存在于脂肪组织中的成体干细胞。与骨髓间充质干细胞相似，具有向成脂肪、成软骨、成骨、成肌细胞和神经源细胞等分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。与骨髓间充质干细胞相比，存在来源广泛、获取方式简单，培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，对机体创伤小等优点，有望成为组织工程更为理想的细胞来源。目前，脂肪来源间充质干细胞已广泛应用于组织再生与修复。虽然血管化组织工程骨的构建已有很多的研究，但是利用脂肪来源的成骨细胞和内皮细胞，制备具有成骨和成血管能力的双细胞复合膜片来构建血管化组织工程骨的策略却还很少有人涉及。

另外，除了细胞之外，支架材料的生物相容性和生物降解性也是影响血管化的因素。支架材料必须具有良好的三维立体多孔结构,这样血管才能爬行长入,并最终血管化,为组织工程骨内细胞长期生存提供前提条件。

目前骨组织工程支架材料包括无机材料和有机材料两大类。

有机材料在硬组织修复替代领域最早应用于骨骼，并被广泛用作骨修复材料，主要包括聚乳酸(pla)、聚乙酸(pga)、聚乙交酯-丙交酯共聚物(plga)、聚ε-己内酯(pcl)、聚酸酐、聚磷腈、聚原酸酯等。有机材料中研究较多的是聚羟基酸类(主要包括pla、pga、plga)。这一类高分子聚合物由于其良好的生物相容性已获得美国fda批准，广泛应用于医学领域。其中，plga是由聚pla和pga形成的高分子共聚物，改变pla与pga的比例，可调节plga的力学强度及其在体内的降解时间。plga具有很好的组织相容性，已被美国fda批准用于临床，是迄今应用最多的骨修复材料之一。但plga机械强度较差、降解产物略呈酸性，易引起体内炎症反应，而且由于plga表面亲水性差，分子链中缺乏活性功能基团，其生物活性稍差，使其与特定细胞相互作用变得比较困难。

用于骨组织工程支架的无机材料主要包括羟基磷灰石(ha)、磷酸三钙(tcp)以及其他种类的陶瓷材料等。这类生物陶瓷材料由于其具有良好的生物活性和生物相容性，成为广泛应用的植骨代用品。尽管其具有良好的生物相容性及一定的降解性、较高的化学稳定性和较强的骨传导及骨诱导性等优点。但是这种材料具有不易塑形、强度不足、脆性大、降解率低等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种利用干细胞及细胞膜片技术构建的具有良好的成骨和成血管能力，且细胞来源丰富，易于分离获取，对供体创伤小，培养要求低，有效降低对宿主产生炎症、排异等免疫反应的血管化组织工程骨。

本发明的另一目的是提供上述血管化组织工程骨的制备方法。

为实现上述发明目的所采取的技术方案为：

一种血管化组织工程骨，其特征在于其是由多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石构成的支架以及依次包裹在所述支架表面的成血管内皮细胞膜片(内层)和成骨细胞膜片(外层)构成。

上述用于制备所述成血管内皮细胞膜片的内皮细胞和用于制备成骨细胞膜片的成骨细胞均来源于脂肪间充质干细胞。

上述血管化组织工程骨的制备方法，其特征在于其工艺包括：

1)多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石的制备

将珊瑚羟基磷灰石用质量浓度为0.25％～1.25％的多聚赖氨酸溶液在0～4℃温度条件下浸泡15～24h，之后负压抽滤，置-20℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥即可；

2)成骨细胞膜片的制备

将第三代或第四代脂肪间充质干细胞先用胰蛋白酶消化至绝大部分细胞变圆，从瓶底脱落，然后用dmem/f12培养基终止消化，按1×10⁶～3×10⁶个/cm²的密度接种至培养皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基上，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养24～48h，然后再用成骨细胞诱导培养液培养10～14天即可；

3)成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶个/cm²的密度接种于含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗的dmem/f12培养基中培养24～48h，然后再用血管内皮细胞诱导液持续培养10～14天即可；

4)血管化组织工程骨的构建

将过程3)所得的成血管内皮细胞膜片缠绕在过程1)所得的多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石支架表面，包裹一圈，然后将过程2)所得的成骨细胞膜片包绕在上述成血管内皮细胞膜片外面，包绕一圈，形成卷层样复合体，以丝线缠绕固定。

