栝楼瓤微生物发酵提取l-瓜氨酸的方法
【专利摘要】本发明公布了一种栝楼瓤提取L-瓜氨酸的方法，属于中药化学【技术领域】。该方法包括接入乳酸菌发酵、过滤、吸附交换、浓缩、结晶得到L-瓜氨酸。本方法结合了发酵法和酶法，使栝楼瓤中的L-精氨酸在乳酸杆菌产生的脱亚氨酶的作用下转化为L-瓜氨酸，使收率有很大程度的提高，整个分离过程中不加入任何有害溶剂，所得产品天然安全，有利于展开保健品及药品方面的开发研究。
【专利说明】栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取L-瓜氨酸的方法，特别涉及一种栝楼瓤提取L-瓜氨酸的方法，属于中药化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]瓜氨酸最早发现于野西瓜叶子中，是一种非必需氨基酸。L-瓜氨酸具有较强的抗氧化作用，能有效清除人体内的自由基。西瓜中的L-瓜氨酸被誉为“绿色伟哥”，可有效提高男性性欲，促进男性生殖生育能力，维护男性正常的生殖健康。瓜氨酸还具血管扩张作用，对心血管系统具有良好的保健作用。此外，瓜氨酸能有效的改善人体的抗疲劳能力，增强人体的肌肉强度，提高体能，在运动保健方面具有良好的作用。目前国外已经利用西瓜中提取的L-瓜氨酸或者其它方法生产者的L-瓜氨酸相继开发出了诸如美国天然维他命公司的Stimulin产品和HERBALIFE公司的夜宁新等产品，分别用于男性性功能和心血管系统保健。目前生产瓜氨酸的方法主要是发酵法、酶法、合成法和提取法。发酵法和酶法生产的L-瓜氨酸目前是市场上L-瓜氨酸的主要生产方式，这些方法均存在着瓤中L-精氨酸转化率不高、工艺复杂、环境不友好等缺陷。
【发明内容】
[0003]本发明为提供一种栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法。
[0004]本发明所提供的一种栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，以鲜栝楼瓤为原料，包括以下步骤:
(a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌，在温度18— 35°C发酵15-40天生物转化后灭菌，过滤后得到滤液；
(b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤，得到纳滤透过液；
(c)将纳滤透过液调节PH值至5.0-3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸；
(d)交换吸附完毕后，用氨水对离子交换柱进行等度洗脱，，洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性；
(e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色；
(f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶，过滤干燥后得到瓜氨酸。进一步的，步骤(b)中将步骤(a)所得滤液先用微滤膜，再用超滤膜分别进行错流膜过滤，得到超滤清液，其中微滤膜的孔径为0.1—1.0微米，超滤膜的孔径为10000—4000分子量，将所得超滤清液先用截留分子量为50—80反渗透膜浓缩脱水，然后用截留分子量为1000—500纳滤膜过滤，得到纳滤透过液，进一步的，步骤(d)中交换吸附完毕后，用0.1-1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱，洗脱流速为0.5-1.0BV/h，进一步的，将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶，得到纯天然瓜氨酸，进一步的，微滤膜孔径为0.2微米的管式膜，超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜，进一步的，所述反渗透膜的截留分子量为60，纳滤膜截留分子量为600，纳滤膜过滤流量为45升/分，压力1.5MPa，得到纳滤透过液，进一步的，所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
[0005]本发明所使用的方法，结合了发酵法和酶法，使栝楼瓤中的L-精氨酸在乳酸杆菌产生的脱亚氨酶的作用下转化为L-瓜氨酸使收率有很大程度的提高，本方法以栝楼瓤发酵液为提取原料，通过发酵、灭菌过滤、膜澄清、膜分离和离子交换树脂分离等清洁的生产方式，在原料和生产工艺的安全性收率上都有明显的优势，分离过程中采用了微滤、超滤、反渗透、纳滤联用的技术，显著降低了工艺的能耗与时间并有效的提高了终端产品的产品质量，所得瓜氨酸纯度高。一次分离可使瓜氨酸的纯度达到80%以上,经纯化后纯度可达到98.5%—99.9%。产品性状好:整个分离过程中不加入任何有害溶剂，所得产品天然安全；得到的L-瓜氨酸在食品、保健品和药品开发上，具有明显的安全性优势，有利于展开保健品及药品方面的开发研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1是本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0007]为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例，这些实施实例仅仅是对本发明的阐述，不限制本发明的范围。本发明中的栝楼瓤，采用河南、河北、山东等地区的栝楼瓤均可适用于本工艺。
