以酵母粉代替玉米浆发酵提高钝齿棒杆菌的l-精氨酸生产能力的方法
【专利摘要】本发明提供一种以酵母粉代替钝齿棒杆菌( Corynebacterium crenatum )发酵培养基中玉米浆组分进行发酵提高L-精氨酸产量的方法，属于生物【技术领域】。分别考察不同浓度酵母粉及玉米浆对钝齿棒杆菌生长及积累L-精氨酸的影响，玉米浆的最适添加浓度为25 g/L，酵母粉的最适添加浓度为10 g/L，发酵96 h后，酵母粉较玉米浆的添加发酵，L-精氨酸产量提高29.5%，生物量降低8.5%，单位菌体L-精氨酸产量提高40.8%，用酵母粉代替玉米浆有利于L-精氨酸的积累。同时，由于酵母粉成分相对稳定，不同批次发酵，L-精氨酸产量差异小。所以，用酵母粉代替玉米浆进行发酵，对于L-精氨酸生产菌株的发酵特性研究及L-精氨酸工业化生产具有重要意义。
【专利说明】以酵母粉代替玉米浆发酵提高钝齿棒杆菌的L-精氨酸生产能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明以酵母粉代替纯齿棒杆菌{Corynebacterium crenaturn)发酵培养基中玉米浆组分进行发酵产L-精氨酸的应用研究，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]L-精氨酸(L-Arginine)为半必须氨基酸，是尿素循环的重要中间代谢产物，因具有多种重要的生理功能而广泛应用于医药、食品及化工领域。微生物发酵法有节能环保、易提取分离等优点，具有重要的工业化应用价值。钝齿棒杆菌iCorynebacterium crenatum)SYPA5-5是本研究室经过多级诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，以葡萄糖为主要碳源，发酵大量积累L-精氨酸。
[0003]C.发酵生产L-精氨酸的培养基中需添加一定量的玉米浆，因其含有菌株生长所必须的多种营养元素而有利于菌株生长及L-精氨酸的积累。但由于不同批次玉米浆成分差异悬殊，即使同批次玉米浆由于搅拌等不均匀而造成组分分布差异较大，由此而导致L-精氨酸产量不稳定，批次差异大等问题。选择一种成分相对稳定，且有利于L-精氨酸积累的物质代替玉米浆进行发酵，对于L-精氨酸生产菌株的发酵特性研究及工业化生产具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种以酵母粉代替纯齿棒杆菌iCorynebacterium crena turn)发酵培养基中玉米浆组分进行发酵来提高L-精氨酸产量的方法。首先，考察不同浓度酵母粉及玉米浆对菌株生长及发酵积累L-精氨酸的影响，然后，比较最适酵母粉及玉米浆浓度下菌株发酵过程。本发明提供的方法属于基金项目:国家863资助项目(N0.2012AA022102)的研究内容。具体发明方案如下:
1.不同浓度酵母粉及玉米浆对菌株生长及发酵积累L-精氨酸的影响采用摇瓶分批发酵的方式对C.进行发酵,分别在发酵培养基中加入15、20、
25、30、35、40 (g/L)玉米浆及2、5、10、15、20、25 (g/L)酵母粉，发酵96 h，分别测定菌体生物量和L-精氨酸的产量。具体的方案如下:
(I)摇瓶种子培养:保存于斜面的C crmai?，划线到肉汤平板上，置于30 °C培养箱中培养24 h，挑取菌体，接种至摇瓶种子培养基中，置于30 V 120 rpm往复式摇床上培养12-16 h，至OD562nm约为15。肉汤培养基组分(g/L):葡萄糖20 ;蛋白胨10 ;牛肉膏10 ；酵母粉5 ；NaCl 5 ;琼脂粉20 ；pH 7.0?7.2 ；121 °C高压蒸汽灭菌20 min。种子培养基组分(g/L):葡萄糖 30 ;玉米浆 20 ； (NH4)2SO4 20 ；KH2PO4 I ；MgS04.7H20 0.5 ;尿素 1.5 ；pH7.0?7.2 ；121 °C高压蒸汽灭菌20 min。
[0005](2)摇瓶分批发酵:将培养好的种子按5%的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，置于30 V 120 rpm往复式摇床上培养96 h,发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖。摇瓶发酵培养基组分(g/L):葡萄糖(分消)100 ； (NH4)2SO4 50 ；KH2PO4 1.5 ；MgS04.7H20 0.5 ；FeS04.7Η200.02 ；MnSO4.H2O 0.02 ;生物素8 X 1(T5;L-组氨酸5 X 10 'CaCO 3 30 ;分别加入玉米浆或酵母粉以达到上述浓度；pH 7.0?7.2 ；115 °C高压蒸汽灭菌7 min。
[0006](3)发酵参数检测:
