专利名称：表达猪β干扰素的CHO细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达脊椎动物P干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述 动物(3干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达猪(3干扰素的CHO 细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产猪P干扰素标准品的方 法以及通过该方法获得的的猪(3干扰素，其具有极高的比活性和稳定性， 可用作猪卩干扰素生物学活性检测时的标准品和用于猪传染性疾病的预防 和治疗。
背景技术：
I型干扰素是脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分，为现代医学的 重要研究领域。如今，病毒感染宿主时逃避干扰素等天然免疫的机制成为 研究热点[1—3]，这为病毒防治在理论上提供有力支持。猪生殖与呼吸综合症 病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) [4'5]、 伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)[6，7〗、猪动脉炎病毒(swine arterivirus ， PoAV) [8]、猪瘟病毒(swine fever virus) [9"1]和猪传染性胃肠炎病毒 (transmissible gastroenteritis virus, TGEV ) [12]等病毒在感染宿主时，破 坏I型干扰素系统都为它们突破宿主免疫系统的一个重要的机制。
I型干扰素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [13'14]、慢性丙型 肝炎(chronic hepatitis C) [15]、多发性硬化症(multiple sclerosis) [16]、肿 瘤疾病[17'18]及其它疾病[19'2()]的治疗中发挥了重要作用。猪I型干扰素对 TGEV[21]、猪瘟病毒[22]、 PRV^^等常见病毒病的治疗具有良好的前景。 目前，国内猪I型干扰素的生产主要采用原核[25'26]和酵母表达系统[27，28]。
因此，不管是I型干扰素相关的基础研究还是临床使用，都需要高活 性、天然的I型干扰素样品，此外还需要对其生物学活性进行准确、便捷 的定量。干扰素的定量需要稳定的标准品，目前农业部颁布的兽用生物制 品质量标准中的脊椎动物天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性较低，约为
10000 AU， mL'1。哺乳动物细胞表达的脊椎动物干扰素是与其它表达系统 相比能够正确折叠、糖基化和翻译后修饰，因此更稳定、比活性更高、更 适合作为标准品，尤其对于IFN-p，而目前缺乏源于哺乳动物细胞的脊椎 动物猪的IFN-(3标准品。综上，获得高水平哺乳动物细胞表达的脊椎动物 猪I型干扰素具有重要的基础研究和应用研究意义。
发明内容
本发明的目的为建立高效表达猪IFN-(3的CH0-K1细胞表达系统。 具体地，本发明涉及如下各项
1. 一种表达猪卩干扰素的CHO细胞系，其含有编码猪(3干扰素的基因。
2. 根据以上l所述的CHO细胞系，其中所述猪P干扰素的氨基酸序 列如SEQ IDNO:2所示。
3. 根据以上1所述的CHO细胞系，其中所述编码猪(3干扰素的基因 如SEQIDNO: 1所示。
4. 根据以上1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码猪卩干 扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据以上1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2412 的CHO细胞系。
6. —种生产猪(3干扰素标准品的方法，该方法包括
1) 培养根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系；
2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取(3干扰素，用作猪p干扰素 的标准品。 一
7. 根据以上6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2412的CHO细胞系。
8. 根据以上6或7的方法生产的猪(3干扰素标准品。
9. 一种试剂盒，其包含根据以上6或7的方法生产的猪卩干扰素标准 品。所述试剂盒可以用于猪传染性疾病的预防和治疗。
10. 根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的猪|3干扰素
4在制备药物中的应用，所述药物用于猪传染性疾病的预防和治疗。所述疾 病例如是猪生殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病毒、猪动脉炎病毒、猪瘟病 毒和猪传染性胃肠炎病毒等病毒引起的疾病。
