硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法
【专利摘要】本发明公开一种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，包括：将蛋壳基质干燥后粉碎，获得蛋壳基质粉末；从蛋壳基质粉末中分离、提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸，从而获得高纯度的硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
【专利说明】
硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，尤其涉及一种从蛋壳中获取硫酸软骨素/硫酸皮肤素的提取方法。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素/硫酸皮肤素是一种富含阴离子的直链线性大分子多糖，能够和动物体内多种细胞生长因子、细胞因子、细胞受体以及生化酶相结合，诱发信号转导、调控细胞生长、分化及凋亡。硫酸软骨素/硫酸皮肤素被广泛用作调味品和沙拉酱的乳化剂，或研制成药物用于疱疹病毒感染性关节炎、疟疾、神经组织功能修复、肝组织再生以及肿瘤治疗，或者因为其生物兼容性和亲水性用作纳米药物载体。
[0003]硫酸软骨素/硫酸皮肤素的商业需求日益增大，但来源总体分为两类:一是动物组织，如牛、羊、家禽的气管、软骨组织，多来源于屠宰车间；另外是通过微生物发酵。但是这两种来源都存在明显的缺陷:第一、上述动物组织产量有限，从而限制硫酸软骨素/硫酸皮肤素的产量;第二、疯牛病的爆发以及动物屠宰后组织器官处理环境的不合格严重影响人类对动物源硫酸软骨素/硫酸皮肤素的使用;第三、通过微生物发酵产生的硫酸软骨素/硫酸皮肤素分子量(长度)难把握，尤其重要的是，容易存在内毒素，直接限制其下一步应用。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种从蛋壳中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素的提取方法，可有效解决上述问题。
[0005]—种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其包括:
[0006]SI，将蛋壳基质干燥后粉碎，获得蛋壳基质粉末；
[0007]S2，将所述蛋壳基质粉末悬浮于磷酸盐缓冲液PBS中，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7?11，且含有O?0.6wt%的十二烷基磺酸钠，所述蛋壳基质粉末与磷酸盐缓冲液的质量比为1:10?80;
[0008]S3，往步骤S2所获得的悬浮液中加入链霉蛋白酶?Act inase E，并保持反应温度为37?39°C，处理12?28小时以降解所述蛋壳基质粉末中的蛋白质；
[0009]S4，将步骤S3中的链霉蛋白酶?Actinase E灭活；
[0010]S5，将步骤S4中获得的产物用蛋白酶K或碱性蛋白酶?alcalase在53?56°C温度下处理6?24小时以进一步降解所述蛋壳基质粉末中残余的蛋白质以及灭活的链霉蛋白酶?Actinase E；
[0011]S6，将步骤S5中的蛋白酶K或碱性蛋白酶?alcalase灭活；
[0012]S7，将步骤S6所获得的产物离心分离，获取上清液；
[0013]S8，从步骤S7获得的上清液中提取总糖胺聚糖；
[0014]S9，将从步骤S8获得的总糖胺聚糖溶解于水或50mM Tris(Tris(hydroxymethyI)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷).HCl缓冲液，其中，所述缓冲液的pH为7?9;然后加入肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶II1、角质素酶以及透明质酸酶于37°c反应12?24小时小时以降解总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸；
[0015]S10，将步骤S9中获得的产物循环两遍加入强效阴离子交换柱(循环两遍加样可以有效提高硫软骨质素/硫酸皮肤素与阴离子交换柱的结合，从而提高硫软骨质素/硫酸皮肤素产率)，或加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与阴离子交换树脂体积比为5?80:1;之后用0.1?0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以去除酶解后的糖链碎片或其它杂质，再用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液;随后，或者用截留量为3?1kDa的超滤管或透析袋洗脱NaCl获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素;或者先用2?5倍体积的无水甲醇加入硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液，在-20?8°C沉淀12?18小时，离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70?95v%甲醇洗涤硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀;最后冻干或空干获得最终产物硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
