一种发酵生产丁二酸的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种发酵生产丁二酸的方法属于工业微生物及发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微 生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过 程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1， 4_丁二醇、四氢呋喃、γ_丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解 聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备 受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
[0003] 相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成 丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发 酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为酸成为近年来研究的热点。
[0004] 发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一，多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但 是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸，丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型 的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前，丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺 菌（Anaerobiospiri 1 lum succiniciproducens)，产丁二酉爱放线杆菌（Actinobacillus succinogenes)，谷氨酉爱棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌（Escherichia coli)等。其中在丁二酸的发酵生产中，Actinobacillus succinogenes因其具有耐高底物、 产物浓度，高产丁二酸，碳源广泛等优点已成为目前最具丁二酸产业化生产的潜在菌株之 〇
[0005] McKinlay等利用合成培养基研究了Actinobacillus succinogenes发酵代谢过 程，发现该菌株的必需氨基酸为谷氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，并分析了该菌株的代谢网 络，证明该菌株为谷氨酸缺陷型。而后通过检测其活体胞外的TCA相关酶活发现， Actinobacillus succinogenes缺乏TCA循环中的关键酶-梓檬酸合成酶和异梓檬酸脱氢 酶，故其TCA循环不完全，无法积累谷氨酸合成的前体α-酮戊二酸，导致其不能自主合成谷 氨酸(如图1)。奚永兰在论文(面向廉价生物资源利用的产琥珀酸放线杆菌合成丁二酸的机 制解析与过程调控）中指出：Actinobacillus succinogenesNJl 13在合成培养基不添加谷 氨酸利用葡萄糖发酵产丁二酸，实验结果显示，初糖浓度为l〇g/L的，发酵12h后，约有8g/L 的葡萄糖剩余。而对照，葡萄糖基本消耗完全。此结果也就说明A c t i η 〇 b a c i 11 u s succinogenes NJ113也为谷氨酸缺陷型菌株。因之前无合适的基因工具所以无法对产琥?白 酸放线杆菌进行基因改造，故只能通过优化培养基配方来满足菌株的生长需求。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术的目的是针对现有产丁二酸菌株不易培养，产酸能力低的问题，提 供一种发酵生产丁二酸的方法，利用该方法生产丁二酸，得到产酸菌株的方法简单方便，发 酵方法简单可行，且产酸能力较强，可以大大降低生产成本，提高经济效益。
[0007] 为达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 第一步：以实验室自主筛选获得的产琥珀酸放线杆菌NJ113(保藏号为CGMCC No. 1716)为出发菌株，其特征在于以TCA循环不完整的产琥珀酸放线杆菌NJ113为出发菌 株，利共表达异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合成酶基因后，得到一株能够在合成培养基中无需 外源添加谷氨酸的高产丁二酸的重组型产琥珀酸放线杆菌；
[0009] 进一步地，所诉的具体步骤如下：
[0010] (1)利用电转化法（当菌体0D66Q值在0 · 3-0 · 7之间时，4100r/min转速下离心10min， 用272mM的蔗糖缓冲溶液洗涤3次，电转条件为2.5Kv，25uF，200 Ω，在〇. 2cm电转杯中进行） 制备产琥珀酸放线杆菌感受态菌株；
[0011] (2)合成一对5 '端带有酶切位点的引物，以E. coli BL21基因组DNA为模板，纯化扩 增出的i cdh基因后，表达质粒pLGZ920用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切，连接获 得重组质粒PLGZ920- icdh;
