一种生产硫酸软骨素的方法
【专利摘要】本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，将芽孢杆菌以4?6％接种量至种子培养基中，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263，振荡培养得到种子液，将种子液以接种量为4?6％接入发酵培养基中，在摇床上进行培养发酵得到含硫酸软骨素的发酵液；将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。本发明方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。CCTCCNO:M201626320160516
【专利说明】一种生产硫酸软骨素的方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于微生物发酵领域，涉及一种硫酸软骨素，具体来说是一种生产硫酸软骨素发酵液方法。
【背景技术】
[0003]硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate ,CS)是广泛分布于动物软骨组织中的一类酸性黏多糖。2010年Jolly对许多微生物发酵进行分析，发现有多种微生物也能产生硫酸软骨素。例如巴斯德杆菌(P asiet/re_/_/a multocida )，大肠杆菌(Escherichia coll),芽孢杆菌等少数细菌中存在硫酸软骨素。硫酸软骨素分子结构为由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖构成的重复二糖单位组成的多糖，硫酸软骨素一般含有50?70个二糖基本单位，相对分子质量在10 000?50 000之间。按酯化的硫酸基团位置不同，硫酸软骨素分为A、B、C、D、E、F等多种类型。临床上主要用于关节炎、肩关节痛、冠心病、心绞痛等辅助治疗，近年来，硫酸软骨素在医药制剂、医学材料、化妆品、保健品等领域更广泛得到应用，市场需求趋愈来愈大。我国生产和出口量逐年大幅增长，发展前景广阔。
[0004]目前，我国主要采用酶解法或碱提-酶解法工艺从动物骨头制备硫酸软骨素。极少有采用微生物发酵法生产硫酸软骨素的报道。而动物骨资源比较贫乏，急待开发新的生物资源及新的技术工艺来生产硫酸软骨素。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，所述的这种生产硫酸软骨素的方法要解决现有技术从动物骨头中生产硫酸软骨素的方法中，骨头原料短缺难以扩大生产规模的技术问题。
[0006]本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤:
1)将芽孢杆菌以接种量为4-6%接种至种子培养基上进行震荡培养15_18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC N0:M2016263，种子培养条件为:转速120-160r/m，初始pH值为7.0-7.2，发酵温度为28-35 °C;
2)将步骤I)得到种子液以接种量为4-6%接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h;即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为:转速120-160r/m，初始pH值为7.0-7.2，温度为30-35°(:;
3)将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。
[0007]进一步的，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g,硫酸镁0.5-1.0g,磷酸二氢钾1.5-2.5g，所述的氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰
0.1-1.0g，余量为水。
[0008]进一步的，所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成;每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.(^，硫酸镁1.5-2.58，磷酸二氢钾
1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g,磷酸氢二钠1.0-4.0 g，磷酸二氢钠0.3一3.0g，余量为水。
[0009]具体的，采用乙醇沉淀法进行纯化处理得到硫酸软骨素。
[0010]本发明的一种芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌G-09 Bacillussp.G-09，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中，中国典型培养物保藏中心的地址为:中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2016年5月16号，保藏号为CCTCC N0:M201623。
[0011]通过本发明方法获得的硫酸软骨素多糖的产量约127mg/L。
[0012]本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的方法步骤简单，条件温和，产量较高，发酵生产原料不受动物骨原料短缺的限制，发酵产品可用于药品原料和保健品原料。
[0013]
【具体实施方式】
[0014]实施例1:芽孢杆菌的筛选方法。
[00?5]芽孢杆菌分离纯化:从采集于郊外枯枝烂叶的土壤中，称取3_5g土样，风干后，放入30-50ml灭菌蒸馏水(玻璃珠5粒)的三角瓶中，摇瓶30-60min，然后放在85°C水浴30min，冷却后，稀释至10—3，10—4，10—5稀释液，分别取稀释液0.1-0.2ml涂布于牛肉膏蛋白胨平板，置于35°C，倒置培养32-48h，观察菌落的形态特征。并调取单菌落，用孔雀绿染色法染色进一步镜检观察。孔雀绿染色法步骤如下:
(I)挑菌落按革兰氏染色法涂片后，用6%孔雀绿水溶液染1min。
[0016](2)用自来水冲洗。(3)用0.5%番红液复染2min，水洗，吸干。于显微镜下观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。挑出产芽孢的菌落编号保存，作为进一步筛选的菌种。
[0017]产硫酸软骨素芽孢杆菌的筛选:将上述分离纯化得到的菌种接种于LB肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏15g，NaC115g，蒸馏水1000ml，调节PH7.2)培养24h-48h后离心收集发酵液，发酵液采用高效液相色谱法分析，选出发酵液中产酸软骨素较高菌株，即为产硫酸软骨素的芽孢杆菌。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中，其保藏号为CCTCCN0:M201623。
[0018]将筛选得到的产硫酸软骨素的芽孢杆菌经形态学、生理生化鉴定为芽孢杆菌，并命名为Bacillus.sp G_09o
[0019]实施例2: Bacillus.sp G-09菌株的鉴定 (I)形态特征观察
将G-09菌株接种于LB固体培养基中，在35°C恒温条件下培养48h，形成菌落，菌落特征为乳白色不透明、湿润、粘稠；显微镜观察菌体呈杆状，末端圆，单个或呈短链状排列。菌体有芽孢形成，芽胞直径大于1.Ομπι，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性杆菌。
[0020](2)生理生化鉴定
参考RE.希坎南.《伯杰氏细菌鉴定手册》(北京:科学出版社，1989 )的方法，对G-09菌株进行生理生化特性鉴定，鉴定结果是VP试验阳性，MR试验阳性，接触酶实验阳性，明胶液化阳性，吲哚试验阳性，柠檬酸盐实验阳性，淀粉水解实验阳性，耐盐实验阳性。
[0021](3) 16S rDNA分子生物学鉴定 16S rDNA的扩增:
扩增引物:P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
P2:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 。
[0022]PCR 反应体系:0.20μ1 Taq DNA 聚合酶；2.5μ1 10 X PCR 反应缓冲液；Ιμ? dNTP(各2.5111]\0;0.5卩1 Pl(10 uM)；0.5yl P2(10 uM) ;0.5μ1 基因组DNA( 20_50ngAU)，加双蒸H20 至25μ1。
