本发明属于生物材料的组织工程技术领域，尤其涉及一种软骨组织培养方法。
背景技术：
目前，因为手机电视等电器的普及，很多人因为各关节活动量减少，长期保持一个姿势，致使关节病提前发生，例如颈椎病和腰椎间盘突出等疾病，发病率逐年升高并严重危害部分年轻人及中老年人的身体健康，而这些病变的发生主要的病理基础是各关节中软骨组织的退变。通过退变使得关节僵硬或产生脊柱失稳、椎管狭窄刺激或压迫肌肉、神经根、血管和脊髓，甚至通过脊神经反射影响内脏功能。目前临床治疗手段大部患者采用保守的对症治疗以拖延病情发作，少数患者手术治疗。因此，开发软骨组织培养技术，研究关节病的病理机制及对组织移植等非常必要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种软骨组织培养方法,该方法能对软骨组织进行体外培养，可操作性强，成功率高。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种软骨组织培养方法，包括以下步骤：
a.在培养板每个培养孔内分别加入质量百分比为2.0％的羧甲基纤维素钠溶液，然后加入碱液使上述溶液成胶冻状形成羧甲基纤维素钠凝胶层，去除过多的碱液；
b.无菌条件下从麻醉后动物身上剥离软骨组织，用培养液反复冲洗3遍后，将软骨组织分别放入含有双抗PBS溶液的培养板中，备用；
c.将步骤b得到的软骨组织置放在羧甲基纤维素钠凝胶层上，立即覆盖同样的羧甲基纤维素钠溶液，从而把整个软骨组织包埋在羧甲基纤维素钠溶液中；再加入碱液使羧甲基纤维素钠溶液马上结成凝胶；
d.10分钟后去除过多的碱液，用含有双抗PBS溶液将凝胶冲洗两次，然后再用培养液冲洗两次后，将凝胶置于培养液中；
e.将步骤d的培养物放在37℃含有5％CO2的环境下保存4周，每天更换培养液；
优选的，所述的步骤e中培养开始前三天，从培养箱内取出培养皿，在37℃恒温水平摇床内以60rpm频率摇晃，每次30分钟，每日一次，连续三天。
优选的，所述的双抗PBS溶液为含有链霉素50ug/ml和青霉素50U/ml的磷酸盐缓冲液。
优选的，所述的碱液为弱碱液，如一水合氨、氢氧化铝等。
优选的，所述的培养液为含10％胎牛血清、25ug/ml抗坏血酸和50ug/ml庆大霉素的DMEM/F12的培养液。
优选的，所述的羧甲基纤维素钠溶液中还含有0.15mol/LNaCl，且为消毒溶液。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.本发明方法利用羧甲基纤维素钠凝胶进行培养，原材料易得，培养方法简单，培养效果好，成本低，并且培养过程中可有效的维持了原组织形态。
2.成功的实现了软骨组织的体外培养，克服了传统培养的缺点，较好的保持了软骨组织的生物学特性，本发明可操作性强，成功率高。
3.本发明适用于软骨组织培养工程学，对软骨移植术以及药物防治软骨退变等多方面的研究提供依据。
具体实施方式
实施例一：
1.DMEM/F12培养液的配制
a.Hyclone干粉细胞培养基1包1升装。
b.电子天平称取NaHCO31200mg
c.量筒量取1000ml三蒸水
d.将三蒸水、NaHCO3、DMEM/F12干粉细胞培养基放入烧杯中混匀、溶解。
2.羧甲基纤维素钠溶液的配制
0.15mol/LNaCl溶液配制2wt％羧甲基纤维素钠，高温高压灭菌，趁热分装于50ml离心管，待用。
3.软骨组织的制备及培养
a.取40周左右非正常死亡胎儿，一般在死亡后8小时以内，无菌操作，找到关节部位，小心剥离软骨组织，然后用培养液反复冲洗3遍后将软骨组织放入含有双抗PBS溶液培养板中。