更具体地，在本发明的一个实施方案中，把猪(3干扰素(PoIFN-p)的 ORF基因克隆至真核稳定表达载体pCI-neo (PoIFN-|3在高效启动子CMV 控制下表达)，并稳定转染至CH0-K1细胞，经G418压力筛选和2次单 克隆，筛选出可稳定表达重组PoIFN-p的CH0-K1细胞克隆 (CHO-PoIFN-p)。本发明的一株阳性CHO细胞克隆(CHO-PoIFN-P，分 类命名中国仓鼠卵巢细胞(C7n'"e化//amww Ova^ CW/))于2008年3月 25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC， 中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2412。在25cr^的细胞瓶(5ml培养 液)中，重组PoIFN-卩的累积表达水平达到7.7Xl()5AU (antiviral units) /ml，每天的表达量可达4.6Xl()5AU/ml或0.46AU/个细胞。CHO-PoIFN-p 细胞可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。表达的重组PoIFN-P 可以诱导PK15细胞表达猪Mx蛋白。此外，其还可以完全保护PK15细 胞抵抗1000 TCID5Q的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和伪狂犬病毒(PRV) 的感染。综上，本研究中CHO-PoIFN-P细胞稳定、高效表达的重组PoIFN-卩 具有天然猪I型干扰素的生物学活性，具有良好的基础和应用研究价值。
本发明的专利性
新颖性
与已经使用的表达脊椎动物猪P干扰素的技术相比(目前干扰素表达 所采用的表达系统主要是原核、酵母表达系统，使用CHO表达脊椎动物 猪|3干扰素的国内外未见报道)，表达的技术路线完全不同。表达的产物 在折叠、糖基化、翻译后修饰、稳定性、比活性上要大大优于已有的技术 手段(原核、酵母)。
创造性
1、 与己有的原核和酵母表达系统比较，本发明CHO表达系统表达出 的干扰素在蛋白的折叠、糖基化等翻译后修饰上最接近于天然干扰素，比 活性更高，约是原核的10倍；
2、 由于我们的目的是表达最接近天然活性的干扰素，而农业部颁布的兽用生物制品质量标准中的天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导 猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU
mU1。与此相比较，本发明的表达系统的PoIFN-P的表达水平是其70 倍或以上，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。
综上因此以CHO表达的猪P干扰素与原核和酵母表达的相比较具 有极大的优越性和创造性。
附图简述
图1. pCA-PoIFN-J3 (A至D)禾卩pCAGGS (E)转染BHK-21上清的 抗病毒活性滴定。表达pCA-PoIFN-P和pCAGGS的转染的BHK-21的上 清分别被命名为PoIFN-卩pCA和mockpCA， PoIFN-卩pCA稀释IOM咅(A), 105倍 (B)， 1()6倍(C), 10M咅(D)， mockpCA稀释IOM咅(E),并且不含IFN但加入病毒 对照的孔被设定为病毒对照(F);
图2.重组PoIFN-(3在CHO-PoIFN-(3细胞中的表达；
图3.传代次数对CHO-PoIFN-(3细胞表达重组PoIFN-(3的影响；
图4.免疫印迹检测PoIFN-PcHo诱导MDBK细胞Mx蛋白的表达。在 用PoIFN-(3cho刺激后在MDBK细胞中的Mx蛋白的表达是剂量依赖型的。 在缺少(0)或存在(0.37至3.67xl04 AU/ml， A至F)的PoIFN-|3CHO下刺激 MDBK细胞，并通过Western blotting分析。A, 0.37; B， 3.67; C, 36.7; D， 3.67xl02; E, 3.67xl03; F, 3.67xl04;
图5. CHO-PoIFN-p细胞表达的重组PoIFN-P体外抗病毒活性；用10 倍稀释的PoIFN-Pcho (366745 AU/ml)处理PK15细胞24小时，用1000 TCID50 TGEV (A至D)和PRV (W至Z)攻击，当病毒对照孔(D和W)形 成90_100% CPE时，稀释104倍的PoIFN-(3cho(A)可以完全抵抗TGEV 的感染，但105 (B)和106 (C)倍稀释不能。稀释10M音的PoIFN-I3cho(X)可 以完全抵抗PRV的感染，但是10"B)和1()s(C)倍稀释不能。不含干扰素 和病毒的孔被设定为空白孔(O);
图6.猪卩干扰素的氨基酸序列(SEQIDNO:2);
图7.编码猪(3干扰素的基因(SEQIDNO:l);
图8.质粒pCN-PoIFN-卩的核苷酸序歹(J，其中1171-1728位(斜体部分)是PoIFN-p基因，1165-1170 (双下划线标记部分)是Kozak序列。
具体实施例方式
下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例 说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利 要求具体限定。
实施例.高效稳定表达重组猪P干扰素的CHO表达系统的构建及生物活
性检测
1材料与方法
1.1质粒、细胞株和毒株
PK15细胞(ATCC No. CCL-33)由本实验室保存，于含有5。％ FBS 的DMEM培养基中培养。猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV )和伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)商购自中国农科院 哈尔滨兽医研究所，并于PK15细胞上滴定半数组织培养感染剂量(Tissue Culture Infectious Dose50 ， TCID50)。
