一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种微生物发酵制备2, 3- 了二醇的方法。
【背景技术】
[0002] 2, 3-了二醇可W作为一种潜在的平台化合物，替代传统的平台化合物，用于大规 模合成甲己丽(优良溶剂）和1，3- 了二帰(广泛应用于合成橡胶、聚醋和聚亚胺醋等领域)。 除此之外，2, 3- 了二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药 物手性载体等，2, 3- 了二醇的氧化产物3-居基了丽和了二丽可作为食用香料使用；同时， 因其热值较高，与己醇、甲醇相当，故可作为燃料添加剂；2, 3-了二醇醋化后可生成聚氨醋 泡沫的前体；2, 3-了二醇与己酸反应生成2, 3-了二醇二己酸醋，该醋可加到奶油中改善风 味；2, 3-了二醇在我国还被添加到白酒中，W改善白酒的风味。2, 3-了二醇脱氨变成双己 醜，双己醜在食品工业中作为一种具有很高价值的风味剂。2, 3- 了二醇的L型异构体可用 于抗冻剂。2, 3-了二醇醋化物能作为制作药物和化妆品的前体。其它潜在的用途包括用于 制作墨水、增塑剂、湿润剂。目前2, 3- 了二醇的合成主要采用W石油裂解物为来源的化学 法，但随着石油资源的大量消耗和不可再生资源价格的节节攀升，发展环境友好的生物基 化学品的生物炼制技术已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可 持续发展的战略需求。
[0003] 微生物发酵制备2, 3-了二醇的过程中，通常W葡萄糖作为碳源。葡萄糖来源广 泛，并且能够被众多微生物利用，目前作为通用碳源，广泛应用于各种发酵生产中。在W葡 萄糖为碳源，经生物转化生产2, 3-了二醇过程中，除底物添加葡萄糖外，在发酵周期内还 需要进行葡萄糖补加，因此葡萄糖的消耗量较大。由于添加的葡萄糖并不能完全被微生物 利用，因此在发酵液中通常会产生部分残留，通常浓度为5g/L。残留的葡萄糖会对2, 3-了 二醇产品分离提纯造成很大困难，主要表现在：葡萄糖水溶性好，通常与2, 3- 了二醇共同 存在与水相中，经常规的分离手段，难W高效脱除，从而影响2, 3-了二醇提取纯度；葡萄糖 在加热条件下，易与蛋白类大分子反应，生成有色度物质，影响2, 3-了二醇的品质；目前高 纯度的2, 3-了二醇是经过减压精傭获得，但葡萄糖在高温条件下会明显的结焦现象，从而 减慢了 2, 3- 了二醇的蒸发速率，降低了 2, 3- 了二醇产品的收率。
[0004] 由于发酵液中残留的葡萄糖难W有效去除，采用常规分离方式难W获得高纯度的 2, 3- 了二醇产品，因此近年来开发了双水相萃取技术、沸石吸附技术用于2, 3- 了二醇产品 的分离。CN200710010203. 9公开了一种从发酵液中分离2, 3-了二醇的双水相萃取方法，其 特征在于向2, 3-了二醇的发酵液中加入无机盐和亲水有机物形成新型双水相，从而达到 萃取分离发酵液中2, 3- 了二醇的目的。CN200810024865. 6公开了一种利用疏水娃沸石吸 附分离发酵液中2, 3- 了二醇的方法，其特征在于将菌种发酵制得的2, 3- 了二醇发酵液预 处理后用疏水娃沸石对2, 3- 了二醇进行吸附，吸附后用无水己醇脱附，脱附液除去己醇后 得到2, 3- 了二醇。送些工艺虽然能够通过不同方式，排除了葡萄糖对2, 3- 了二醇分离过 程的影响，但处理方式过程复杂，均不同程度的添加了有机溶剂，难W规模应用。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物发酵制备2, 3-了二醇的方法。本 发明方法能够有效脱除发酵液中葡萄糖的残留，有利于下一步双水相、精傭等精制方式的 实施，适用于大规模生产应用。
[0006] 本发明微生物发酵制备2, 3- 了二醇的方法，包括W下步骤： (1) 菌种培养：W MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；W LB培养基进行 克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液； (2) 发酵培养；在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流 加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L~40g/L ; (3) 发酵调控；在发酵末期将发酵液抑调至5~6,接入乳杆菌种子液，在低抑条件下 进行好氧发酵。
[0007] 本发明方法中，所采用的乳杆菌为干酪乳杆菌；所采用克雷伯氏菌为肺炎克雷伯 氏I未I。
[0008] 本发明方法中，种子液的培养过程如下；菌种保藏液与种子培养基的体积比为1 ; 100~1 ;500,在温度为30°C~40°C，揽拌速度为10化pm~40化pm,抑值为6~7的条件 下培养至对数生长期，培养过程中保持厌氧或微氧条件。
[0009] 本发明方法中，发酵过程如下；W葡萄糖为底物发酵，克雷伯氏菌种子液和发酵培 养基的体积比为1 ;8~1 ;20,培养温度为30°C~40°C，揽拌速度为20化pm~50化pm, pH 值为6~7。
[0010] 本发明方法中，微氧发酵时通入流速小于0. 05vvm的空气。
[0011] 本发明方法中，发酵初始葡萄糖底物浓度控制在50g/L~lOOg/L。发酵过程中，通 过流加形式补充浓度为200g/L~400g/L的葡萄糖溶液，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在 20g/L ~40g/L。
