自絮凝发酵生产α-熊果苷的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种制备α-熊果苷的新型发酵法——自絮凝法。本发明采用野油菜黄单胞菌发酵生产α-熊果苷，当菌株接种到摇瓶培养时能在4~8小时内自絮凝形成毫米级颗粒，并在之后的放大培养中保持颗粒形态生长，实现了该菌株在发酵液中的固定化，从而减少后期处理过程，无需离心分离菌体，能够降低α-熊果苷的生产成本。采用本发明生产的α-熊果苷产量高，产品能够抑制黑色素的产生和沉积，去除色斑，在浓度较低时有效抑制酪氨酸酶活性。CCTCCNO: M 201246420121120
【专利说明】
自絮凝发酵生产a-熊果苷
技术领域
[0001] 本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种制备a -熊果苷的新型发酵法：自絮 凝法。
【背景技术】
[0002] 熊果苷(Arbutin)最早来源于天然绿色植物，取自越橘科植物熊果（Bearberry) 的叶子，在梨、小麦等植物中也有发现。它能够迅速渗入肌肤，能有效地抑制皮肤中酪氨酸 酶的活性，阻断多巴及多巴醌的合成，从而遏制黑色素的生长，在减少皮肤色素沉积、祛除 色斑和雀斑的同时，对黑色素细胞不产生毒性、刺激性、致敏性等副作用，因而被用于化妆 及保养品中。另外，熊果苷也有利尿、润肤与杀菌的功能，也被用于尿路消毒药、烧烫伤药及 肠道消炎药中。
[0003] 熊果苷根据其结构可分为a型和0型，两者均能抑制酪氨酸酶以达到美白的效 果，但a -熊果苷的效果比0 -熊果苷高出十倍，安全性也比0 -熊果苷高。a -熊果苷的 化学名为4-羟苯基-a -D-吡喃葡萄糖苷，一般通过不同的微生物的酶进行糖转移反应将 葡萄糖和氢醌结合形成a-熊果苷，但随着对a-熊果苷研究的深入发现，采用酶法合成更 具优势。
[0004] 目前，国内对于生物法合成a -熊果苷多采用悬浮发酵，生产后期需要对发酵液 进行离心分离，因此生产过程耗时较长，生产成本也较高。采用自絮凝法可实现菌株在发酵 液中的固定化，免去了后期的离心分离，缩短生产时间，降低生产成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于通过采用自絮凝发酵实现菌株发酵固定化，从而降低生产时间 和成本。它采用a-熊果苷产率高的野油菜黄单胞菌，选用合适的培养基和培养条件，使菌 株自絮凝在发酵液中生产a -熊果苷，发酵液通过打孔吸附树脂柱的分离纯化，即可得到 高纯度的a-熊果苷。本工艺具有操作简单，无需离心分离，生产成本低等优点。
[0006] 本发明整体技术构思： 自絮凝发酵生产a-熊果苷的工艺步骤： (1) 将野油菜黄单胞菌菌种接种到试管中的斜面培养基 制成斜面菌种； (2) 将斜面菌种扩大培养作为种子液； (3) 种子液接入200ml发酵培养基中培养； (4) 加入反应物对苯二酚和蔗糖； (5) a-熊果苷的分离纯化。
[0007] 工艺条件：步骤（1)中斜面培养基成分：蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母 粉2. 0-3. 5份、硫酸镁0. 5份、磷酸氢二钾2. 0份、氯化钠2. 0份、琼脂15-20份和水1000 份。工艺条件：pH值为7. 0-8.0、温度25-35°C、培养时间为24-48小时。野油菜黄单胞菌 (Xanthomonas campestris) CCTCCNO: M 2012464〇
[0008] 步骤（2)、（3)中种子液和发酵液成分：蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、牛肉膏3 份、酵母膏1份、硫酸镁〇. 5-1. 0份、碳酸钙2份和水1000份。工艺条件：种子液接种量为 5-10%，pH值为7. 0-7. 8,培养温度为30-35°C，通风量为0. 4-0. 6vvm，搅拌转速为150-200 转/分钟，培养时间为24-36小时。
[0009] 步骤（4)中的流程为冷冻步骤（3)中的培养液，在6000-8000转/分钟下离心 20-25分钟，收集菌体；用磷酸盐缓冲液洗涤菌体2-3次，低温超声破碎，于6000-8000转/ 分钟下离心20-25分钟，取上清液即为粗酶液。