b.组织培养：用孔径0.22um的一次性滤器在每个培养孔内分别加入2ml含2.0％羧甲基纤维素钠的0.15mol/L NaCl消毒溶液中,然后缓缓加入100mol/L的氢氧化铝4ml使羧甲基纤维素钠成胶冻状，去除过多的氢氧化铝溶液后，将软骨组织置放在羧甲基纤维素凝胶层上，立即覆盖以4ml同样的羧甲基纤维素溶液，从而把整个软骨组织包埋在羧甲基纤维素溶液中；再缓缓加入100mol/L的氢氧化铝8ml使羧甲基纤维素溶液马上结成凝胶；注意不要破坏羧甲基纤维素凝胶层面；10分钟后去除过多的氢氧化铝溶液，用含有双抗PBS溶液将凝胶冲洗两次，然后再用DMEM/F12培养液冲洗两次；最后将其用含10％胎牛血清、25ug/ml抗坏血酸和50ug/ml庆大霉素的DMEM/F12培养液4ml置换掉；将培养物放在37℃含有5％CO2的环境下保存4周，每天更换培养液(含10％胎牛血清、25ug/ml抗坏血酸和50ug/ml庆大霉素的DMEM/F12培养液)，前三天，从培养箱内取出培养皿，在37℃恒温水平摇床内以60rpm频率摇晃，每次30分钟，每日一次，连续三天。
实施例二：实验观察细胞生长情况：
1.软骨组织冰冻切片制作
将软骨组织从胶中取出，PBS清洗2次，用4wt％PFA固定1小时后PBS清洗2次，然后经10wt％、30wt％、50wt％浓度的蔗糖PBS溶液各3小时逐级沉淀后OTC胶包埋，负20℃保存备用。
2.藏红固绿染色观察
用冰冻切片机，以10um厚度连续切片，室温晾干后，负20℃保存备用。将冰冻切片取出晾干，蒸馏水洗，0.1wt％固绿染液5min，1wt％冰醋酸快速漂洗，清水快速漂洗，0.2wt％藏红染液5min，95wt％酒精蒸快速漂洗，常规脱水透明封片。
正常软骨组织细胞Ⅰ型胶原含量高，可被固绿染液着色呈绿色，其间的纤维软骨细胞由于其在细胞周围的陷窝中分泌蛋白多糖，可以被藏红染液着色呈红色，本发明培养的组织细胞染色可以见到红色的纤维软骨细胞，其结构紧密，排列整齐，细胞分有均匀。
实施例三：组织RNA提取和Real-Time PCR检测：
培养结束后，在显微解剖镜下小心分离出软骨组织表层，并迅速置于液氮中研磨成粉末，加入1mlTiPure后按说明书步骤提取总RNA。待RNA浓度测定完毕，用逆转录试剂盒将1ugRNA逆转录为cDNA，然后构建由cDNA模板、上下游引物及SYBR Green qPCR Mix组成的定量PCR体系进行荧光定量检测。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性15s，58退火15s，72延伸20s，40个循环，与新鲜组织细胞做归一化处理。
荧光定量PCR结果显示本培养方法与体内自然生长组织中基因的表达水平相一致，表明培养状况良好。
实施例四：组织糖胺多糖(GAG)检测：
组织培养结束后，将分离出来的表层细胞低温冻干，精确称量组织干重后，将冻干组织放入1.5mlEP管中，加入5mg/ml木瓜蛋白酶消化液1ml(含0.2mol/L氯化钠，0.01mol/L盐酸半胱氨酸，0.1mol/L乙酸钠和0.05mol/L乙二胺四乙酸二钠)，60℃消化36h，以鲸6-硫酸软骨素(6-CS)为标准品，配制浓度为50ug/ml至500ug/ml的梯度标准品溶液(间隔浓度为50ug/ml)用以制作标准曲线。随后按照二甲基亚甲蓝(DMMB)法，将样本液与1,9-二甲基亚甲蓝染液混合，测定525nm波长处吸光度值(OD值)，根据标准曲线计算获得的样品GAG含量。
结果显示本培养方法与体内自然生长组织中样品GAG含量相一致，表明培养状况良好。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。