发酵法工业化生产l-羟脯氨酸的发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵工艺，具体涉及发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工
-H-
O
【背景技术】
[0002]轻脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸轻基化后的产物，其分子式为C5H9NO3t3羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274°C，易溶于水，微溶于乙醇。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
[0003]目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4%-7 %，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。
[0004]目前，微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是发酵工艺对于L-羟脯氨酸的发酵水平、生产成本和三废排放有着至关重要的影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种发酵法工业化生产L-轻脯氨酸的发酵工艺。
[0006]本发明所采取的技术方案:
[0007]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，包括以下步骤:(I)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸。
[0008]其中成熟种子的培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15-0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌:液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90°C，直接蒸汽加热到121°C，0.1MPa压力保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36°C待接种；④接种:采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36°C，pH7.0?9.0，压力
0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95%乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05?0.1MPa，接种量I瓶，接种结束后，用浸过75 %乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养:培养温度36°C、罐压
0.03MPa、风量0.2?1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200?600rpm、溶氧20%以上、培养时间8?24小时、OD6QQ达到10?20、最终葡萄糖含量小于10g/L。
[0009]其中发酵培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15?0.1710^压力、温度128°(3灭菌30分钟；②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95?105°C，直接蒸汽加热到121°C，压力0.IMPa，保温10分钟，冷却降温至35°C，调pH到6.5，备接种;③接种:米用压差法将种子液压入罐内培养;④培养:培养温度35°C，罐压0.03MPa，风量
0.5?1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60?300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30?90g/L、糖浓度S 2.0 % ;⑤发酵结束后，发酵液加热至80°C，立即降温至40°C，用压缩空气压至发酵液贮罐；
[0010]其中液体培养基的水溶液配方(g/L)为:葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾 7.5、氯化钾 1.9、FeS04.7H20 0.28,MgSO4.7H20 0.32、微量元素(ppm):MnS04.H2O
0.5、CoC12.6H2O 1.4、NiS04.6H2O 1.2^CuSO4.7H200.5^ZnSO4.7H20 0.6、VB120、消泡剂100、AMP 500
[0011]其中发酵培养基配方(g/L)为:葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾 1.9、MgS04.7H20 0.32、FeS04.7H20 0.75、微量元素(ppm):MnS04.H2O 1.0、C0CI2.6H2O 1.4、NiS(k.6H2O 1.4、CuS04.7H20 1.ZnSO4.7H20 I.2、消泡剂 200、AMP50 0
[0012]其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备方法为:取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种I瓶，加入无菌生理盐水50ml，刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
[0013]本发明的发酵工艺应用于微生物发酵生产L-羟脯氨酸，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0015]实例I
[0016]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，首先菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；
[0017]其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为:葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾 7.5、氯化钾 1.9、FeS04.7H20 0.28 ^MgSO4.7H20 0.32、微量元素(ppm):MnS〇4.H2O0.5、CoC12.6H2O 1.4、NiS04.6H2O 1.2^CuSO4.7H20 0.5^ZnSO4.7H20 0.6、VB120、消泡剂100、AMP 500
[0018]其中发酵培养基配方(g/L)如下:葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾
5.0、氯化钾1.9、]\%504*7!120 0.32^FeSO4.7H20 0.75、微量元素(ppm):MnS04.H2O 1.0、C0CI2.6H2O 1.4、NiS04.6H2O 1.4、CuS04.7H201.0、ZnS04.7H20 I.2、消泡剂200、AMP 50。
[0019]其中成熟种子的培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15MPa，保压30分钟;②实罐灭菌:液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90°C，直接蒸汽加热到121°C，0.1MPa压力保温10分钟;③冷却:灭菌完毕冷却降温至36°C待接种;④接种:采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36°C，pH7.2，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95%乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头插入接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压至0.05MPa，接种量I瓶，接种结束后，用浸过75%乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养:培养温度36°C、罐压0.03MPa、风量0.2?
1.0VVM、pH6.5、搅拌转速200rpm、溶氧20 %以上、培养时间12小时、OD6qq达到12、最终葡萄糖含量2g/L。
[0020]其中发酵培养包括以下步骤:①空罐灭菌:0.15MPa压力、温度127°C灭菌30分钟；②实罐灭菌:发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95°C，直接蒸汽加热到121°C，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35°C，调pH到6.5，备接种;③接种:采用压差法将种子液压入罐内培养;④培养:培养温度35°C，罐压0.03MPa，风量0.5?1.0VVM，口册.5，搅拌转速180印111，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在438/1、糖浓度0.5%;?发酵结束后，发酵液加热至80°C，立即降温至40°C，用压缩空气压至发酵液贮罐。
[0021]其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备:取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种I瓶，加入无菌生理盐水50ml，刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
[0022]实例2
[0023]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；
[0024]其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为:葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾 7.5、氯化钾 1.9、FeS04.7H20 0.28 ^MgSO4.7H20 0.32、微量元素(ppm):MnS〇4.H2O
0.5、CoC12.6H2O 1.4、NiS04.6H2O 1.2^CuSO4.7H20 0.5^ZnSO4.7H20 0.6、VB120、消泡剂100、AMP 500
[0025]其中发酵培养基配方(g/L)如下:葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾
5.0、氯化钾1.9、]\%504*7!120 0.32^FeSO4.7H20 0.75、微量元素(ppm):MnS04.H2O 1.0、C0CI2.6H2O 1.4、NiS04.6H2O 1.4、CuS04.7H201.0、ZnS04.7H20 I.2、消泡剂200、AMP 50。
[0026]其中成熟种子的培养包