专利名称：Ⅱ类猪白细胞表面抗原抑制猪的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种Ii类猪白细胞表面抗原抑制猪。
背景技术：
异种器官移植是将猪的组织器官移植到灵长类动物(猴或人体)，但由于猪的细胞表面存在很多异种抗原，我们必须利用基因敲除或转基因去除猪的方法去除这些抗原并加入人的某些关键基因，猪的II型白细胞表面抗原(SLA-II)不仅是一个主要的异种抗原， 它也能直接激活灵长类受体的CD4细胞，从而引起一系列免疫反应。因此，去除SLA II型抗原能够明显降低供体猪的免疫原性。CIITA(MHC class II Transactivator，组织相容性II类抗原反式激活因子) 对MHC II类分子的表达起着严格且专一的调控作用。人CIITA含有1130个氨基酸 (GenbankNM_000246)。近年发现去除其氨基末端的部分氨基酸后，CIITA成为显性负向突变体(Dominant-negative CIITA,DN-CIITA)[MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,Aug. 1997， P4249-4258]，对正常的CIITA有着显著的抑制作用，从而抑制下游的白细胞表面抗原II类分子的表达。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种II类猪白细胞表面抗原抑制猪，以显著降低作为异种移植供体猪的免疫原性。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下II类猪白细胞表面抗原抑制猪，该猪的II类猪白细胞表面抗原SLA被抑制。上述II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，该方法包括如下步骤(1)构建DN-CIITA表达载体构建DN-CIITA表达载体的方法为提取人淋巴细胞或猪淋巴细胞的RNA，经反转录合成cDNA，DN-CIITA的cDNA缺失前335个氨基酸编码顺序，DN-CIITA cDNA然后插入带有Tie-2增强子、CMV增强子和beta-肌动蛋白启动子的表达载体，并在其5'端加上10个氨基酸的核转移讯号MPKKKRKVHP，构建DN-CIITA表达载体。缺失前335个氨基酸编码顺序的DN-CIITA cDNA按如下RT-PCR反应获得正向引物5'-CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5‘ -ATACAG CCT GGAGAAGAG CTG-3 ‘，反应体系5uL10XLA PCR buffer II，8uL Takara dNTP，10pmol/uL 正向引物禾口反向弓丨物各 2uL,0. 5uL Takara LA taq polymerase, IuL template DNA,31. 5uL PCR gradeH20 ；反应条件94°C，2min；30 个循环，94°C 10sec,60°C 30sec，68°C Imin (之后每个循环比上一个循环延长40sec，直至20min) ；68°C延伸7min ；4°C保存。(2)将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞
将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞的方法为利用电穿孔的方法将线性化的DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞，用G418进行选择，两周后将具有G418抗性的单个细胞克隆进行扩增得到DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞。(3)采用体细胞核转移的技术，将DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞转变为克隆猪转变为克隆猪的方法为体外成熟40 42小时的猪卵子在显微操作下去核，单个 DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞经显微注射进入去核的卵细胞，然后通过电击融合，再次电击来激活核转移的卵细胞，100 150个激活的核转移的卵细胞通过外科手术放入激素诱导发情的受体母猪的输卵管，怀孕猪产下转基因猪。上述II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植排斥反应中的应用。上述II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植急性血管性排斥反应中的应用。有益效果本发明的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的SLA-II类抗原的表达显著降低，特别在其内皮细胞表面，SLA-II类抗原的表达几乎为零，这将大大降低猪器官异种抗原的递呈，也能降低猪器官本身的免疫原性，对抑制异种器官的急性排斥反应有着重要的作用。
图1为流式细胞仪分析DN-CIITA ST细胞中SLA-DR的表达。其中，(a)为ST细胞，(b)为 DN-CIITA ST 细胞。图2为流式细胞仪分析DN-CIITA内皮细胞，其中，(a)为无IFN_r激活的野生型内皮细胞(SLA-DR抗体)；(b)为IFN-r激活的野生型内皮细胞(SLA-DR抗体)；(c)为无 IFN-r激活的DN-CIITA转基因猪血管内皮细胞(SLA-DR抗体)；(d) IFNt激活的DN-CIITA 转基因猪血管内皮细胞(SLA-DR抗体)。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 人CIITA的显性失活突变体(DN-CIITA)表达载体的构建。提取人淋巴细胞的RNA，经反转录合成cDNA。人CIITA显性失活突变体(DN-CIITA) 的cDNA缺失了前335个氨基酸编码顺序。DN-CIITA cDNA由下列引物进行RT-PCR扩增 正向引物5' -CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5' -ATA CAG CCT GGA GAA GAG CTG-3‘，扩增出 2489bp 的 DN-CIITA cDNA(顺序见 SEQ ID No:l)。DN-CIITA cDNA 然后插入带有Tie-2增强子、CMV增强子和beta-肌动蛋白启动子的表达载体，并在其5' 端加上 10 个氨基酸的核转移讯号(MPKKKRKVHP，ATG GGC CCC AAG AAG AAG CGG AAG GTC CAT)，构建成pST205。pST205同时含有SV40_neo基因用于选择转基因的细胞。实施例2 =DN-CIITA cDNA活性的鉴定。猪ST细胞在加10%胎牛血清的DMEM中培养。利用电穿孔的方法将线性化的 PST205转入ST细胞，用800微克/毫升的G418进行选择。