使用连续培养制备乙醇的方法和连续培养装置的制造方法
【专利说明】使用连续培养制备乙醇的方法和连续培养装置
[0001] 发明背景 1.发明领域
[0002] 本发明涉及使用连续培养制备乙醇的方法，其中使用具有木糖代谢能力的重组微 生物；和涉及连续培养装置。
[0003] 2.相关技术的描述
[0004] 木素纤维素中含有的主要糖类包括构成纤维素的葡萄糖和构成半纤维素的木糖。 当化学地或者酶促地分解木素纤维素时，获得了含有主要组分是单糖的糖化组合物，所述 单糖如葡萄糖和木糖。为了自木素纤维素工业制备有用物质，需要能够通过有效利用糖化 组合物中含有的糖类，以高产量和高生产率发酵的微生物和制备方法。
[0005] 例如，将编码木糖异构酶（XI)、木糖还原酶（XR)和木糖醇脱氢酶（XDH)的基因转 移至具有高乙醇发酵能力的酵母如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中，以对酵母赋 予木糖利用能力。使用这种酵母，通过有效利用衍生自木素纤维素的糖类能够制备乙醇。
[0006] 通常，通过使用微生物来发酵物质的制备方法中，已知有分批培养、连续培养和流 加培养（补料分批培养）。在分批培养中，对每一工艺制备新的培养基，将微生物接种至制 备的培养基，且至培养结束时不添加另一培养基。在分批培养中，每一培养的品质是变化 的，但是能够分散和降低污染的风险。在连续培养中，将培养基以恒定的速度提供给培养体 系，并同时以相同的速度从培养体系取出培养液。连续培养的特征在于易于维持恒定的培 养环境且生产率是稳定的。在流加培养中，将培养基或培养基的特定组分在培养期间添加 至培养体系，并且直至培养结束时才从培养体系提取所获得的产物。
[0007] 特别地，关于连续培养，日本专利申请公开号2009-065970 (JP 2009-065970 A)公 开了通过连续发酵制备化学品的方法，其中在简单的操作条件下能够长时间稳定地维持高 生产率。在JP 2009-065970 A公开的方法中，通过多孔膜过滤发酵培养液，并将微生物等 从发酵培养液提取至体系外。但是，在这个方法中，当使用基于木素纤维素的材料时，产生 了多孔膜的堵塞，并且问题是需要高的花费来解决堵塞。
[0008] 日本专利申请公开号2010-227074(JP 2010-227074 A)公开了通过醇发酵连续制 备乙醇的方法，其中使用了酵母，以含淀粉物质作为基质。在JP 2010-227074 A公开的方法 中，将连续发酵条件控制为特定值，其中所述连续发酵条件包括发酵温度、基质供给速度、 发酵液提取速度、气流速度和酵母浓度，并将发酵液中的乙醇浓度维持在预定值或以下。根 据JP 2010-227074 A中公开的方法，能够有效地继续乙醇的产生，且在连续发酵期间无需 额外地提供酵母。但是，在JP 2010-227074 A中公开的所述连续培养方法中，当使用衍生 自木素纤维素的糖类作为基质时，存在不能有效产生乙醇的问题。
[0009] 发明概述
[0010] 如上所述，在相关领域中，不能通过使用具有木糖利用能力的微生物从衍生自木 素纤维素的糖类有效产生乙醇。考虑到上述情形，本发明提供了通过使用具有木糖利用能 力的微生物的连续培养从衍生自木素纤维素的糖类实现有效产生乙醇的方法和装置。
[0011] 作为深入研究的结果，本申请的发明人发现在使用具有木糖利用能力的微生物的 连续培养中，通过以培养液中的木糖浓度作为指标来控制培养基添加，能够有效制备乙醇， 由此完成了本发明。
[0012] 根据本发明的一个方面的乙醇的制备方法包括：测定含有具木糖利用能力的微生 物的培养液中的木糖浓度，所述培养液包括含有衍生自木素纤维素的糖类的培养基；和实 施添加控制，其中将额外培养基添加至所述培养液以进行微生物的连续培养，所述额外培 养基含有衍生自木素纤维素的糖类。在根据本发明上述方面的制备乙醇的方法中，添加控 制可以包括添加额外培养基至培养液，以调节木糖浓度为预先设定的阈值或以下。在根据 本发明上述方面的制备乙醇的方法中，所述预先设定的阈值可以是培养开始前的培养液中 木糖浓度的1/3或以下。在根据本发明上述方面的制备乙醇的方法中，所述预先设定的阈 值可以是l〇g/L或以下。在根据本发明上述方面的制备乙醇的方法中，所述添加控制可以 包括控制所述额外培养基向所述培养液的供给速度，使得所述连续培养中每单位时间和单 位液量产生的用于乙醇制备的微生物细胞数多于使用所述培养基的分批培养中每单位时 间和单位液量产生的用于乙醇制备的微生物细胞数。在根据本发明上述方面的制备乙醇的 方法中，所述供给速度大于可以自下述等式获得的F :
[0013] F = VX (xnax-x〇)/xsXT/(tbatchX (T-t,))
