专利名称：一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，主要涉及一种利用廉价的乳清原料发酵生产丁二 酸的方法。
背景技术：
丁二酸，又称琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛的存在于人体、动物、植物、 微生物中。丁二酸是一种重要的化学品，可用于表面活性剂、清洁剂、溶剂等领域，在食品行 业可作为PH改良剂、风味剂或抗菌剂，也可用作动物饲料添加剂或植物助长剂等。在工业 上，丁二酸是一种重要的碳四平台化合物，可以转化为很多重要的化学品，如脂肪酸、四氢 呋喃、1，4_ 丁二醇、丁内酯等，还可以作为单体用来合成生物可降解材料PBS。目前已 有超过250种以苯为原料的化工产品可以通过丁二酸转化获得，因此丁二酸的市场需求不 断增加。传统生产方法采用丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，污染大、转化率低、成本高， 严重抑制了琥珀酸的发展潜力。采用生物法制备丁二酸，与传统的化学法相比，具有环境友好性、循环利用 资源、固定co2气体等诸多优点，对缓解当今社会能源短缺和环境污染具有重大战略 意义。目前，生物法生产琥珀酸和它大多数衍生物的合成还处在进一步研究和开发 阶段。生物法制备琥珀酸的微生物主要有从牛瘤胃中筛选出的产琥珀酸放线杆菌 (Actinobacillussuccinogenes)和基因工程构建的大肠杆菌(Esherichia coli)，培养基 原料多为葡萄糖。使用低廉价格的碳源是降低琥珀酸发酵成本的关键因素之一。已有文献 报道采用乳清为碳源进行丁二酸发酵，但是丁二酸产量最高仅为27. 9g/L，收率57%。
发明内容
本发明的目的在于提供一种综合利用食品工业废弃物乳清，采用发酵法生产丁二 酸的方法，使得利用本发明所述的方法可以大大提高丁二酸的产量和收率，达到综合有效 利用乳清实现丁二酸最大产率的目的。为了实现本发明目的，本发明的技术方案为一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法，采用产琥珀酸放线杆菌 Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30 100g/L乳糖的乳清的培养基中发酵产琥珀酸。该技术方案的具体方法是(1)种子培养在100mL血清瓶中进行加入种子培养基为20 80mL，通入N2和C02 的混合气；冷却后接入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113培养；其中，种子培养基(g/L):葡萄糖10(分消)，酵母膏5，NaHC03 10， NaH2P04 2H209. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8，121°C 灭菌 15min ；培养条件为温度30 40°C，摇床转速100 200r/min，培养时间10 16h ；(2)发酵产酸在5L发酵罐中加入发酵培养基体积为2 4L，接种量为3 7%(v/v)，温度为35 40°C，通入含有N2和C02混合气以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速 在100 300rpm发酵时间为30 60h。其中，发酵培养基(g/L)乳清(按含乳糖计)30 100，酵母膏0 10，KH2P04 3， MgCl2 6H20 0. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。其中，乳清的最佳配方为70g/L ；酵母膏为6g/L。本发明技术方案中所述的乳清为工业生产奶酪的副产物，经真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。本发明的有益效果在于(1)本发明利用从瘤胃中筛选出的琥珀酸放线杆菌，它也很适宜于发酵乳清原 料，用其发酵乳清生产丁二酸，可有效减少氮源用量，产物浓度高达47. 51g/L，收率高达 67.9%，很适用于低成本丁二酸的工业化生产；(2)本发明突出的优点是利用廉价乳清原料发酵生产丁二酸，乳清作为一种价格 低廉的粗原料可以替代葡萄糖作为碳源用来发酵生产丁二酸，是一种利用可再生原料的生 产方法，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，对环境友好，并且由于乳清中含有可 供微生物利用的氮源与其他营养成分，因而也能够显著减少发酵的培养基成分。说明书附1乳清发酵过程曲线
具体实施例方式本发明不限于所列出的几个实施例。本发明所使用的菌种琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113(中 国专利菌种，授权公告号为CN100537744C)。本发明所述的乳清为工业生产奶酪的副产物，经真空干燥后含75 80% (w/w)乳 糖。本发明所采用的有机酸的分析方法为高效液相色谱法(HPLC) :HPLC系统高效液相色谱仪，WatersHPLC2010工作站；色 谱柱 Prevail organic acid column 250mmX 4. 6mm ；紫外检测波长 215nm ；流速 lmL/min， 进量20iiL，流动相25mmol/L KH2P04, pH 2. 5 ；柱温室温。重蒸水配制不同浓度的有机酸 (丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka)、乳酸(Fluka))标准溶液，根据峰面积与有 机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。发酵样品经离心稀释后根据峰面积计算各有机酸 含量。本发明所采用的乳糖的分析方法为高效液相色谱法(HPLC)色谱分析柱Bio-red Aminex HPX-87H型离子排斥色 谱柱；检测器ShoSex RI-101型示差折光检测器；流动相5mmol/L H2S04溶液；进样体积 20 ii L。流动相流速0. 6mL/min ；柱温55°C。实施例1(1)种子培养在100mL血清瓶中进行加入种子培养基为80mL，通入N2和C02的混 合气；冷却后接入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113培养；培养条件为温度40°C，摇床转速200r/min，培养时间16h ；