[001引本发明方法中，在发酵末期W 5mol/L~lOmol/L硫酸将抑调至5~6,并加入乳 杆菌种子液，乳杆菌种子液和发酵液体积比为1 :8~1 ;20。发酵末期是指发酵培养进行 40h W后。
[001引本发明方法中，好氧发酵时通入流速为0. 5vvm~Ivvm的空气。
[0014] 本发明通过发酵末期环境诱导、优势菌种的添加手段，能够有效消耗发酵液中葡 萄糖的残留量，降低了后续提取难度，能够提高2, 3- 了二醇的收率，更有利于工业应用。与 现有技术相比，具有W下优点： (1) 微生物对葡萄糖的摄取主要采用主动运输的方式，细胞内葡萄糖的相对浓度较高。 当细胞自溶后，胞内富集的葡萄糖会从新进入发酵液中，因此经灭菌处理后，发酵液中葡萄 糖浓度通常要高于发酵结束时发酵液残糖浓度。本发明在发酵末期，通过低pH、高渗透压等 调控的手段，提高发酵菌株的自溶率，使葡萄糖完全溶液溶解于发酵液中，从而加强了葡萄 糖的脱除效果； (2) 乳杆菌具有高效的葡萄糖代谢能力，并且能够对低pH、高渗透压进行较好的耐受。 本发明在发酵末期，通过乳杆菌的加入，W微生物代谢的方式，脱除发酵液中残留的葡萄 糖，工艺简单，操作简便，效果明显。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。
[0016] 本发明实施例中，W Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相 分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。W 葡萄糖、玻巧酸、乳酸、己酸、2, 3-了二醇、己醇标准样品建立标准图谱，反应过程中定时测 量反应体系中葡萄糖的消耗情况、产物2, 3- 了二醇的积累情况。
[0017] 本发明实施例中，所用的菌种为克雷伯杆菌(必eAsieiia /we歴oniae )，来 自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，保藏编号为CGMCC N0.0 798 ;干酪乳杆菌 仏casei)来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种FY-04,保藏编号为 CGMCC NO. 3269O
[0018] 本发明实施例中，种子培养基及发酵培养基的配方如表1所示。
[001引 亲1培苯某配方 实她例i
(1)种子液培养；取液体保藏的克雷伯杆菌(必6知fieiia /wei/woniae)菌种保藏液2mL 加入SOOmL的LB培养基中，混合于IL种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为；培养 温度为37C，揽拌速度设为20化pm,抑控制在7. 0,培养过程中保持微氧，培养1 Ih至对数 期。
[0020] 取液体保藏的干酪乳杆菌仏sctoAscWii/s casei)菌种保藏液2. 5血加入1000血 的MRS培养基中，混合于IL种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为；培养温度为 35C，揽拌速度设为20化pm,抑控制在6. 0,培养过程中保持微氧，培养2化至对数期。
[0021] (2)发酵培养；采用间歇发酵模式，发酵罐体积选择15L上罐体积为化。具体步 骤如下： 曰、分别取SOOmL克雷伯杆菌种子液加入到7. 2L发酵培养基中； b、发酵过程控制培养温度为37°C，揽拌速度为20化pm,过程中W 30%Na0H调节抑，使其 控制为7,该过程保持微氧发酵； C、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖的消耗情况，并及时通过流 加的方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
[0022] (3)发酵开始4化后，用5mol/L硫酸将抑调至5,并加入IL干酪乳杆菌种子液， 并通入0. 5vvm空气，进行好氧发酵。
[0023] 发酵4她结束，最终产物中2, 3- 了二醇浓度为82. 52g/l，葡萄糖0. lOg/L。
[0024] 实施例2 (1)种子液培养；取液体保藏的克雷伯杆菌(必6知fieiia /wei/woniae)菌种保藏液3mL 加入900mL的LB培养基中，混合于IL种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为；培养 温度为37C，揽拌速度设为30化pm,抑控制在6. 5,培养过程中保持微氧，培养1化至对数 期。
[00巧]取液体保藏的干酪乳杆菌仏SCcasei)菌种保藏液6血加入1800血 的MRS培养基中，混合于2.化种子罐中，进行种子液培养。培养条件控制为；培养温度为 35C，揽拌速度设为10化pm,抑控制在6. 0,培养过程中保持微氧，培养24h至对数期。
[0026] (2)发酵培养；采用间歇发酵模式，发酵罐体积选择15L上罐体积为化。具体步 骤如下： 曰、分别取900mL克雷伯杆菌种子液加入到8. IL发酵培养基中； b、发酵过程控制培养温度为37°C，揽拌速度为20化pm,过程中W 30%Na0H调节抑，使其 控制为7,该过程保持微氧发酵； C、发酵过程中，通过液相分析系统，测量反应体系中葡萄糖消耗情况，并及时通过流加 的方式加入葡萄糖，使其在反应体系中的浓度维持在30g/L水平。