[0014] 其中F表示所述额外培养基的供给速度，V表示所述培养液的液量，x_表示使用 所述培养基的分批培养中的用于乙醇制备的最大微生物浓度，&表示使用所述培养基的分 批培养开始时的用于乙醇制备的微生物浓度，x s表示使用所述培养基的连续培养稳态时的 用于乙醇制备的微生物浓度，T表示在所述培养液中维持稳态的时间，t bateh表示使用所述培 养基的分批培养所需的总时间，和^表示在使用所述培养基的连续培养中，至建立稳态时 所需的总时间。在根据本发明上述方面的制备乙醇的方法中，可以对所述供给速度进行控 制，使得所述培养液中的木糖浓度是在使用所述培养基的分批培养结束时培养液中木糖浓 度的10倍或以下。在根据本发明上述方面的制备乙醇的方法中，所述培养基可以含有对木 素纤维素使用稀酸蒸煮处理后、进行糖化处理获得的糖化液。在根据本发明上述方面的制 备乙醇的方法中，所述培养基可以含有对木素纤维素不使用稀酸进行蒸煮处理后、进行糖 化处理获得的糖化液，且在所述糖化液中过度分解的糖类浓度是400ppm至1500ppm。根据 本发明的一个方面的连续培养装置包括：培养槽，在所述培养槽中将具有木糖利用能力的 微生物在含有衍生自木素纤维素的糖类的培养基中连续培养；培养基供给部，其安置为将 额外培养基供给至培养槽，所述额外培养基含有衍生自木素纤维素的糖类；木糖浓度测定 部，其安置为测定培养槽中培养液的木糖浓度；和控制部，其安置为基于所述木糖浓度控制 供给。在根据本发明上述方面的连续培养装置中，可以将控制部安置为控制供给，使得木糖 浓度调节至预先设定的阈值或以下。在根据本发明上述方面的连续培养装置中，所述预先 设定的阈值可以是培养开始前的培养液中木糖浓度的1/3或以下。在根据本发明上述方面 的连续培养装置中，所述预先设定的阈值可以是l〇g/L或以下。在根据本发明上述方面的 连续培养装置中，可以将控制部安置为控制所述额外培养基向所述培养液的供给速度，使 得所述连续培养中每单位时间和单位液量产生的用于乙醇制备的微生物细胞数多于使用 所述培养基的分批培养中每单位时间和单位液量产生的用于乙醇制备的微生物细胞数。在 根据本发明上述方面的连续培养装置中，所述供给速度可以大于自下述等式获得的F :
[0015] F = VX (xnax-x〇)/xsXT/(tbatchX (T-t,))
[0016] 其中F表不所述额外培养基的供给速度，V表不所述培养液的液量，xmax表不使用 所述培养基的分批培养中的用于乙醇制备的最大微生物浓度，&表示使用所述培养基的分 批培养开始时的用于乙醇制备的微生物浓度，x s表示使用所述培养基的连续培养稳态时的 用于乙醇制备的微生物浓度，T表示在所述培养液中维持稳态的时间，t bateh表示使用所述 培养基的分批培养所需的总时间，和^表示在使用所述培养基的连续培养中，至建立稳态 时所需的总时间。在根据本发明上述方面的连续培养装置中，可以对所述供给速度进行控 制，使得所述培养液中的木糖浓度是在使用所述培养基的分批培养结束时培养液中木糖浓 度的10倍或以下。在根据本发明上述方面的连续培养装置中，所述培养基含有对木素纤维 素使用稀酸蒸煮处理后、进行糖化处理获得的糖化液。在根据本发明上述方面的连续培养 装置中，所述培养基可以含有对木素纤维素不使用稀酸进行蒸煮处理后、进行糖化处理获 得的糖化液，且在所述糖化液中过度分解的糖类浓度是400ppm至1500ppm。
[0017] 在根据本发明方面的制备乙醇的方法和连续培养装置中，基于培养液中的木糖浓 度控制额外培养基的添加。因此，能够显著提高使用具有木糖利用能力的微生物的乙醇生 产效率。
[0018] 附图简述
[0019] 下面引述附图对本发明的示例性实施方案的特征、益处、以及技术和工业意义进 行描述，其中相同的数字表示相同的元件，和其中：
[0020] 图1是显示本发明的一个实施方案所用的一个连续培养装置的例子的概略构造 图；
[0021] 图2是显示本发明的实施方案所用的另一个连续培养装置的例子的概略构造图；
[0022] 图3是显示含有衍生自木素纤维素的糖类的培养基（糖化液）的添加速度与包括 乙醇浓度、木糖浓度和葡萄糖浓度在内的浓度之间关系的特性图；和
[0023] 图4是显示过度分解的糖类浓度和乙醇生产率之间关系的特性图。
[0024] 实施方案的详细描述
[0025] 以下，引述附图和实施例对本发明的一个实施方案进行更具体的描述。在根据本 发明实施方案的乙醇的制备方法中，在含有衍生自木素纤维素的糖类的培养基中连续培养 具有木糖利用能力的微生物，由此制备乙醇。特别地，在根据本发明实施方案的制备乙醇的 方法中，当连续添加含有衍生自木素纤维素的糖类的额外培养基时，基于培养液中的木糖 浓度确定所述额外培养基的添加控制，所述添加控制包括添加量的调节、添加速度的调节 和添加时机的调节。
[0026] 根据本发明实施方案的制备乙醇的方法能够使用例如图1中所示的连续培养装 置1实现。
[0027] 连续培养装置1包括：培养槽2,在其中将具有木