[0016]优选的，所述将蛋壳基质干燥的步骤为:将所述蛋壳基质冷冻干燥I?5天，或将所述蛋壳基质在20?90 °C烘干I?5天。
[0017]优选的，所述链霉蛋白酶?ActinaseE与所述蛋壳基质粉末的质量比为1:2?50。
[0018]优选的，在步骤S4中，所述将步骤S3中的链霉蛋白酶?Act inase E灭活的步骤包括:将步骤S3获得的产物在90?95°C加热处理10?30分钟。
[0019]优选的，步骤S5中，所述蛋白酶K与所述蛋壳基质粉末的质量比为1:20?100，所述碱性蛋白酶与所述蛋壳基质粉末的质量比1:30?100。
[0020]优选的，在步骤S6中，所述将步骤S5中的蛋白酶K或碱性蛋白酶灭活的步骤包括:将步骤S5获得的产物在90?100°C加热处理10?40分钟。
[0021]优选的，在步骤S7中，所述将步骤S6所获得的产物离心分离，通过悬浮桶转子3200?8OOOxg离心力实现。
[0022]优选的，步骤S8包括:将所述上清液循环两遍加入强效阴离子交换柱(循环两遍加样可以有效提高总糖胺聚糖与阴离子交换柱的结合，从而提高总糖胺聚糖产率)，或往所述上清液中加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5?80:1;之后用0.1?0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以充分洗掉杂蛋白或其它杂质，随后用3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液;之后，或者用截留量为3?1kDa的超滤管或透析袋去除NaCl获得总糖胺聚糖；或者先用2?5倍体积的甲醇加入总糖胺聚糖盐溶液，在-20?8°C温度下沉淀总糖胺聚糖12?18小时，然后离心去除含盐上清，之后用体积浓度95%甲醇连续洗涤沉淀获得总糖胺聚糖;将所述总糖胺聚糖产物冻干或空干。
[0023]优选的，步骤S8包括:往所述上清液中加入氯化十六烧卩比啶，使每10mL所述上清液中含0.01?0.5g氯化十六烷吡啶;混匀后在2?8°C放置过夜以充分沉淀总糖胺聚糖;然后在2?20°C温度下用固定角转子15000?30000xg离心力离心去除上清液；再用含5?20的％乙酸钾的70?95v%乙醇洗涤沉淀，之后用无乙酸钾的70?95v%乙醇洗涤沉淀，空干沉淀获得所述总糖胺聚糖。
[0024]优选的，每微克糖胺聚糖中所述肝素酶1、所述肝素酶I1、所述肝素酶II1、所述角质素酶以及所述透明质酸酶的用量分别为0.01?0.15mU、0.1?lmU、0.5?3mU、0.01?0.3ml^P0.01?0.15mU。
[0025]本发明提供的所述提取方法，具有以下优点:本技术可以有效克服现有技术中两种硫酸软骨素/硫酸皮肤素来源的缺点:首先、来源广泛，各个家庭、诸多的禽蛋加工厂都能产生大量的蛋壳;其次、蛋壳基质的提取很环保、不会像动物组织一样容易引起细菌滋生、腐败变质;第三、本技术产品来自动物的自然组织，分子量一致性稳定，且无内毒素。
【附图说明】
[0026]无。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0028]禽类蛋壳经提取技术(见专利申请号201510710364.3)处理后可获得3种类型有机基质:酸不溶性基质(占总基质70.4%),水不溶性基质(占总基质20.6 % )、水溶性基质(占总基质9%)。在本技术方案中，这3种有机基质可以合并后提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素，也可以根据需要单独用于提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素;后续技术流程一致。本发明所述的禽类蛋壳包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、孔雀、鹌鹑、鸟类等的蛋壳。本发明所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法(含酶消化蛋白质、提取总糖胺聚糖、去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸)也适用于其它动物组织(脱脂、脱矿或无脂、无矿的动物组织材料)中硫酸软骨素/硫酸皮肤素的提取。
[0029]将蛋壳基质冷冻干燥I?5天、或20?90度烘干I?5天;之后用粉碎仪或超细粉碎仪进行粉碎。
[0030]从蛋壳基质中分离、提取总糖胺聚糖:
[0031 ]首先，将蛋壳基质粉末悬浮于含O?0.6 % SDS(十二烷基磺酸钠)的I3BS(磷酸盐缓冲液，pH 7?11)中，蛋壳基质与PBS质量比为1:10?80。其次，用广谱性链霉蛋白酶(Actinase E)于37?39°C水浴处理12?28小时以降解蛋壳基质中的蛋白质，酶与蛋壳基质质量比1:2?50，之后90?95°C水浴灭活Actinase E 10?30分钟；再次，用蛋白酶K于53?56°C水浴处理上述消化液6?24小时以进一步降解蛋壳基质中残余的蛋白质和链霉蛋白酶，酶与蛋壳基质质量比1:20?100，或者用碱性蛋白酶(alcalase)于53?63°C水浴处理6?24小时以进一步降解蛋壳基质中残余的蛋白质和链霉蛋白酶，酶与蛋壳基质质量比I: 30?100;最后90?100°C水浴灭活蛋白酶K或碱性蛋白酶(alcalase) 10?40分钟。
[0032]提取总糖胺聚糖:
[0033]用悬浮桶转子3200?SOOOxg离心力离心上述蛋白消化后样品，取上清液;之后任选以下两种方法提取总糖胺聚糖:
[0034]A、将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H强效阴离子交换柱(或往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800，结合过夜，以充分结合总糖胺聚糖，上清液与树脂体积比为5?80:1)，然后用0.1?0.5M的NaCl洗涤阴离子交换柱或阴离子交换树脂以充分洗掉杂蛋白或其它杂质，最后用3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液;之后，或者用截留量3?1kDa的超滤管或透析袋脱盐去除NaCl获得总糖胺聚;或者先用2?5倍体积的甲醇加入总糖胺聚糖盐溶液，-20?8°C沉淀总糖胺聚糖12?18小时，用固定角转子15000?30000xg离心力离心去除含盐上清，之后用体积浓度95%甲醇连续洗涤总糖胺聚糖沉淀3遍，最后将总糖胺聚糖冻干或空干。所得的总糖胺聚糖含有硫酸软骨素/硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸角质素、以及肝素/硫酸乙酰肝素。
[0035]B、直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每10mL上清液中含0.01?0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后2?8°C放置过夜以充分沉淀总糖胺聚糖，于2?20 °C用固定角转子15000?30000xg离心力离心去除含盐上清液，然后用含5?20%乙酸钾的70?95%乙醇洗涤沉淀3遍，再用无乙酸钾的70?95%乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖。所得的总糖胺聚糖含有硫酸软骨素/硫酸皮肤素、透明质酸、硫酸角质素、以及肝素/硫酸乙酰肝素。
[0036]去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸:
[0037]将上述总糖胺聚糖溶解于水或50mM Tris.HCl缓冲液(该缓冲液的pH 7?9;Tris: Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三轻甲基氨基甲烧)中，加入肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶II1、角质素酶II以及透明质酸酶，每微克总糖胺聚糖中上述酶用量分别为0.01?0.15mU、0.1 ?lmU、0.5?3mU、0.01?0.3mU 和0.01?0.151111]，于37°(:反应12?24小时；将上述反应液循环两遍加入Vivapure Q Max H强效阴离子交换柱(或往反应液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800，结合过夜，以充分结合硫酸软骨素/硫酸皮肤素，反应液与树脂体积比为5?80:1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl洗涤阴离子交换柱或阴离子交换树脂以充分洗掉结合不紧密的杂质(如肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、透明质酸降解后的碎片或者蛋白质)，最后用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液;随后，或者用截留量3?1kDa的超滤管或透析袋脱盐获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素;或者先用2?5倍体积的甲醇加入硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液，-20?8°C静置12?18小时以沉淀硫酸软骨素/硫酸皮肤素，用固定角转子15000?30000xg离心力离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70?95v%甲醇连续洗涤硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀3遍，最后将硫酸软骨素/硫酸皮肤素冻干或空干。
[0038]本发明中的VivapureQ Max H强效阴离子交换柱，也可以选用其它类型的强效阴离子交换柱;类似地，强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800，也可以选用其它类型的强碱性阴离子交换树脂。
[0039]注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。
【主权项】
1.一种硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，包括: Si，将蛋壳基质干燥后粉碎，获得蛋壳基质粉末； S2，将所述蛋壳基质粉末悬浮于磷酸盐缓冲液PBS中，其中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7?11，且含有O?0.6wt%的十二烷基磺酸钠，所述蛋壳基质粉末与磷酸盐缓冲液的质量比为1:10?80; S3，在步骤S2所获得的悬浮液中加入链霉蛋白酶?Actinase E，并保持反应温度为37?39°C，处理12?28小时以降解所述蛋壳基质粉末中的蛋白质； S4，将步骤S3中的链霉蛋白酶?Actinase E灭活； S5，将步骤S4中获得的产物用蛋白酶K或碱性蛋白酶?alcalase在53?56°C温度下处理6?24小时以进一步降解所述蛋壳基质粉末中残余的蛋白质以及灭活的链霉蛋白酶?Actinase