[0012] (3)合成一对5 '端带有Bamm酶切位点的同源重组的引物，以E. co 1 i BL21基因组 DNA为模板，纯化扩增出的cs基因后，以构建的重组质粒pLGZ920-icdh用与引物所设计的酶 切位点一致的酶单酶切，用一步克隆做连接获得的重组质粒pLGZ920-icdh-cs;
[0013] (4)将步骤(3)所述的重组质粒pLGZ920-icdh-cs导入步骤（1)中的感受态菌株，获 得阳性转化子；
[0014] (5)利用步骤(4)的阳性转化子共表达异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合成酶，恢复其在 厌氧条件下在合成培养基中合成谷氨酸的能力，得到可利用葡萄糖厌氧条件下在合成培养 中合成谷氨酸并产丁二酸的基因工程菌产琥珀酸放线杆菌BD106。
[0015] 利用本发明所述的产琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的方法，其特征在于采用分子 手段对其进行基因改造，使其可以在合成培养基上自主合成谷氨酸并利用葡萄糖产丁二 酸。
[0016] 进一步地，具体步骤如下：
[0017] 种子培养:将产琥珀酸放线杆菌BD106在平板中活化，35-37°C，厌氧箱中过夜培 养。将平板中活化过的菌株接入到血清瓶中，35-37°C，200r/min培养10-12个小时，作为一 级种子。将一级种子以6%_10%接种量接入到血清瓶中，35-37°C，200r/min培养10-12个小 时，作为二级种子。血清瓶中种子培养基通入⑶2 2min，培养温度35-37°C，培养时间10-12h；
[0018] 发酵产丁二酸:将种子培养基接种到厌氧发酵培养基中厌氧发酵，接种量体积比 6 % -10 %，充C02 2min，发酵温度35-37 °C，发酵时间24-72h。。
[0019] 其中所述的厌氧阶段发酵培养基是以葡萄糖为碳源的产琥珀酸放线杆菌用的合 成培养基。
[0020] 本发明中，使用表达载体pLGZ920(购自ATCC)来构建NJ113的谷氨酸代谢途径，异 源表达柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶，使得NJ113的谷氨酸代谢途径得以回补，使得其在 合成培养基中可以无需外源添加谷氨酸利用葡萄糖产丁二酸。利用本发明的方法生产丁二 酸，得到产酸菌株的方法简单方便，发酵方法简单可行，且产酸能力强。
【附图说明】
[0021]图1是产琥珀酸放线杆菌中的谷氨酸合成及分解途径。
[0022] 图2是重组质粒pLGZ920-icdh的构建图谱。
[0023] 图3是重组质粒pLGZ920-icdh-cs的构建图谱。
[0024]图4是PCR产物icdh的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0025]图5是PCR产物cs的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0026] 图6是重组质粒pLGZ920-icdh的菌落PCR鉴定图。
[0027] 图7是重组质粒pLGZ920-icdh_cs的菌落PCR鉴定图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例和【附图说明】对本发明做详细说明，但对本发明没有限制。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例说明构建共表达异柠檬酸脱氢酶的表达质粒，得到重组型菌株产丁二酸 的方法。
[0031] 构建pLGZ920-icdh质粒(如图2)，其过程包括：（1)合成带有SacI和BamHI酶切位点 的引物：
[0032] 上游引物：5' -CGGGATCCCAAACCAGTAGCGCTCGAAGGAGAG-3' ；
[0033] 下游引物：5 ' -CGAGCTCCGCCCGTTGCAATATTAAACACATG-3 ' ；
[0034] (2)以E.coli BL21基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为:94°C， lOmin; (94°C45s，62°C45s，72°C80s，35个循环）；72Γ，lOmin。
[0035] 纯化扩增出的icdh基因后（如图4)，表达质粒pLGZ920用SacI和BamHI双酶切、连接 获得重组质粒pLGZ920-icdh(如图6)。
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例说明构建共表达异梓檬酸脱氢酶和梓檬酸合成酶的表达质粒，恢复野生 型产琥珀酸放线杆菌在合成培养基中合成谷氨酸的能力，得到重组型菌株产丁酸的方法。
[0038] 1、构建共表达异梓檬酸脱氢酶和梓檬酸合成酶的表达质粒(如图3)，其过程包括：
[0039] (1)合成上下游都带有BamM酶切位点的一步克隆的同源重组的引物，
[0040] 上游引物：
[0041 ] 5 '-ATGAGGTGATCTAGAGGATCCCAGGTTGATGTGCGAAGGC-3 '；
[0042]下游引物：
[0043] 5 '-GCGCTACTGGTTTGGGATCCTCTATTAAAGGCGGGTCCGGAAAG-3 '；
[0044] (2)以大肠杆菌E.coli BL21基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段，反应条件为:94 °C，lOmin; (94￡€458,55°〇458,72°(：10〇8,35个循环）；72°(：，1〇1^11。纯化扩增出的。8(如图5) 基因后，质粒pLGZ920-icdh用BamHI单酶切、一步克隆重组后获得重组质粒pLGZ920-icdh-cs(如图7)。
[0045] 2、将质粒pLGZ920-icdh-cS导入产琥珀酸放线杆菌NJ113的感受态菌株，获得的阳 性转化子即为本发明的新构建的重组型菌株BD106。
[004