[0008]栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，以鲜栝楼瓤为原料，包括以下步骤:
(a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌，在温度18— 35°C发酵15-40天生物转化后灭菌，过滤后得到滤液；
(b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤，得到纳滤透过液；
(c)将纳滤透过液调节PH值至5.0-3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸；
(d)交换吸附完毕后，用氨水对离子交换柱进行等度洗脱，，洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性；
(e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色；
(f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶，过滤干燥后得到瓜氨酸。
[0009]进一步的，步骤(b)中将步骤(a)所得滤液先用微滤膜，再用超滤膜分别进行错流膜过滤，得到超滤清液，其中微滤膜的孔径为0.1 — 1.0微米，超滤膜的孔径为10000—4000分子量，将所得超滤清液先用截留分子量为50—80反渗透膜浓缩脱水，然后用截留分子量为1000— 500纳滤膜过滤，得到纳滤透过液。
[0010]进一步的，步骤(d)中交换吸附完毕后，用0.1 — 1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱，洗脱流速为0.5-1.0BV/h，进一步的，将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶，得到纯天然瓜氨酸。
[0011]进一步的，微滤膜孔径为0.2微米的管式膜，超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜。进一步的，所述反渗透膜的截留分子量为60，纳滤膜截留分子量为600，纳滤膜过滤流量为45升/分，压力1.5MPa，得到纳滤透过液。
[0012]进一步的，所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
[0013]进一步的，所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯系大孔型或凝胶型树脂。
[0014]进一步的，步骤(C)中，上柱流速为l_2BV/h，树脂预处理成氢型，PH值为5，柱床的长径比为4一2:1。
[0015]进一步的，在上述步骤(e)中，减压浓缩的温度为40°C—80°C，优选50°C。
[0016]进一步的所述低分子有机醇或低分子有机酸的浓度为90-100%，为与水的溶液。
[0017]实施例:
1、切分:将2公斤鲜栝楼用水清洗干净后，再用切碎机切碎；
2、皮瓤籽分离:用胶棒软分离机和两道分离机组进行一次和二次分离，使皮和瓤和籽彻底分开；
3、发酵:栝楼瓤中接入0.2% — 0.3%的乳酸杆菌，密闭发酵18天；
4、分离:发酵结束升温至70°C，灭菌1.5小时，过滤；
5、澄清:将滤液合并，依次过0.2微米的微滤膜和5000分子量超滤膜澄清，微滤膜可采用KOCH公司生产的4.3’ SuperCorHFMl80管式膜元件，超滤膜可采用8338卷式膜元件，进料的流量为100升/分，过滤压力为1.5MPa，先后除去固形不溶物和大分子类杂质，得到超滤清液；
6、纳滤:超滤清液先用截留分子量为60的反渗透膜脱水，再用截留分子量为600的纳滤膜浓缩，流量为45毫升/分，压力1.5MPa，得到纳滤透过液；
7、PH值调节:纳滤透过用氨水调节PH值至3.5 ；
8、上柱:将D61大孔型强酸性阳离子交换树脂预处理成氢型，PH为5，柱床的长径比为4:1,将调节好的PH为3.5的滤液以2BV/h流速上柱，使之全部通过2升阳离子交换树脂后，用2升水洗树脂柱，BV/h指单位时间水或液体中一个质点移动的距离；
9、洗脱:用1.0N氨水等度洗脱，洗脱剂流速lBV/h，洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性，收集茚三酮反应阳性部分约2升；
10、浓缩:将洗脱液用单效降膜蒸发器减压浓缩至1/3体积，浓缩温度采用60°C；
11、脱色:将浓缩液用活性炭脱色，使浓缩液无色；
12、结晶:在脱色液中加入质量浓度为90%的乙醇析晶，经高效液相检测，得到L-瓜氨酸白色结晶产品，过滤干燥后得到瓜氨酸含量为85.5%的产品，产率为栝楼瓤重量的1.5% ；
13、精制:将上述85.5%瓜氨酸产品用水溶解后，再用95%乙醇重结晶，得到98.5%的纯度瓜氨酸。