E； S6，将步骤S5中的蛋白酶K或碱性蛋白酶?alcalase灭活； S7，将步骤S6所获得的产物离心分离，获取上清液； S8，从步骤S7获得的上清液中提取总糖胺聚糖； S9，将从步骤S8获得的总糖胺聚糖溶解于水或50mM Tris (Tris(hydroxymethy I)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷).HCl缓冲液，其中，所述缓冲液的pH为7?9;然后加入肝素酶1、肝素酶I1、肝素酶II1、角质素酶以及透明质酸酶于37°C反应12?24小时以降解总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及透明质酸； S10，从步骤S9获得的产物中加入强效阴离子交换柱，或加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5?80:1;之后用0.1?0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以去除酶解后的糖链碎片或其它杂质，再用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液;随后，或者用截留量为3?1kDa的超滤管或透析袋脱盐获得硫酸软骨素/硫酸皮肤素;或者先用2?5倍体积的无水甲醇加入硫酸软骨素/硫酸皮肤素盐溶液，在-20?8°C沉淀12?18小时，离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70?95v%甲醇洗涤硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀;最后冻干或空干获得最终产物硫酸软骨素/硫酸皮肤素。2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，所述将蛋壳基质干燥的步骤为:将所述蛋壳基质冷冻干燥I?5天，或将所述蛋壳基质在20?90°C烘干I?5天。3.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，所述链霉蛋白酶?Actinase E与所述蛋壳基质粉末的质量比为1:2?50。4.根据权利要求3所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，在步骤S4中，所述将步骤S3中的链霉蛋白酶?Actinase E灭活的步骤包括:将步骤S3获得的产物在90?95°C加热处理10?30分钟。5.根据权利要求4所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，步骤S5中，所述蛋白酶K与所述蛋壳基质粉末的质量比为1:20?100，所述碱性蛋白酶与所述蛋壳基质粉末的质量比1:30?100。6.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，在步骤S6中，所述将步骤S5中的蛋白酶K或碱性蛋白酶灭活的步骤包括:将步骤S5获得的产物在90?100°(:加热处理10?40分钟。7.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，在步骤S7中，所述将步骤S6所获得的产物离心分离通过悬浮桶转子3200?SOOOxg离心力实现。8.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，步骤S8包括:将所述上清液加入强效阴离子交换柱，或往所述上清液中加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5?80:1;之后用0.1?0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以充分洗掉杂蛋白或其它杂质，随后用3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液;之后，或者用截留量为3?1kDa的超滤管或透析袋去除NaCl获得总糖胺聚糖;或者先用2?5倍体积的甲醇加入总糖胺聚糖盐溶液，在-20?8°C温度下沉淀总糖胺聚糖12?18小时，然后离心去除含盐上清，之后用体积浓度95%甲醇连续洗涤沉淀3遍;将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖。9.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，步骤S8包括:往所述上清液中加入氯化十六烧卩比啶，使每10mL所述上清液中含0.01?0.5g氯化十六烧吡啶;混匀后在2?8°C放置过夜以充分沉淀总糖胺聚糖;然后在2?20 °C温度下用固定角转子15000?30000xg离心力离心去除上清液;再用含5?20wt%Z酸钾的70?95￥%乙醇洗涤沉淀，之后用无乙酸钾的70?95v%乙醇洗涤沉淀，空干沉淀获得所述总糖胺聚糖。10.根据权利要求1所述的硫酸软骨素/硫酸皮肤素提取方法，其特征在于，每微克总糖胺聚糖中所述肝素酶1、所述肝素酶I1、所述肝素酶II1、所述角质素酶以及所述透明质酸酶的用量分别为 0.01?0.15mU、0.1?lmU、0.5?3mU、0.01?0.3ml^P0.01?0.15mU。
【文档编号】C12P19/26GK105821097SQ201610266200
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】刘长国, 赵红娟
【申请人】刘长国