稳定真核表达载体pCI-neo (pCN)购自Promega公司，neo在SV40 早期启动子的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC (ATCC No. CCL-61), CHO-K1细胞于含10%FBS的DMEM-Ham，s F12 (DF12)培 养基(invitrogen)中培养。pMD18-T载体购自TaKaRa公司；原核表达质 粒pET-32a(+) (Novagen公司)、传代牛肾细胞系(MDBK) (ATCC No. CCL-22)禾口BHK-21细胞(ATCCNo. CCL-10)均由本实验室保存；原代 鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)采用10日龄的SPF 鸡胚常规方法[29]制备；表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP)由本实验室参考文献通过反向遗传技术构建[29]; MDBK细 胞系滴定PFU (plaque forming unit)后-70。C保存；新城疫LaSota株病毒 (CCVC NO. AV1615)商购自中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统 (CCCCM)下属的兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，由本实验室
7保存，CEFs滴定PFU后-7(TC保存备用。 1.2试剂与仪器
T4 DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维 素膜购自Pierce公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自 Sigma公司；高亮萤光素酉每检测i式剂(Bright-Glo Luciferase assay system) 购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司； T4 DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司； 转染试剂Fugene6购自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)购 自Coming公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光； CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。Grace's培养基、DMEM培养 基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司。荧光素(FITC) 标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。DAB显色试剂盒购自博 士德公司。
1.3干扰素基因克隆和质粒构建
从GenBank获取PoIFN-卩的ORF序歹U (Genbank Accession No. S41178),设计引物。上游引物为5，-TGCCACCATGGCTAACAAGTG CAT C，下游引物为5，- AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上游 引物在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列。
PK15细胞生长至密度为90%左右时，按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒。8h后收细胞，用Trizol 提取总RNA，以上述引物进行RT-PCR。扩增的PoIFN-(3 PCR产物亚克隆 到pMD18-T载体获得质粒pMD18-PoIFN-P，测序鉴定。
从质粒pMD 18-PoIFN-卩以I/Sal I双酶切下PoIFN-卩的ORF片断， 分别亚克隆至以I/A%e I双酶切的质粒pCAGGS[3Q'31]，或以T4 DNA聚 合酶平滑化末端后亚克隆至Smal酶切的质粒pCN，获得瞬时真核表达质 粒pCA-PoIFN-(3和稳定真核表达质粒pCN-PoIFN-P。1.4抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献[29]，具体如下MDBK 细胞于96孔细胞板中生长至密度为90%，弃上清，每孔加10倍梯度稀释 IFN样品100pl，每个稀释倍数设3个平行对照孔，37"及5%(302培养条 件下处理24h后，弃上清，用含2。/。FBS的DMEM稀释VSV*GFP，按每 孔30000 PFU (lOOpl)加入病毒稀释液，同时设未经转染上清处理，只加 病毒液的病毒对照(Virus Control, VC)孑L。不加干扰素和病毒的孔，作 为空白孔(BlankControl, BC)。接毒后至VC孔的CPE (cytopathic effect) 约为100%时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最 后所有孔每孔加入50pl细胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，于摇床上裂解15min释放细胞内的 GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性设置为70，激发光485 nm， 吸收光528 nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达水平。判定以BC孔 校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为VC孔50X 的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit, AU)，计 算具体如下。