[0018]鉴别所得产品是瓜氨酸的方法如下:
取白色结晶广品0.1克加水定溶到100晕升；
1、取上述溶液5ml，加入1ml，1%茚三酮溶液，水浴加热3分钟，产生紫红色；
2、取上述溶液2ml，加入4ml浓盐酸和0.5ml，3% 二乙酰一肟加热，产生桔黄色；
3、取上述溶液2ml，加入1ml于10ml乙醇中含有2%的对二甲替基苯甲醛混合溶液，和1ml浓盐酸，产生黄绿色；
依次通过上述三种方法，可鉴别得到所制得的产品为瓜氨酸。经检测:产品的熔点为201.2— 202.0 ;旋光率24.9°，而L-瓜氨酸的熔点为201_203°C ;旋光率[a]D2°+24.5—+26.5° (8克/100毫升6NHCL)，因此，通过本发明方法制得的产品是L-瓜氨酸。
[0019]瓜氨酸含量测定方法:
由于L-瓜氨酸无紫外吸收和荧光发射特性，因此要提高L-瓜氨酸分析检测的灵敏度和分离选择特性，通常将L-瓜氨酸衍生后进行定量分析。本发明中采用的就是上述方法测定从天然西瓜中提取制得的L-瓜氨酸含量，采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化法J，将L-瓜氨酸衍生后用HPLC进行定量分析。具体方法如下:
衍生化方法:精密称取瓜氨酸标准品0.0500g，用去离子水溶解并定容(定容到25ml)。准确吸取配好的标准品1ml，放入1ml棕色容量瓶中，加入配制好的Na⑶3_NaHC03缓冲液Iml ( 0.5mol/l、PH为9.0)，再加入Iml的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液后摇匀，60°C水浴加热Ih后，用K2HP04-KH2P04缓冲液定容至1ml (0.lmol/l、PH为7.0)，样品溶液的衍生化方法与标准品基本相同，只是将Iml的标准品换为Iml的样品溶液。
[0020]分析方法:使用大连依利特公司C-18色谱柱(250mm*4.6mm),流动相A为乙腈水B为含N，N- 二甲基甲酰胺的0.05mol/lNaAC-HAC缓冲溶液，进样量5ul.A:B=25%: 75%，流速lml/min。
[0021]在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
【权利要求】
1.栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，以鲜栝楼瓤为原料，其特征在于:包括以下步骤: (a)将鲜栝楼瓤接入乳酸杆菌，在温度18— 35°C发酵15-40天生物转化后灭菌，过滤后得到滤液； (b)将滤液微滤、超滤、脱水、纳滤，得到纳滤透过液； (c)将纳滤透过液调节PH值至5.0-3.0后通入大孔型强酸性阳离子交换树脂柱交换吸附氨基酸； (d)交换吸附完毕后，用氨水对离子交换柱进行等度洗脱，洗脱终点为洗出液茚三酮反应为阴性； (e)将洗脱液浓缩、脱氨、脱色； (f)浓缩液用低分子有机醇或低分子有机酸结晶，过滤干燥后得到瓜氨酸。
2.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:步骤(b)中将步骤(a)所得滤液先用微滤膜，再用超滤膜分别进行错流膜过滤，得到超滤清液，其中微滤膜的孔径为0.1-1.0微米，超滤膜的孔径为10000— 4000分子量，将所得超滤清液先用截留分子量为50— 80反渗透膜浓缩脱水，然后用截留分子量为500—1000纳滤膜过滤，得到纳滤透过液。
3.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:步骤Cd)中交换吸附完毕后，用0.1-1.0N氨水对离子交换柱进行等度洗脱，洗脱流速为0.5-1.0BV/ho
4.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:将步骤f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有机醇或低分子有机酸重结晶，得到纯天然瓜氨酸。
5.根据权利要求2所述的从植物组织发酵液中提取L-瓜氨酸的工业方法，其特征在于:所述的微滤膜孔径为0.2微米的管式膜，所述的超滤膜孔径为5000分子量的卷式膜。
6.根据权利要求2所述的从发酵液中提取L-瓜氨酸的工业方法，其特征在于:所述反渗透膜的截留分子量为60，纳滤膜截留分子量为600，纳滤膜过滤流量为45升/分，压力1.5MPa,得到纳滤透过液。
7.根据权利要求1所述的栝楼瓤微生物发酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:所述的低分子有机醇为甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有机酸为甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
【文档编号】C07C273/18GK104418774SQ201310411791
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】杨保成, 谢书轩 申请人:安阳天尊生物工程有限公司