A.生物量:用0.25 mol/L HCl对发酵液进行适当倍数稀释后，紫外分光光度计测定OD562nm, OD 值与菌体干重的关系为 I OD562nm = 0.375 g (DCff)/L0
[0007]B.L-精氨酸含量:坂口试剂法测定。
[0008]2.比较最适酵母粉及玉米浆浓度下菌株发酵过程
通过方案I获得最适酵母粉及玉米浆的添加浓度，比较c.在最适酵母粉及玉米浆添加浓度下发酵积累L-精氨酸的差异。参照方案I中所述发酵方法，每隔8 h取样，检测发酵液中相关参数。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1不同浓度玉米浆对菌体生长(黑色)及L-精氨酸(白色)积累的影响图2不同浓度酵母粉对菌体生长(黑色)及L-精氨酸(白色)积累的影响
图3比较添加最适酵母粉(■)及玉米浆(.)的条件下C.crmate?发酵积累L-精氨酸的差异
(A)生物量；(B) L-精氨酸产量；(C)硫酸铵含量；(D)葡萄糖含量。
【具体实施方式】
[0010]实施实例1.不同浓度酵母粉及玉米浆对菌株生长及发酵积累L-精氨酸的影响在发酵培养基中分别添加15、20、25、30、35、40 (g/L)玉米浆，发酵96 h，测定菌体生物量及发酵液中L-精氨酸产量，结果如图1所示，最适玉米浆浓度为25 g/L，在此条件下经96 h发酵，菌体生物量为33.1 g/L，L-精氨酸产量为24.7 g/L,单位菌体产酸量为0.746。
[0011]在发酵培养基中分别添加2、5、10、15、20、25 (g/L)酵母粉，发酵96 h，测定菌体及发酵液中L-精氨酸产量，结果如图2所示，最适酵母粉浓度为10 g/L，在此条件下经96 h发酵，菌体生物量为30.5 g/L，较最适玉米浆浓度条件下降低了 8.5% ；L-精氨酸产量为32.0g/L,单位菌体产酸量为1.05，分别较最适玉米浆浓度条件下提高了 29.5 %及40.8 %。
[0012]实施实例2.比较最适酵母粉及玉米浆浓度下菌株发酵过程
分别考察C crenatum^.25 g/L玉米浆及10 g/L酵母粉浓度下发酵积累L-精氨酸的过程，结果如图3所示。在整个发酵过程中，添加25 g/L玉米浆更有利于菌体的生长，至发酵结束，菌体生物量为33.1 g/L，较添加酵母粉发酵的生物量(26.85 g/L)高23.5% (图3A);添加酵母粉有利于L-精氨酸的积累，至发酵结束L-精氨酸产量为30.6 g/L，较添加玉米浆发酵的L-精氨酸产量(24.6 g/L)高24.4% (图3B);同时，添加酵母粉发酵使得硫酸铵的消耗速率加快(图3C)，但葡萄糖的消耗速率基本保持一致(图3D)。
【权利要求】
1.以酵母粉代替钝齿棒杆菌iGoryiwlmcterium crenaturn)发酵培养基中的玉米衆组分进行发酵的方法，其特征为有利于该菌株发酵积累L-精氨酸，且批次发酵，L-精氨酸产量稳定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征为，发酵步骤如下: (1)种子活化:将斜面保存的菌种划线于肉汤斜面中，30°C静置培养24h;肉汤培养基组分(g/L):葡萄糖20 ;蛋白胨10 ;牛肉膏10 ;酵母粉5 ；NaCl 5 ;琼脂粉20 ；pH 7.0?7.2 ；121 °C高压蒸汽灭菌20 min ； (2)摇瓶种子:将活化后的种子，挑取一环接种摇瓶种子培养基中，30°C120 rpm往复式摇床培养12-16 h，至OD562nm约为15 ;种子培养基组分(g/L):葡萄糖30 ;酵母粉10;(NH4)2SO4 20 ；KH2PO4 I ；MgS04.7Η20 0.5 ;尿素 1.5 ；ρΗ 7.0 ?7.2 ；121 °C 高压蒸汽灭菌 20min ； (3)摇瓶发酵:将液体种子按5%的接种量接种至发酵培养基，30°C120 rpm往复式摇床培养96 h,发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖；摇瓶发酵培养基组分(g/L):葡萄糖(分消)100 ； (NH4)2SO4 50 ；KH2PO4 1.5 ；MgS04.7H20 0.5 ；FeS04.7H20 0.02 ；MnSO4.H2O 0.02 ；生物素8 X 10_5;L-组氨酸5 X 10'CaCO 3 30 ;添加适量酵母粉；pH 7.0?7.2;115 °〇高压蒸汽灭菌7 min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征为在发酵培养基中添加不同浓度酵母粉进行发酵，以酵母粉取代玉米浆进行发酵。
【文档编号】C12P13/10GK104450816SQ201410190809
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】许正宏, 赵芹芹, 窦文芳, 罗玉常, 张晓梅, 耿燕, 史劲松 申请人:江南大学