两周后将具有G418抗性的单个细胞克隆进行扩增得到ST/DN-CIITA细胞。用PCR的方法鉴定DN-CIITA转基因细胞。单独接种的ST/DN-CIITA和ST细胞用600单位/毫升的猪伽马干扰素(IFN- y ) IFN- γ处理 72小时后，用抗猪SLA-DR的抗体进行标记，并用流式细胞仪进行分析。IFN-Y未处理的 ST/DN-CIITA和ST细胞作为对照。结果显示，IFN-γ处理的ST细胞，其SLA-DR的表达明显的增高。而IFN- γ处理的ST/DN-CIITA细胞，其SLA-DR的表达几乎没有增加(图1)，提示在ST/DN-CIITA细胞中，SLA-DR的表达被DN-CIITA显著地抑制了。实施例3 =DN-CIITA转基因猪原代胚胎成纤维细胞的制备。猪猪原代胚胎成纤维细胞在加20 %胎牛血清和8纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM中培养。利用电穿孔的方法将线性化的pST205转入猪原代胚胎成纤维细胞细胞，用200微克/毫升的G418进行选择。两周后将具有G418抗性的单个细胞克隆进行扩增得到DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞。用PCR的方法鉴定DN-CIITA转基因细胞。实施例4 转有DN-CIITA的克隆猪的制备。利用体细胞核转移的技术来克隆猪。体外成熟40-42小时的猪卵子在显微操作下去核，单个DN-CIITA转基因的原代胚胎猪成纤维细胞经显微注射进入去核的卵细胞，然后两者通过电击融合。再次电击来激活核转移的卵细胞，100-150个激活的核转移的卵细胞通过外科手术放入激素诱导发情的受体母猪的输卵管，利用超声波检测受体猪的受孕情况。怀孕猪在约114天后产下转基因猪。在三周时，剪小猪尾巴，提取其DNA，用PCR方法鉴定DN-CIITA基因。实施例5 =DN-CIITA转基因猪的功能测定。取转基因猪的原代血管内皮细胞进行培养，在600单位/ml的IFN-γ诱导7 后，用抗SLA-DR抗体标记，进行流式细胞分析。结果显示，IFN-Y处理的原代血管内皮细胞，其SLA-DR的表达明显的增高。而IFN-γ处理的DN-CIITA转基因原代血管内皮细胞， 其SLA-DR的表达几乎没有增加(图2)。从而证明在DN-CIITA转基因猪的血管内皮细胞， SLA的表达被完全抑制了。
权利要求
1.II类猪白细胞表面抗原抑制猪，其特征在于该猪的II类猪白细胞表面抗原SLA被抑制。
2.权利要求1所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)构建DN-CIITA表达载体；(2)将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞；(3)采用体细胞核转移的技术，将DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞转变为克隆猪。
3.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤 (1)中，构建DN-CIITA表达载体的方法为提取人淋巴细胞或猪淋巴细胞的RNA，经反转录合成cDNA，DN-CIITA的cDNA缺失前335个氨基酸编码顺序，DN-CIITAcDNA然后插入带有 Tie-2增强子、CMV增强子和beta-肌动蛋白启动子的表达载体，并在其5'端加上10个氨基酸的核转移讯号MPKKKRKVHP，构建DN-CIITA表达载体。
4.根据权利要求3所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于缺失前335个氨基酸编码顺序的DN-CIITA cDNA按如下RT-PCR反应获得正向引物5' -CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5' -ATA CAG CCT GGA GAA GAG CTG-3‘，反应体系5uL 10XLAPCR buffer II，8uL Takara dNTP，10pmol/uL 正向引物和反向弓丨物各 2uL,0. 5uL Takara LA taq polymerase, IuL template DNA,31. 5uL PCR gradeH20 ；反应条件94°C，2min ;30 个循环，94°C lOsec，60°C 30sec，68°C Imin (之后每个循环比上一个循环延长40sec，直至20min) ；68°C延伸7min ；4°C保存。
5.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤O)中，将DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞的方法为利用电穿孔的方法将线性化的DN-CIITA表达载体转入猪原代胚胎成纤维细胞，用G418进行选择，两周后将具有G418抗性的单个细胞克隆进行扩增得到DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞。
6.根据权利要求2所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法，其特征在于步骤(3)中，转变为克隆猪的方法为体外成熟40 42小时的猪卵子在显微操作下去核，单个DN-CIITA猪原代胚胎成纤维细胞经显微注射进入去核的卵细胞，然后通过电击融合，再次电击来激活核转移的卵细胞，100 150个激活的核转移的卵细胞通过外科手术放入激素诱导发情的受体母猪的输卵管，怀孕猪产下转基因猪。
7.权利要求1所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植排斥反应中的应用。
8.权利要求7所述的II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植急性血管性排斥反应中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种II类猪白细胞表面抗原抑制猪，该猪的II类猪白细胞表面抗原SLA被抑制。本发明还公开了上述II类猪白细胞表面抗原抑制猪的构建方法。本发明还公开了上述II类猪白细胞表面抗原抑制猪在减少器官异种移植排斥反应中的应用。本发明的II类猪白细胞表面抗原抑制猪的SLA-II类抗原的表达显著降低，特别在其内皮细胞表面，SLA-II类抗原的表达几乎为零，这将大大降低猪器官异种抗原的递呈，也能降低猪器官本身的免疫原性，对抑制异种器官的急性排斥反应有着重要的作用。
文档编号C12N15/877GK102293181SQ20101020631
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月22日 优先权日2010年6月22日
发明者戴一凡 申请人:南京华贞生物医药科技有限公司