专利名称：新颖乳杆菌及其组合物和在制备改善糖尿病及其并发症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖乳杆菌及其组合物，以及该新颖乳杆菌和组合物在制备改善糖尿病相关症状及其并发症药物中的应用。
背景技术：
糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种多病因性的代谢疾病，是由于胰岛素分泌或作用产生缺陷而引起广泛性代谢障碍，所引起的疾病。糖尿病是以持续性慢性高血糖为主要特征的疾病，且亦会造成体内蛋白质、脂肪、水、电解质等代谢失调。临床上将糖尿病主要分成二类第一型胰岛素依赖型糖尿病ansulin-d印endent diabetic mellitus, IDDM)， 一般发作年龄为30岁以下者居多，因此过去曾称为"青幼年发病型糖尿病"，事实上任何年龄皆可能发生。第一型糖尿病是一种自身免疫系统对胰脏兰氏小岛(Islet of Langerhans)的β细胞进行攻击破坏的自体免疫疾病(AutoimmuneDisease)。原因与个人的基因遗传、环境因素中的病毒感染、或毒性物质破坏胰脏的β细胞、及自体免疫形成抗 β细胞的抗体、及细胞免疫作用攻击β细胞有关。最后导致患者的胰脏无法正常分泌胰岛素，而极易发生酮酸血症，因此需注射胰岛素来治疗。第二型非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulindependent diabetic mellitus, NIDDM)，大多发生于40岁以后，患者多为体型较肥胖者，过去称为"成年型糖尿病"，但亦可能发生于年轻人，以家族型发病较为常见，此类型糖尿病在台湾占糖尿病总人口数的 95%以上。此类型糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷，及胰岛素抗阻性(insulin resistance) 所引起的；虽有部分患者胰岛素的分泌减少，但大多数患者分泌胰岛素的能力尚可，因此， 大多靠饮食控制及口服降血糖药物控制血糖，而不需立即注射胰岛素治疗。此外，患者大多会伴随胰岛素抗阻性(insulin resistance)的症状。胰岛素抗阻性的形成主要是因胰脏兰氏小岛的β细胞过度地分泌胰岛素(hyperinsulinamia)，造成骨骼肌、脂肪组织及肝脏等周边组织对胰岛素的敏感性(insulin sensitivity)降低。因而减低了组织对葡萄糖的利用率，而造成高血糖的现象。此类型病程进展缓慢，因此，早期并无典型糖尿病症状，不易察觉。但常伴随糖尿病性大血管(如心肌梗塞、脑中风)、小血管(如肾脏、眼网膜及神经病变)等慢性并发症。此外，在第二型糖尿病病患身上经常伴随着脂质代谢异常的情况，如血浆中三酸甘油酯(triglyceride，TG)浓度上升、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度下降以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度上升。这些症状会导致第二型糖尿病患者心血管疾病的风险。 另，根据研究指出，严重糖尿病患者的肝脏血脂值清除能力会下降。当肝脏中三酸甘油脂以及低密度脂蛋白胆固醇不断累积后，肝细胞便会发生病变形成非酒精性脂肪肝进而严重影响肝功能。目前用于治疗糖尿病的方式，除可施予胰岛素外，另分为非药物治疗与药物治疗两种。在非药物治疗方面，主要是通过饮食调控和运动的方式来加以治疗。而在药物治疗方面，主要目的是使不足的胰岛素上升、调降进食后的高血糖和改善胰岛素抗阻性等。目前用于治疗糖尿病的药物可分为(1)磺酰尿素类(Sulfonylurea)此类药物主要作用机制为促进胰脏胰岛素的分泌，特别是加强胰脏β细胞对葡萄糖刺激而释放胰岛素的作用；常用的磺酰尿素类降血糖药物为佑尔康(glibenclamide，商品名euglucon)，克吡噻(glipizide，商品名 minidiab)及岱蜜克龙(gliclazide，商品名diamicron)。然而，此类药物除了已发现的副作用，诸如皮疹、搔痒外，其施用对象亦有其局限，如有严重的肝、肾功能障碍者、孕妇及哺乳者、对磺酰尿素类药物出现严重过敏者均不宜使用这类降血糖药物。(2) α -葡萄糖苷酶(α -Glucosidase)抑制剂此类药物主要作用机制为抑制胰脏α-淀粉酶(a-amylase)及肠内α -葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的活性，进而抑制碳水化合物在肠道的分解及吸收，此类药物能有效的降低饭后血糖及胰岛素浓度，但副作用为腹胀或偶而腹泻、腹痛及呕心。(3)噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione)衍生物此类药物主要作用为增加细胞核内过氧化小体增生活化受体-Y (peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) -gamma)的活性，进而加强了胰岛素的作用，使细胞内葡萄糖转移蛋白GLUT2及 GLUT4增加，将葡萄糖运送至细胞内利用。