一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于软骨组织工程领域，尤其涉及一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工 程软骨的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，组织工程软骨材料被认为是最有应用前景的关节软骨修复材料。在软骨组 织工程构建软骨的过程中，支架材料起到为细胞和生长因子提供支撑、粘附、分化、增殖及 代谢场所的作用，可以把支架材料当作临时的细胞外基质。
[0003] 目前并没有一种支架材料能完全满足软骨组织工程的要求，而仿生多相梯度设计 已成为软骨组织工程支架设计的重要因素和必备要求之一。脱细胞基质材料因为能最大限 度的继承细胞外基质成分，从而最能够充分遵循仿生设计原则。细胞外基质围绕在细胞周 围，由细胞自身分泌的一系列组织，软骨支架材料通过模仿细胞外基质达到支撑细胞，为细 胞和生长因子的粘附、分化、增殖、代谢及相关调控基因的表达提供场所。软骨支架材料研 制的核心原则就是仿生设计，所以脱细胞软骨支架材料已成为当前软骨组织工程支架研究 的热点。脱细胞软骨支架材料从来源上分类属于天然软骨支架材料的一种，具有生物组织 相容性高、细胞黏附率高等优点；更重要的是，脱细胞材料降解率符合生物组织降解规律， 降解产物易被机体所吸收，具备无炎症反应、毒性较小、抗原性低等优点；另外，脱细胞软骨 支架材料在一定程度上仍然保留有胶原、糖胺多糖、层粘连蛋白及纤维粘连蛋白等多种天 然细胞外基质成分，这些特点使得脱细胞软骨支架材料与其他类型软骨支架材料相比，能 更加充分的仿生，并能更加有利于诱导细胞向其中黏附、增殖、分化及重建组织。但是，脱细 胞软骨支架材料存在以下两大方面的缺陷：第一，脱细胞软骨支架材料与其它天然软骨支 架材料一样，存在力学性能不佳、结构改性困难的缺点。而关节软骨在机体内的功能是承受 重力或机体活动带来的力学负荷以及提供弹性润滑的接触面，这些都需要关节软骨必须具 备出色的力学性能和微观结构。第二，脱细胞基质材料往往通过将同种异体或异种组织甚 至器官经过脱细胞和去免疫原性等处理后获得。而关节软骨在机体内分布比例小，取材范 围有限，加之取软骨操作难度大，很难将同种异体或异种关节软骨作为原材料大量成批的 制备脱细胞软骨支架材料。
[0004] 人工合成梯度材料因能够通过各种制备工艺控制和材料选择得到分梯度的支架 材料，从而最大限度的模仿正常关节软骨的纤维走行，从而为使组织工程软骨复合体能最 大限度的达到正常关节软骨的生物力学功能起到促进甚至决定作用，已经成为了当前研究 的热点。但人工合成梯度材料的原材料均为人工合成，生物学性能较差，且往往不能很好的 促进细胞的生物学行为的发挥，有碍软骨组织的生成和组织工程软骨组织复合体功能的发 挥;并且，目前所研制的多相梯度软骨支架材料都存在过渡区域结合不牢的共同缺点，也就 是说在两个不同相的接触面在抵抗剪应力时存在表现不佳的现象，而不同相接触面需要稳 定的结合。找到使材料各层之间结合紧密的解决办法，或者找到一种天然过渡的连接紧密 的一体化交界面也成为了当前研究的热点。
[0005] 总而言之，目前尚未有理想的软骨组织工程支架材料。脱细胞支架材料虽然有着 很好的应用前景，但脱细胞支架材料存在原材料来源有限以及力学性能不佳的缺点；多相 梯度设计虽然被认为是目前理想软骨支架材料的必备设计要求，但多相梯度软骨支架材料 几乎都为人工合成材料，生物学性能较差且无法很好的促进细胞生物学行为的发挥，并存 在交界区域过渡不自然甚至不牢固的缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，旨 在解决天然脱细胞支架力学强度差、结构改性困难、原材料来源有限，以及多相梯度软骨支 架材料生物学性能不佳的问题。
[0007] 本发明是这样实现的，一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包 括：
[0008] 步骤一、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化 冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料。
[0009]步骤二、将检测合格的转化生长因子-m缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐 带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。
[0010] 进一步，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：
[0011] 将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20_的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切 除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体 高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶 加工成12_ X 8_ X 3mm大小长方体的组织块。
[0012] 进一步，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：
[0013] 步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素 PBS液中浸泡冲洗5min，重复3次。
[0014] 步骤二、双蒸水浸泡沃顿胶组织块lmin。
[0015] 步骤三、胰蛋白酶消化组织块15min。
[0016]步骤四、双蒸水震荡漂洗组织块5min。
[0017] 步骤五、将漂洗干净的组织块装入冻存管里，快速置入含液氮罐的液氮中冷冻 15min，取出后将沃顿胶组织块立即经37°C水浴快速复温，重复上述急冻急复温过程3次。
[0018] 步骤六、再次将组织块置入含抗生素 PBS液中，浸泡冲洗IOmin次。
[0019 ] 步骤七、双蒸水浸泡组织块5小时，每15min震荡1次。
[0020] 步骤八、将组织块置入一 80°C的低温冰箱预冻Ih从而调节孔径大小。
[0021] 步骤九、真空冷冻干燥机中将组织块真空冷冻干燥12h得到沃顿胶梯度脱细胞软 骨支架材料。
[0022]步骤十、将得到的沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料使用环氧乙烷灭菌8h后放入冰 箱密封保存备用。
[0023] 进一步，步骤二所述的组织工程梯度软骨复合体的制作方法包括：
[0024] 步骤一、负载生长因子缓释微球到支架材料：
[0025]取制备好的包裹TGF-βΙ壳聚糖缓释微球粉末100mg，在20ml含抗生素的无菌双蒸 水中分散，充分分散后制成缓释微球悬浊液。将制备好的沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支 架材料放入12孔无菌培养板里，往每个孔里缓慢滴加缓释微球悬浊液，直到使支架材料里 充分吸满缓释微球悬浊液并完全浸泡在缓释微球悬浊液中，最后将支架材料进行真空低温 冷冻干燥12h后环氧乙烷灭菌8h备用。
[0026] 步骤二、负载DMEM到支架材料：
[0027]将经过环氧已烷灭菌的支架用无菌磷酸盐缓冲液浸泡20分钟，甩掉多余水分后将 支架材料置于12孔培养板内，用含15%PBS的含抗生素 DMEM培养基预湿8小时，干燥备用。 [0028]步骤三、细胞-支架复合物的构建。
[0029] 进一步，所述细胞-支架复合物的构建方法为：
[0030] 步骤一、获取及调整细胞密度：
[0031 ]将P3代MSCs(脐带间充质干细胞），状态为生长至接近融合，用0.25 %胰蛋白酶+ 0.02%EDTA消化，之后收集并调整MSCs细胞密度到6 X IOVmL;
[0032]步骤二、接种和孵育：
[0033]取准备好的负载生长因子缓释微球和负载DMEM的两类支架，放置在12孔培养板 内，吸取lOOulMSCs细胞悬液，全部匀速滴加到支架材料上，每块支架上滴加 lOOulMSCs细胞 悬液;之后将这些滴了细胞悬液的支架材料置于37°C、100 %饱和湿度、5 % CO2的培养箱内 孵育1小时，之后翻转这些支架材料，再按每块支架上滴加 lOOulMSCs细胞悬液的浓度操作