上述过程1)中，每3小时震荡摇匀浸泡液。

上述过程1)中，所述负压抽滤至未见任何气泡自珊瑚羟基磷灰石表面孔隙溢出即可。

上述过程1)中，所述冷冻干燥是指：将冷冻过夜后的以多聚赖氨酸溶液浸泡的珊瑚羟基磷灰石放入冷冻干燥机内，在温度-42℃～-47℃、负压20-28pa条件下，预冷30min后开始抽真空，控制真空度25～28pa，冷冻干燥48～72h。

上述过程2)中，所述成骨细胞诱导培养液组成为：dmem/f12培养基170～180ml，胎牛血清17～22ml，双抗1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠2～3ml，地塞米松15～25ul。

上述过程2)中，用诱导培养液培养时，隔日换液培养。

上述过程3)中，所述血管内皮细胞诱导液组成为：内皮细胞生长培养基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,维生素c0.09～0.11ml,庆大霉素-两性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氢化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生长因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纤维细胞生长因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,类胰岛素一号增长因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子(vegf)0.09～0.11ml。

上述过程3)中，用血管内皮细胞诱导液培养过程中，隔2-3天换液培养。

上述过程4)中，所述多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石支架在使用前用含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基浸泡12～24h。

珊瑚羟基磷灰石(corallinehydroxyapatite,cha)是将珊瑚经水热交换反应得到的产物，保留了珊瑚多孔性和高孔隙率的特点，使原珊瑚材料机械强度显著增加，并可通过控制水热转换反应的条件来调节cha在体内的降解速率。cha不但克服了天然珊瑚的降解快、质地脆弱等缺点，而且制备简单，有良好的骨诱导性及生物相容性，并可与多种生长因子复合或表面修饰蛋白等分子，在修复骨缺损方面具有良好的应用前景。

多聚赖氨酸(polylysine,pll)是由赖氨酸单体构成的多价阳离子聚合体，由多个氨基酸片段聚合而成，可在体内分解为赖氨酸参与人体代谢，无任何毒副作用。其常被用于骨组织工程支架材料的表面修饰，主要原因在于：①赖氨酸残基在材料表面带正电荷，可增强带负电荷的成纤维细胞等的粘附能力；②其所含的胺基、羟基等可模仿细胞外基质,从而改善材料的表面活性，提高细胞粘附率，促进细胞生长、繁殖；③能促进软骨形成；④安全，组织相容性好，其分解物为人体必需氨基酸；⑤亲水性强，利于改善细胞与材料之间的粘附等。有学者报道用pll处理细胞培养支架、骨组织工程支架等，可增加细胞粘附力与接种率，是一种良好的组织工程支架材料表面修饰方法。

本发明依据材料优化设计的思想，以多聚赖氨酸(pll)修饰珊瑚羟基磷灰石(cha),从而获得生物相容性好并具有三维立体多孔结构的外源支架；利用脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能的特性，将其诱导分化，制备具有成骨能力及成血管能力的双细胞膜片；充分借鉴干细胞及细胞膜片技术和骨组织发育过程，探讨复合构建创新性的血管化组织工程骨的思路和方法，以双细胞膜片复合pll/cha最终构建出成骨和血管化效果较好的血管化组织工程骨。本发明的血管化组织工程骨的技术优势体现在以下几个方面：

1、以多聚赖氨酸(pll)修饰珊瑚羟基磷灰石(cha)获得的外源支架，有利于血管爬行长入，并最终血管化，为组织工程骨内细胞长期生存提供前提条件，同时减少了机体免疫排异及炎症反应；

2、选用脂肪间充质干细胞制备双细胞膜片，无需额外添加不同来源的内皮细胞，细胞来源丰富，易于分离获取，对供体创伤小，不违背伦理学原则，培养要求低；

3、本发明的血管化组织工程骨制备方法简单，条件温和，具有良好的成骨和成血管性能，符合生物体内应用的要求，作为一种新型血管化组织工程骨具有良好的应用前景。

4、本发明的研制成功可为理想的血管化组织工程骨的开发以及大块骨缺损的再生治疗提供实验基础和理论依据，尤其是脂肪干细胞诱导的双细胞膜片的提出与试验，因操作技术相对简单、成本较低、创伤小以及成骨和血管化效果较好，使血管化组织工程骨的应用具有更广阔的前景，以满足修复各种临床硬组织缺损的需要。