[0010] 步骤（4)中的工艺条件：反应物对苯二酚物质量浓度为40mmol/L，蔗糖物质量浓 度为150-180mmol/L，两者加入的摩尔比为30:1，反应温度为35-40°C，反应时间为36-48小 时，搅拌转速为160-180转/分钟。
[0011] 步骤（5 )中分离纯化过程： s.自絮凝酶沉淀分离； b. 将经过a步骤后的反应产物通过弱极性大孔吸附树脂柱(AB-8柱）进行脱色(静置 吸附1. 5~2小时)，产物变成无色透明液体； c. 把经过b步骤的反应产物通过极性大孔吸附树脂柱（S-8柱）进行分离纯化； d. 把经过c步骤的反应产物真空干燥，即可得到纯度为98%以上的a -熊果苷，真空 干燥真空度为〇. IMPa，温度为65度。
[0012] 本发明所用的生物材料野油菜黄单胞菌CCTCCNO: M 2012464已经在中国典 型培养物保藏中心保藏，具有如下特征：保藏分类名：野油菜黄单胞菌Xccl635 Rif" / Xanthomonas campestris Xccl635 Rifr;保藏编号：CCTCCNO: M 2012464;保藏日期：2012 年11月20号；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉大学、菌种 保减中心。
[0013] 本发明所取得的技术进步在于:采用了自絮凝法制备a _熊果苷，而非悬浮发酵， 分离纯化是无需离心，缩短了生产时间，降低了生产成本。
【具体实施方式】 [0014] :下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但这里要指明，本 发明并不局限于实施例的范围。
[0015] 实施例： 一种自絮凝发酵生产a -熊果苷的方法，包含以下步骤： (一）a -熊果苷的制备： ①斜面种子培养：配置斜面培养基(蔗糖5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 2%、硫酸镁0. 05%、磷 酸氢二钾〇? 2%、氯化钠0? 2%、琼脂2%，pH7. 0,高压灭菌)，将野油菜黄单胞菌 ca尊接种到斜面培养基上，在35°C下培养36小时。
[0016] ②种子液培养：用接种环挑取菌种，接种于50ml基本发酵液的250ml三角摇瓶 中，在35°C摇床上，以160转/分钟振荡30小时。基本发酵液：蔗糖5%、蛋白胨1%、牛肉膏 0. 3%、酵母膏0. 1%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 2%。
[0017] ③将接种量为8%的种子培养液加入装有200ml基本发酵液的500ml三角摇瓶 中，在35°C摇床上，以180转/分钟振荡30小时。
[0018] ④向自絮凝的酶液中加入摩尔比为1:30的蔗糖和对苯二酚，蔗糖的浓度为 150mmol/L，对苯二酚的浓度为40mmol/L，将混合物置于40°C的摇床上振荡48小时，转速为 170转/分钟，得反应产物。
[0019] (二）a-熊果苷的分离纯化： ①菌体自行沉淀分离，过滤得清液。
[0020] ②反应产物加载于弱极性大孔吸附树脂AB-8柱，静置2小时后洗脱，产物变成无 色透明液体。
[0021] ③上述步骤中的反应产物加载于极性大孔吸附树脂S-8柱。
[0022] ④上述步骤中的反应产物经真空干燥形成白色粉状物，真空干燥的条件： 0. lMPa,65°C。
[0023]
【附图说明】： 图1 :野油菜黄单胞菌发酵液自絮凝效果图。
[0024] 图A :发酵刚结束时，菌体在发酵液中的形态，形成悬浮液体。
[0025] 图B :15分钟后，菌体发生自絮凝，95%以上菌体沉降在液体底部。
【主权项】