临床上常使用曲格列酮(troglitazone，商品名 rezulin)、罗格列酮(rosiglitazone,商品名avandia)、皮禾丨J酮(pioglitazone,商品名 actos)等；不过，值得注意的是曲格列酮(troglitazone)曾引起致命的肝毒性，因此，在英国上市(1997年10月)后二个月就被禁止使用。此外，噻唑烷二酮类(Thiazolidinedione) 衍生物也遭美国下令全面回收及禁用。(4)双胍类(Biguanides)双胍类药物为胍(guanidine)的衍生物，目前，双胍类降血糖药物多以metformin为主。此类药物本身不会刺激胰岛素的分泌，其控制血糖作用机制为以下五点a.抑制食欲，因此优先使用于肥胖的第二型糖尿病人身上，使其进食减少、体重下降而改善胰岛素的作用、b.延缓肠道吸收葡萄糖、c.促进葡萄糖在肠道的厌氧性分解作用，进而增加葡萄糖在肠道中的利用，但可能会产生过多的乳酸盐(lactate)，易造成乳酸中毒、d.加强胰岛素在肝脏的作用，因此抑制肝脏的葡萄糖新生作用，减少葡萄糖从肝脏释出、e.促使贮藏于细胞内的葡萄糖转移蛋白GLUT4到细胞表面来参与输送工作， 使细胞表面的葡萄糖转移蛋白量显著增加。此外，这类降血糖药物的副作用，如初服可能有肠胃道的不适，如厌食，恶心、呕吐或腹泻等，少数人可能出现皮疹，且长期使用后均可能会有失活的现象发生。乳杆菌用途甚广，除可用于制备发酵食品外，许多研究亦发现乳杆菌具有多种有益的功能，诸如1.分泌各种分解酵素，帮助食物分解，提高营养价值、2.分解乳糖，改善乳糖不耐症、3.分泌维生素B群、4.维持肠道内正常微生物菌相，抑制有害菌作用、5.改善腹泻或便秘、6.增强免疫系统功能、7.改善肝功能，减低肝的损伤、8.降低血胆固醇、9.具抗癌性及抗致突变性等功能。由于乳杆菌对于宿主有许多有益的功效，因此，乳杆菌对于改善慢性疾病的功能方面也越来越多研究被报导，而糖尿病也是其中之一。此外，用乳杆菌喂食大鼠可以延缓改善糖尿病的发生。现今一些文献或专利中指出喂食糖尿病老鼠乳杆菌可有效的预防糖尿病以及降低血糖的浓度。但是目前已发表有关于乳酸菌改善糖尿病的文献或专利内容中，也仅局限于控制血糖值、体重、血中脂值以及胆固醇浓度。对于其他糖尿病所可能引发的并发症，如体内的发炎反应以及肝脏功能衰退，没有更进一步的改善作用。
发明内容
本发明发明人鉴于糖尿病是需要病患配合、且长期治疗及控制的慢性疾病，且现今糖尿病药物的多种副作用及使用限制。因此，本案申请人希望能利用本土性的乳杆菌菌株，开发出改善糖尿病症状的产品，可在日常生活中供一般使用者或糖尿病患者使用，除由于乳杆菌本身多种有益功能、无副作用外，更可供一般使用者或患者同时改善、控制、治疗或预防高血糖、高胆固醇等糖尿病相关的症状及可能的并发症。本发明的目的即在于提供一种用于改善糖尿病症状的组合物，包含有选自于一已知菌种罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri)GMNL-89，及二株新颖菌种加氏乳杆菌 (Lactobaci 1 Ius gasseri) GMNL-205、及罗伊氏乳杆菌(Lactobaci 1 lusreuteri) GMNL-263 中的至少一种乳杆菌。本发明的次一目的在于提供新的乳杆菌，该新菌株分别经与已知相对所属菌种的关系具有明显差异，为二株新颖乳杆菌。本发明的另一目的在于提供一株已知乳杆菌，及二株新颖乳杆菌的新用途，这些分离株可供罹患糖尿病的对象使用，用以改善其糖尿病症状及其并发症。本发明的再一目的在于提供一种用于改善糖尿病症状及其并发症的组合物的应用，该类应用包含食品、饮品、健康食品、添加物、医疗组合物等日常生活易于使用的形式， 以供一般服用者、或慢性病糖尿病患，可易于长期服用，以达日常保健、或病情控制之效。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案一种用于改善糖尿病症状及其并发症的组合物，包含有效量的选自罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)GMNL—89、力口氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL—205 或罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri)GMNL-263中的至少一种乳杆菌，及药学上可接受的载体。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)GMNL-89,其保藏编号为 CCTCCN0 M207154 ；力口氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL—205 ；力口氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)GMNL-205 的保藏编号为 CCTCC NO :M209262 ；及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263 的保藏编号为 CCTCC NO :M209263。(Lactobacillus reuteri)GMNL-263 经中国典型培养物保藏中心进行细菌学名鉴定，及基因图谱分析后，确认为二株新颖的乳杆菌。