基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法 如下若绿色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用 F表示，以BC孔校0，则50%病毒复制押制的荧光值(F50) =F (VC) /2，按下面公式计算IFN的抗病毒活性单位logw[每niL中IFN抗病毒活 性单位(AU) ]二[F50—F(小于F50孔)]/[F(高于F50孑L)—F(小于F50孑L)] 十logu)[小于F50孔的稀释倍数]。
1.5瞬时转染
按照Fugene 6 (Roche公司)按操作说明书转染pCN-PoIFN-P和 pCAGGS至BHK-21细胞(ATCCNo. CCL-10)(于含5%FBS的DMEM 中培养，培养条件为37"C及5XC02)，于转染后16 h换新鲜培养基，继 续在相同条件下培养48h收获细胞培养上清，分别命名为PoIFN-(3pCA和 mockDCA，分装并于—7(TC保存备用。1.6稳定转染
首先确定筛选培养基中合适的G418 (invitrogen)浓度，方法如下 24孔细胞培养板接种每孔1000个CH0-K1细胞，并加G418使其浓度分 别为100、 200、 300 1200(ig/ml，选择能在10—14天把细胞彻底杀死的 孔作为G418的筛选浓度。
参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-PoIFN-卩至CH0-K1细 胞。转染后24小时，按1:8的比例进行细胞传代，用含有800 pg/mlG418 的压力筛选培养液筛选培养细胞，10 14天后，用克隆环圈住具有新霉素 抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养 板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5"06个细胞接种于6孔细胞 培养板中生长至密度为100%后24小时，收取细胞培养上清，分别如上用 VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克隆按限稀释法再 进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常规方 法冻存细胞，命名为CHO-PoIFN-卩，含有重组PoIFN-P的细胞培养上清命 名为PoIFN-卩cho。将CHO-PoIFN-卩于2008年3月25日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号 为CGMCC No. 2412。
1.7鸡Mx蛋白多克隆抗体的制备
I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经由JAK-STAT信号 转导途径激活Mx启动子(Mx promoter, Mxp)，表达的Mx蛋白(Mx protein)能够抑制负链RNA病毒复制；Mxp有较好的专一性，它不能被 白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 等其它细胞因子启动。通过对鸡、猪和牛的Mx蛋白氨基酸序列进行同源 性分析，发现有部分同源性，主要位于Mx蛋白的N端，因此设计引物扩 增鸡Mx蛋白的N端序列，长810bp，并克隆到原核表达载体pET-32a(+)， 表达的原核蛋白经Ni-NTA免疫小鼠制备的多抗，用于这三种动物的Mx 蛋白的检测。新城疫病毒MOI为1.0感染细胞密度为约为100X的CEFs，待细胞病 变达60%—80%时收获细胞，用Trizol提取总RNA，并用括号中的引物 (上游引物为5，-GGGGATATC AGC AATCAG ATGGCTTTC-3'，引入 V酶切位点；下游引物为5，-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTT TTG-3，引入I酶切位点)进行RT-PCR，扩增鸡Mx蛋白ORF的前半 部分基因片段，PCR产物以EcaR VASW I双酶切后克隆到同样双酶切的 pET-32a(+)上，获得鸡Mx蛋白的原核表达质粒，鸡Mx蛋白表达框架与 载体上的His标签融合。质粒转化到大肠杆菌BL21中，用0.5mM IPTG 于37'C诱导3小时后，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达。表达产物参照 Ni-NTA琼脂糖亲和树脂纯化说明书纯化后，透析除去尿素。
以纯化的鸡Mx蛋白原核表达蛋白按常规方法免疫BALB/C小鼠(商 购自维通利华公司)，免疫前断尾采血，分离免疫前小鼠血清，然后按常 规程序免疫小鼠并采血分离血清，于-2(TC保存备用。
1.8 Mx蛋白的诱导表达
MDBK细胞于6孔板中生长至单层汇合，分别加入梯度稀释的重组 PoIFN-Pcho， 37。C及5XC02孵育24小时后，用胰酶(amresco)消化细胞， 3000rpm离心5min后收集细胞，加入lxSDS上样缓冲液100(al混匀，于 沸水中煮20min后，进行SDS-PAGE电泳并转印到硝酸纤维素膜，5%鱼 皮蛋白(PBST配制)封闭过夜，以PBST 1:100稀释鸡Mx蛋白小鼠多抗 为一抗，PBST 1:5,000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗，DAB 显色3 5分钟后加去离子水终止。
1.9抗病毒活性研究