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(2)发酵产酸在5L发酵罐中加入发酵培养基体积为4L，接种量为7% (v/v)，温 度为40°C，通入含有N2和C02混合气以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在300rpm发酵 时间为60h。种子培养基(g/L)葡萄糖10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6， K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8。发酵培养基(g/L)乳清(按含乳糖计)30 100，酵母膏10，KH2P04 3， MgCl2 6H200. 3，CaCl2 0. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。在血清瓶中发酵实验，使用乳清作为碳源，发酵结果见表1。表1不同初始乳糖浓度对乳清发酵制备丁二酸的影响
初始乳糖浓度(g/L) 丁二酸(g/L)乙酸(g/L)甲酸(g/L)收率(％) 从上表可看出，初始乳糖浓度为70g/L时丁二酸产量最高，达到46. 94g/L，丁二酸 收率为67. 1%0实施例2(1)种子培养在100mL血清瓶中进行加入种子培养基为20mL，通入N2和C02的混 合气；冷却后接入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113培养；培养条件为温度30°C，摇床转速lOOr/min，培养时间10h ；(2)发酵产酸在5L发酵罐中加入发酵培养基体积为2L，接种量为3% (v/v)，温 度为35°C，通入含有N2和C02混合气以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在lOOrpm发酵 时间为30h。按实例1的方法，在血清瓶中进行发酵实验，以真空干燥后的乳清的作为碳源，在 发酵培养基中添加不同浓度的酵母膏，其含量为(g/L) :0g、2g、4g、5g、6g、6.5g、7g、8g、9g、 10g。不同酵母膏浓度对乳清发酵制备丁二酸的影响见表2所示。表2不同酵母膏浓度对乳清发酵制备丁二酸的影响
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由表2可知，当酵母膏浓度在6g/L时，丁二酸产量达到46. 75g/L，继续增加酵母膏 用量，丁二酸产量基本无变化。实施例3本实施例在生物法制备丁二酸的过程中实现以乳清为碳源，并通过与少量酵母膏 (6g/L)联用实现菌体发酵制备丁二酸的能力。菌种、具体培养方法同实施例1。初始乳清 70g/L (以乳糖计)。(1)种子培养在100mL血清瓶中进行加入种子培养基为50mL，通入N2和C02的混 合气；冷却后接入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113培养；培养条件为温度37°C，摇床转速150r/min，培养时间12h ；(2)发酵产酸在5L发酵罐中加入发酵培养基体积为3L，接种量为5% (v/v)，温 度为37°C，通入含有N2和C02混合气以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在180rpm发酵 时间为36h。从附
图1可看出，以乳清为碳源，菌体生长旺盛，丁二酸产量可达47. 51g/L，收率 为 67. 9%。
权利要求
一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法，采用产琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培养基中发酵产琥珀酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的具体方法是(1)种子培养在100mL血清瓶中进行加入种子培养基为20 80mL，通入N2和C02的 混合气；冷却后接入产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113培养；(2)发酵产酸在5L发酵罐中加入发酵培养基体积为2 4L，接种量为3 7%(v/ v)，温度为35 40°C，通入含有N2和C02混合气以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速在 100 300rpm发酵时间为30 60h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤⑴中种子培养基(g/L)为 葡萄糖 10(分消)，酵母膏 5，NaHC03 10，NaH2P04 2H20 9. 6，K2HP04 3H20 15. 5 ；pH 6. 8， 121°C 灭菌 15min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的种子培养条件为温 度30 40°C，摇床转速100 200r/min，培养时间10 16h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中发酵培养基(g/L)为 乳清(按含乳糖计)30 100，酵母膏 0 10，KH2P04 3，MgCl2 6H20 0. 3，CaCl20. 3，NaCl 1，Na2HP04 0. 31，NaH2P04 1. 6。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中发酵培养基中乳清含量 为按含乳糖计70g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中发酵培养基中酵母膏含 量为6g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳清为工业生产奶酪的副产物，经 真空干燥后含75 80% (w/w)乳糖。
全文摘要
本发明涉及一种利用乳清发酵生产丁二酸的方法，采用产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113在含30～100g/L乳糖的乳清的培养基中发酵产琥珀酸。本发明利用从瘤胃中筛选出的琥珀酸放线杆菌，它也很适宜于发酵乳清原料，用其发酵乳清生产丁二酸，可有效减少氮源用量，产物浓度高达47.51g/L，收率高达67.9％，很适用于低成本丁二酸的工业化生产；本发明突出的优点是利用廉价乳清原料发酵生产丁二酸，乳清作为一种价格低廉的粗原料可以替代葡萄糖作为碳源用来发酵生产丁二酸，是一种利用可再生原料的生产方法，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，对环境友好，并且由于乳清中含有可供微生物利用的氮源与其他营养成分，因而也能够显著减少发酵的培养基成分。
文档编号C12P7/46GK101857888SQ201010205810
公开日2010年10月13日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者奚永兰, 姜岷, 方晓江, 李建, 杨卓娜, 郑晓宇, 韦萍, 马江峰 申请人:南京工业大学