将本发明所筛选到的新颖乳杆菌及已知的罗伊氏乳杆菌 (Lactobaci 1 lusreuteri)GMNL-89菌株，分别进行糖尿病动物模式分析，以评估该些乳杆菌分离株是否具有改善糖尿病症状及其并发症的功效。结果显示，本发明所提供的三株乳杆菌分离株，均可改善患有糖尿病对象体内的高血糖值、高血糖值变化量、高糖化血红素比例、高总胆固醇浓度、高LDL/HDL比例、高IFN-Y量、高肝脏三酸甘油脂质浓度及高肝脏胆固醇浓度等糖尿病症状，进而改善糖尿病及其相关并发症。本发明所筛选到的新颖乳杆菌及已知的罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri) GMNL-89菌株，除了有血糖值、血中脂肪以及胆固醇的改善效果之外，对于血中糖化血色素、血液中发炎细胞激素以及肝脏中脂值和肝功能指标GOT、GPT均有更进一步的改善效果。 现有临床上治疗糖尿病的药物副作用均非常的大。相反的，乳杆菌则是安全无虞的益生菌 (Generally Recognized As Safe, GRAS)。因此，利用乳杆菌开发成改善糖尿病的产品，是最自然健康的方法。本发明的罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri)GMNL-89，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2007年11月19日，保藏编号为 CCTCC NO :M207154。本发明的加氏乳杆菌(LactcAacillus gasseri)GMNL-205，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2009年11月13日，保藏编号为 CCTCC NO :M209262 ；本发明的罗伊氏乳杆菌(LactcAacillusreuteri)GMH63，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址在武汉大学)，保藏日期为2009年11月13 日，保藏编号为CCTCC N0:M209263。
请参阅以下有关本发明较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为图1为加氏乳杆菌(LactcAacillus gasseri)GMNL-205在显微镜下的形态图；图二 2加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) GMNL-205的基因图谱；其中M代图二 2加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri) GMNL-205的基因图谱；其中M代表分子标记(Molecular Marker)，分别以箭头指出各片段的分子量大小(bp)；图3为罗伊氏乳杆菌(LactcAacillus reuteri)GMNL-263在显微镜下的形态图；图 4为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263及GMNL-89 的基因图谱； 其中M代表分子标记(Molecular Marker)，分别以箭头指出各片段的分子量大小(bp)；图5A为各组糖尿病大鼠每周体重纪录结果；图5B为各组糖尿病大鼠的脾脏重量测量结果；图5C为各组糖尿病大鼠的肝脏重量测量结果；图5D为各组糖尿病大鼠的肾脏重量测量结果；图6A为各组糖尿病大鼠的每日血糖值纪录结果；图6B为各组糖尿病大鼠的血糖变化量分析结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(P < 0. 05)；图7A为各组糖尿病大鼠的糖化血红素(HbAlc)测量结果；图7B为各组糖尿病大鼠的总胆固醇浓度测量结果；图7C为各组糖尿病大鼠的LDL/HDL比例测量分析结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(P < 0. 05)；图8为各组糖尿病大鼠血清中发炎相关细胞激素IFN-Y浓度测量结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(P < 0. 05)；图9A为各组糖尿病大鼠的肝脏三酸甘油脂(liver triglyceride)测量结果；图 9B为各组糖尿病大鼠的肝脏胆固醇(liver cholesterol)测量结果，*表示数据与安慰剂组相比，具统计意义(P < 0. 05)。
具体实施例方式本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。本发明提供一种用于改善糖尿病症状的组合物，其包含有效量的至少一种选自于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、加氏乳杆菌 (Lactobaci 1 lusgasseri)GMNL-205 或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-263 的乳杆菌，及药学上可接受的载体。其中该罗伊氏乳杆菌(Lactokicillus reuteri)GMNL-89为一种公开的菌种(该菌种的特征及寄存资料已公开于中华民国专利申请案"具有抗发炎活性的乳杆菌分离株及其用途"，其
发明者吕英震, 谢丰钦 申请人:景岳生物科技股份有限公司