[0027] (3)发酵开始4化后，用5mol/L硫酸将抑调至5. 5,并加入1.化干酪乳杆菌种子 液，并通入Ivvm空气，进行好氧发酵。
[0028] 发酵50h结束，最终产物中2, 3- 了二醇浓度为92. 64g/l，葡萄糖0. 05g/L。
[0029] 比较例1 采用克雷伯氏菌单一菌种发酵，菌种培养及发酵过程控制与实施例1相同。发酵4她， 最终产物中2, 3- 了二醇浓度为83. 62g/l，葡萄糖6. 24g/L。
[0030] 比较例2 采用克雷伯氏菌单一菌种发酵，菌种培养及发酵过程控制与实施例2相同。发酵50h， 最终产物中2, 3- 了二醇浓度为93. 32g/l，葡萄糖5. 25g/L。
[00引]比较例3 种子培养及发酵培养与实施例1相同。不同之处在于：发酵4化后，不经抑调节，直接 加入IL干酪乳杆菌种子液，并通入0. 5vvm空气，进行好氧发酵。经4她，最终产物中2, 3-了 二醇浓度为83. 33g/l，葡萄糖3. 42g/L。
[00础 比较例4 种子培养及发酵培养与实施例1相同。不同之处在于：发酵4化后，用5mol/L硫酸将 抑调至5,但是不加干酪乳杆菌种子液，并通入0. 5vvm空气，进行好氧发酵。经4她，最终产 物中2, 3- 了二醇浓度为81. 26g/l，葡萄糖9. 15g/L。
【主权项】
1. 一种微生物发酵制备2, 3- 丁二醇的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 菌种培养：以MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；以LB培养基进行 克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液； (2) 发酵培养：在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流 加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L~40g/L ; (3) 发酵调控：在发酵末期将发酵液pH调至5~6,接入乳杆菌种子液，在低pH条件下 进行好氧发酵。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所采用的乳杆菌为干酪乳杆菌；所采用克 雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：种子液的培养过程如下：菌种保藏 液与种子培养基的体积比为1 :1〇〇~1 :500,在温度为30°C~40°C，搅拌速度为lOOrpm~ 400rpm，pH值为6~7的条件下培养至对数生长期，培养过程中保持厌氧或微氧条件。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵过程如下：以葡萄糖为底物发酵，克 雷伯氏菌种子液和发酵培养基的体积比为1 :8~1 :20,培养温度为30°C~40°C，搅拌速度 为 200rpm ~500rpm，pH 值为 6 ~7。5. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：微氧发酵时通入流速小于0.05vvm的 空气。6. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：发酵初始葡萄糖浓度控制在50g/L~ 100g/L。7. 根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：发酵过程中，通过流加浓度为200g/ L~400g/L的葡萄糖溶液，使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L~40g/L。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在发酵末期以5mol/L~10m〇l/L硫酸将 pH调至5~6。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：乳杆菌种子液和发酵液体积比为1 :8~ 1 ：20〇10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：好氧发酵时通入流速为〇. 5vvm~lvvm 的空气。
【专利摘要】本发明公开了一种微生物发酵制备2,3-丁二醇的方法，包括（1）菌种培养：以MRS培养基进行乳杆菌的培养，获得乳杆菌种子液；以LB培养基进行克雷伯氏菌的培养，获得克雷伯氏菌种子液；（2）发酵培养：在发酵培养基中接入克雷伯氏菌种子液，进行微氧发酵，发酵过程中流加葡萄糖溶液使发酵体系中葡萄糖浓度控制在20g/L～40g/L；（3）发酵调控：在发酵末期将发酵液pH调至5～6，接入乳杆菌种子液，在低pH条件下进行好氧发酵。本发明方法能够有效脱除发酵液中葡萄糖的残留，有利于下一步双水相、精馏等精制方式的实施，适用于大规模生产应用。
【IPC分类】C12R1/22, C12P7/18, C12R1/245
【公开号】CN105713932
【申请号】CN201410730613
【发明人】张霖, 樊亚超, 廖莎, 姚新武, 师文静
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院