将本发明制备的血管化组织工程骨移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。术后分别进行大体观察、sem及组织形态学分析等检测其异位成骨的能力和对血管再生的影响。结果表明：第8周时，实验组支架孔隙内充填胶原样组织，有血管分布。第12周出现不同程度的钙化区，组织内可见大量血管腔。masson染色见：第8周支架近组织侧着色深，密度高，以新生胶原纤维为主。第12周时可见纤维不同程度矿化，可见大量血管腔，胶原纤维稀疏。sem可见cha孔隙内被纤维结缔组织不同程度填充(×100)。5000倍时，结果显示：第12周时纤维表面形成大量羟基磷灰石样结构物质，覆盖面积广泛，矿化最成熟。珊瑚羟基磷灰石支架与双细胞膜片复合构建的血管化组织工程骨具有良好的成骨、成血管性能。

附图说明

图1为cha(左)和pll/cha(右)的sem图；

图2为成骨细胞膜片(左)和内皮细胞膜片(右)的实物图；

图3为pll/cha支架与双细胞膜片复合构建的血管化组织工程骨实物图；

图4为pll/cha/双细胞膜片复合物移植于裸鼠皮下；

图5为a组移植8周(左)和12周(右)he染色(×200)；

图6为a组移植8周(左)和12周(右)(×100)的扫描电镜图。

具体实施方法

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

一、多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石的制备和表征

(1)主要试剂

珊瑚羟基磷灰石(cha)(中国，北京意华健)，多聚赖氨酸(pll)(美国,sigma)。

(2)仪器与设备

超声波清洗机(中国，昆山仪器设备厂)，真空冷冻干燥机(中国，上海比朗仪器公司)，s-3400n扫描电子显微镜(日本，hitachi)。

(3)实验方法

①pll浸泡cha

用双蒸水将pll配制成0.25％～1.25％w/v浓度,经0.22μm滤器过滤除菌。在0～4℃，用配好的pll溶液浸泡cha15～24h，每3h震荡摇匀浸泡液，使pll与cha充分接触。

②负压抽滤

将浸泡cha的容器置于连接负压抽滤瓶、负压抽滤机的无菌干燥皿中，密封好接头与干燥皿盖口，20℃持续负压抽滤5h，直至未见任何气泡自cha表面孔隙溢出，取出浸泡容器，置－20℃冰箱冷冻过夜。

③冷冻干燥

将浸泡容器置于冷冻干燥机内，预置-42℃～-47℃，负压20-28pa，预冷30min后开始抽真空，真空度25～28pa。冷冻干燥48h，将材料称重并封装，贴上标签,置-20℃低温冰箱保存待用。

④表征

取复合支架样本，其表面经离子溅射仪喷金镀膜后，用sem观察支架的表面形貌。

⑤结果

sem结果显示，cha和pll/cha均为多孔结构，孔隙相互贯通，孔隙直径为200-500μm。高倍镜下，cha表面有由叶片状结晶组成的球状羟基磷灰石晶体(直径500-4000nm)，pll/cha表面除羟基磷灰石晶体外，还有一层pll的不规则结晶体。

二、利用兔adscs(脂肪间充质干细胞)诱导分化分别构建成骨细胞膜片、成血管内皮细胞膜片

(1)主要试剂

噻唑蓝(alarmarblue)(上海，翊圣)，抗坏血酸(ascrobicacid)(北京索莱宝生物科技有限公司)，直接红80(directred80)(美国sigma)，dmem/f12培养基、磷酸盐缓冲液(pbs)、胎牛血清(fbs)(美国hyclone)。

(4)仪器与设备

infinitem200pro酶标仪(瑞士，nanoquan)，h-7650透射电子显微镜(日本，hitachi)，s-3400n扫描电子显微镜(日本，hitachi)，偏光显微镜dm2500p(德国，leica)，正置荧光显微镜bx-511250ccd(日本，olympus)，co2培养箱(heraeus公司，德国)。

(3)实验方法

①成骨细胞膜片的制备

将增殖状态良好的第四代adscs(脂肪间充质干细胞)常规用1％胰蛋白酶消化，至绝大部分细胞变圆，从瓶底脱落，然后用dmem/f12培养基终止消化。调整细胞密度至1×10⁶～3×10⁶个/cm²，接种于预先用1％明胶包被的培养皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养，24～48h后更换为成骨细胞诱导培养液(dmem/f12培养基170～180ml，胎牛血清17～22ml，双抗(青霉素、链霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠2～3ml，地塞米松15～25ul)，隔日换液一次，观察膜片的形成过程和形成情况，持续培养10～14天，皿底可见半透明乳白色薄膜样物，膜内有多个白色大小不等的结节时，用细胞刮刀轻轻刮擦，使膜状物与皿底分离，可获得成骨细胞膜片。