[0023]PCR反应条件:94°C 5 min；94°C 30 S，55°C 40 S，72°C 90 s，30个循环；72°C终延伸10 min。
[0024]PCR产物检测及16S rDNA序列的测定:PCR产物经过I %琼脂糖电泳(150V、10mA20min)后，将PCR扩增产物进行测序，然后将得到的16 S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。所得16S rDNA序列与GenBank数据库中核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种BaciIIus sp 0711P6_2;HM226670，同源性达99%。
[0025]根据菌落的形态，生理生化特性，根据形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定G-09菌株为芽孢杆菌(Bacillus.sp)，将其命名为:芽孢杆菌G_09(Bacillus.spG-09)ο
[0026]实施例3
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤:
(I)将芽孢杆菌以接种量为5%接种至种子培养基上进行震荡培养16h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO: M2016263。种子培养条件为:转速120/m，初始pH值为7.0，发酵温度为30 V，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g,硫酸镁0.5-1.0g,磷酸二氢钾1.5_2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰
0.1-1.0g，余量为水。
[0027](2)将(I)得到种子液以接种量为5%接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养30h;即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为:转速120r/m，初始pH值为7.2，温度为32°C。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成。每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.(^，硫酸镁1.5-2.58，磷酸二氢钾1.5-2.58，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g,磷酸氢二钠1.0-4.0g,磷酸二氢钠0.3-3.0g,余量为水。
[0028](3)生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约112mg/L。
[0029]实施例4
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤:
(I)将芽孢杆菌以接种量为4%接种至种子培养基上进行震荡培养18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC N0:M2016263。种子培养条件为:转速140r/m，初始pH值为7.1，发酵温度为28°C，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g,硫酸镁0.5-1.0g,磷酸二氢钾1.5_2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰
0.1-1.0g，余量为水。
[0030](2)将(I)得到种子液以接种量为4%接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养35h;即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为:转速120r/m，初始pH值为7.2，温度为30°C。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成;每L培养基中，每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.(^，硫酸镁1.5-2.58，磷酸二氢钾
1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g,磷酸氢二钠1.0-4.0g,磷酸二氢钠0.3一
3.0g，余量为水。
[0031](3)生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约105mg/L。
[0032]
实施例5
本发明提供了一种生产硫酸软骨素的方法，包括如下步骤:
(I)将芽孢杆菌以接种量为6%菌接种至种子培养基上进行震荡培养15h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC NO:M2016263。种子培养条件为:转速160r/m，初始PH值为7.0，发酵温度为32°C，所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.0g，硫酸镁0.5-1.0g,磷酸二氢钾1.5_2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g，余量为水。
[0033](2)将(I)得到种子液以接种量为6%接种到装有发酵培养基三角瓶中，在摇床上培养32h;即可得到硫酸软骨素发酵液。培养条件为:转速160r/m，初始pH值为7.0，温度为30°C。所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成;每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化钠0.5-2.(^，硫酸镁1.5-2.58，磷酸二氢钾1.5-2.58，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g，磷酸氢二钠1.0-4.0g，磷酸二氢钠0.3-3.0g,余量为水。
[0034](3)生产的发酵液再经过本领域常用的乙醇沉淀法进行纯化处理即可得到硫酸软骨素，多糖的产量约127mg/L。
[0035]所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)将芽孢杆菌以接种量为4-6%接种至种子培养基上进行震荡培养15_18h，得到种子培养液，所述的芽孢杆菌的保藏编号CCTCC N0:M2016263，种子培养条件为:转速120-160r/m，初始pH值为7.0-7.2，发酵温度为28-35 °C; 2)将步骤I)得到种子液以接种量为4-6%接种到装有发酵培养基的容器中，在摇床上培养30-35h;即可得到含硫酸软骨素发酵液，培养条件为:转速120-160r/m，初始pH值为7.0-7.2，温度为30-35°(:; 3)将得到的硫酸软骨素发酵液提纯后得到硫酸软骨素。2.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于:所述种子培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，每L培养基中，含有蔗糖15_20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化钠0.5-1.(^，硫酸镁0.5-1.(^，磷酸二氢钾1.5-2.5g，所述的氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰0.1-1.0g,余量为水。3.根据权利要求1所述的一种生产硫酸软骨素的方法，其特征在于:所述发酵培养基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸锰和水组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成;每L培养基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉ΙΟ-? 5g ，氯化钠0.5-2.0g，硫酸镁1.5-2.5g，磷酸二氢钾1.5-2.5g，氯化钙0.2-0.5g，硫酸锰.0.1-1.0g,磷酸氢二钠1.0-4.0 g，磷酸二氢钠0.3-3.0g余量为水。
【文档编号】C12R1/07GK106011200SQ201610515101
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】龚钢明, 赵芳芳
【申请人】上海应用技术学院