1. 自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于： (1) 将野油菜黄单胞菌（XafliAomwas 接种到摇瓶培养时，可在4~8小时 内自絮凝形成毫米级的颗粒，并在之后的放大培养中保持颗粒状态生长； (2) 该菌株在发酵液中实现了固定化； (3) 后期处理时，自絮凝的菌株可以迅速沉降，无需离心分离。2. 自絮凝发酵生产α-熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步骤组成： (1) 将野油菜黄单胞菌(XafliAomwas 菌种接种到试管中的斜面培养基 制成斜面菌种； (2) 将斜面菌种扩大培养作为种子液； (3) 种子液接入200ml发酵培养基中培养； (4) 加入反应物对苯二酚和蔗糖； (5) α-熊果苷的分离纯化。3. 根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步 骤组成：所述的（1)步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成，并附上工艺条件： 蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2. 0-3. 5份、硫酸镁0. 5份、磷酸氢二钾2. 0份、 氯化钠2. 0份、琼脂15-20份和水1000份；工艺条件：pH值为7. 0-8. 0、温度25-35°C、培养 时间为24-48小时。4. 根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺 步骤组成：所述的（2)、（3)步骤中的种子液、发酵液由下列重量份组分组成，并附上工艺条 件： 蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、牛肉膏3份、酵母膏1份、硫酸镁0. 5-1. 0份、碳酸钙2 份和水1000份，工艺条件：种子液接种量为5-10%，pH值为7. 0-7. 8,培养温度为30-35°C， 通风量为〇. 4-0. 6vvm，搅拌转速为150-200转/分钟，培养时间为24-36小时。5. 根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步 骤组成：所述的（4)步骤中的反应条件为： 冷冻步骤（3)中的培养液，在6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，收集菌体；用磷 酸盐缓冲液洗涤菌体2-3次，低温超声破碎，于6000-8000转/分钟下离心20-25分钟，取 上清液即为粗酶液。6. 根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步 骤组成：所述的（4)步骤中的反应条件为： 反应物对苯二酚物质量浓度为40mmol/L，蔗糖物质量浓度为150-180mmol/L，两者加 入的摩尔比为30:1，反应温度为35-40°C，反应时间为36-48小时，搅拌转速为160-180转 /分钟。7. 根据权利要求2所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步 骤组成：所述的（5)步骤中的分离纯化包括以下几个步骤： 自絮凝酶沉淀分离； b. 将经过a步骤后的反应产物通过弱极性大孔吸附树脂柱进行脱色； c. 把经过b步骤的反应产物通过极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化； d. 把经过c步骤的反应产物真空干燥，即可得到α-熊果苷。8. 根据权利要求7所述的自絮凝发酵生产α -熊果苷的方法，生产过程由下列工艺步 骤组成：所述的b步骤中的弱极性大孔吸附树脂柱为ΑΒ-8柱，反应产物需静置1. 5-2小时； c步骤中的极性大孔吸附树脂柱为S-8柱；d步骤中的真空干燥真空度为0.1 MPa，温度为65 度，干燥后的成品纯度大98%以上。9. 本发明所用菌种的生物材料来源于中国典型培养物保藏中心，具有如下特征：保藏 分类名：野油菜黄单胞菌 Xccl635 Rifr /Xanthomonas campestris Xccl635 Rifr;保藏编 号：CCTCCNO: M 2012464 ;保藏日期：2012年11月20号；保藏单位：中国典型培养物保藏 中心；保藏单位地址：中国、武汉大学、菌种保藏中心。
【文档编号】C12R1/64GK105821098SQ201510002687
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】陈礼明, 王璐
【申请人】陈礼明