②成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶个/cm²的密度接种于含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基中培养24～48h，后更换成血管内皮细胞诱导液(内皮细胞生长培养基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,维生素c0.09～0.11ml,庆大霉素-两性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氢化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生长因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纤维细胞生长因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,类胰岛素一号增长因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子(vegf)0.09～0.11ml)，观察记录细胞形态变化，隔2-3天换液。持续培养14天，可获得内皮细胞膜片。

三、pll/cha/双细胞膜片构建血管化组织工程骨以及动物体内异位移植实验

(1)主要试剂

速眠新ii注射液(吉林，圣达)，苏3号注射液(吉林，圣达)，powerdryhetoll3000真空冷冻干燥机(美国，thermofisher)，其余试剂均为分析纯。

(2)仪器与设备

shz-d(iii)循环水式真空泵(巩义，予华)。

(3)实验方法

①pll/cha/双细胞膜片复合体构建血管化组织工程骨

将pll/cha切割制成0.5*0.5*2cm大小长方体，环氧乙烷消毒灭菌，无菌封装备用。使用前用含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基中浸泡12～24h。

将前述方法制备的双细胞膜片(成骨细胞膜片和成血管内皮细胞膜片)，以细胞刮刀小心自培养皿底壁外周刮擦，使膜状物与皿分离。

将成血管内皮细胞膜片缠绕在支架(pll修饰的珊瑚羟基磷灰石)内表面，包裹一圈，然后将成骨细胞膜片包绕在成血管内皮细胞膜片外面，包绕一圈，形成卷层样复合体，以丝线缠绕固定，记为复合体a，为实验组；单纯的成骨细胞膜片和内皮细胞膜片包绕复合支架一圈构建复合体分别记为复合体b和复合体c,为对照组。培养3天后待用。

②无外源支架血管化组织工程骨异位移植实验

将36只裸鼠，随机分为a组、b组、c组，将pll/cha/双细胞膜片复合体裸鼠皮下植入术后8周和12周进行检测(n＝6/组/时间点)。裸鼠皮下植入：将稀释速眠新液按照0.1ml-0.2ml/20g肌肉注射麻醉，于背部做横切口，皮下植入构建物。实验组为复合体a，对照组为复合体b和膜片复合体c。

③表征

大体观察：组织工程骨植入后观察裸鼠生活状态和切口愈合情况和移植物变化；取材前观察真皮、周围组织与移植物关系。

组织学检测：将取出的移植物分成两份，一份使用2.5％戊二醛固定24h，sem样品制备，观察标本剖面结构。一份常规石蜡包埋，制作5μm连续切片，选取组织块中心部位4张切片行he染色，并按照weidner等报道方法进行微血管计数，用spss20.0对结果进行统计分析；选取4张切片行masson染色，观察纤维矿化状况。

④结果

结果显示，双细胞膜片复合体与支架复合后，紧密贴合。植入裸鼠皮下后，切口未见炎症反应。术后第8周，可见移植物周围组织粘连，附有毛细血管。第12周，移植物周围的组织增多，表面附着小血管增多；cha孔隙内完全被淡黄色组织填充，可见毛细血管伸入。he染色结果可见：第8周时，支架孔隙内充斥胶原样组织，组织内散在分布数量不等的血管，可见红细胞、成骨细胞形态。第12周可见组织内细胞数量大量增加，a、b两组出现不同程度的钙化区，以a组矿化最明显。c组未见矿化区域，组织内可见大量有效灌注的血管。masson染色结果显示：第8周支架孔隙内由不等量的胶原纤维充斥，纤维分布稀疏，可见血管形成。三组之间未见明显差异。第12周时，可见组织纤维不同程度矿化，其中以a组最为明显。c组可见大量血管腔，胶原纤维稀疏。sem结果显示，第8周可见三组cha孔隙内被纤维结缔组织不同程度填充。第12周，三组cha孔隙完全被纤维样组织充填完整，组织与支架之间结合紧密。微血管计数结果显示：第8、12周时，a、b、c三组微血管数目组间差异有统计学意义，两个时间点c组分别与a、b组差异有统计学意义(p<0.05)，说明c组具成血管能力明显高于其他两组。第8周时，a组和b组之间差异也有统计学意义(p<0.05),说明第8周时a组微血管数目高于b组。结果表明，pll/cha/双细胞膜片复合体构建的血管化组织工程骨具备良好的成骨、成血管性能。