PK15细胞于96孔板生长至90%密度时，弃去培养液，加入10倍梯 度稀释的重组PoIFN-(3cHo40(^1， 37。C及5。/^C02孵育24小时后，弃去培 养液，每孔分别加入1000 TCID5Q (20|il)的TGEV和PRV感作1 h后， 去掉病毒液，加入含2XFBS的DMEM继续于37'C及5XC02培养，设未 用IFN处理而加入同样病毒的病毒对照孔(virus control, VC)，和未加干
ii扰素和病毒的空白对照孔(blank control, BC)，至VC孔的CPE为卯X 100%左右时，观察干扰素对TGEV和PRV复制的抑制情况。
2结果
2.1 PoIFN-p稳定表达质粒的构建
PCR产物电泳表明扩增出的PoIFN-P片段为587bp，与预期相符，克 隆至pMD18-T载体后，经测序鉴定证实获得了 PoIFN-(3的完整ORF基因。 再将PoIFN-(3的完整ORF基因亚克隆至真核表达质粒pCAGGS中，构建 成pCA-PoIFN-卩。以pCA-PoIFN-卩和pCAGGS瞬时转染BHK-21细胞， 收获的细胞培养上清分别命名为PoIFN-(3pCA和mOCkpCA，其抗病毒活性用 VSV*GFP于MDBK细胞进行抗病毒活性滴定。结果(图1)显示， PoIFN-(3pCA稀释至106倍仍然有抗病毒活性，结合测序结果可以证实获得 了正确的PoIFN-(3完整ORF基因，可用于下一步构建重组稳定表达载体。
从质粒pMD18-PoIFN-(3以I/Zkz I双酶切下PoIFN-卩的ORF片断， 亚克隆至同样双酶切的质粒pCN，获得稳定真核表达质粒pCN-PoIFN-|3， 其中PoIFN-P在CMV启动子的控制下表达。
2.2稳定表达重组PoIFN-p的CHO-K1细胞克隆的筛选
为了确定筛选培养基中合适的G418浓度，于24孔板中每接种1000 个CHO细胞，G418浓度在700 800|ig/ml之间时，细胞于10—14天全 部死亡。因此选择800吗/ml作为今后实验中CHO细胞的压力筛选培养基 的G418浓度。
转染pCATN-PoIFN-(3至CHO-K1细胞后，只有稳定整合的基因才能 稳定转录，用含有800吗/mlG418的压力筛选培养基筛选具有新霉素抗性 的细胞集落并扩大培养，通过检测各细胞克隆培养上清的抗病毒活性，筛 选出表达量最高的克隆。此后再进行一次单细胞克隆筛选，最后获得单纯、 稳定表达的细胞克隆，液氮存种，命名为CHO-PoIFN-(3。此后CHO-PoIFN-P 细胞以含有400吗/ml G418的压力筛选培养基进行传代。将该 CHO-PoIFN-(3于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2412。
2.3重组PoIFN-p在CHO-PoIFN-p细胞中的表达
CHO-PoIFN-卩(CGMCC No. 2412)细胞于含有10%FBS的DF12培养基 中培养，按l:7传代至25cn^底面积的细胞培养瓶(每瓶加培养液5ml， 长满后约5xl()S个细胞)，待细胞长满后，用3ml PBS洗细胞2次，换新 鲜培养液，然后分别于24、 48和72小时取样，每次取100pl。所取含有 重组PoIFN-p的细胞培养上清命名为PoIFN-pCHO，每次取的样品冻存于 陽70。C备用。所有样品以VSV*GFP在MDBK细胞上于同一批次进行抗病 毒活性滴定，结果如图2所示，最高的累积表达量可达7.7xl05 AU/ml， 24 48h的表达量可达4.6xl()SAU/ml，此时每个细胞每天能够表达约0.46 AU的重组PoIFN-(3，此后培养液中的重组PoIFN-(3 —直维持在约7.5x105 AU/ml左右，不再增加。
2.4 CHO-PoIFN-p细胞表达水平与传代次数的关系
CHO-PoIFN-p细胞分别在含有G418 (400吗/ml)的筛选培养基和不含 有G418的培养基培养传代，于25 cn^的细胞瓶中、37匸及5%002条件 下培养，每3天到4天传一代，基本每周传代2次。分别于第0、 5、 10、 15和20代取样，每种培养条件下的细胞做3个重复。取样前，上述两种 培养条件下的CHO-PoIFN-p细胞以相同细胞密度接种，待细胞形成汇合 单层时，再继续培养24小时取样，样品保存于-7(TC，最后于同一批次进 行抗病毒活性滴定。结果表明(图3)， CHO-PoIFN-(3细胞的重组PoIFN-卩 表达量水平非常稳定，无论是否有G418压力存在，可稳定表达至少20代。
2.5重组PoIFN-p的生物学活性研究
把366745AU/ml的PoIFN-(3CHO (以VSV*GFP于MDBK细胞上滴定 其抗病毒活性，同上)进行10倍梯度稀释(即0.37、 3.67、 36.7、 3.67><102、 3.67xl04n3.67xl04AU/ml)，分别剌激PK15细胞24小时，收获PK15细
胞。然后以鸡Mx蛋白小鼠多抗(制备参见"材料与方法"部分)为一抗，羊抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹检测猪MX蛋白的表达，结果如图4所示
PoIFN-PcHo能够诱导出可检测到的Mx蛋白(分子量约76kDa)下限为3.67 AU/ml，且在3.67 3.67xl04AU/ml范围内，诱导出的Mx蛋白量和 PoIFN-pcHo活性单位成正相关，显示了 PoIFN-Pcho具有良好的I型干扰
素生物学活性。
抗病毒活性滴定结果和Mx蛋白的诱导结果两者相符合，表明 CHO-PoIFN-卩细胞表达的重组PoIFN-卩具备天然I型干扰素的生物学功
2.6 CHO-PoIFN-p细胞表达的重组PoIFN-p体外抗病毒活性研究
为了研究PoIFN-Pcho的体外抗病毒的能力，以10倍梯度稀释的 PoIFN-(3cho (366745 AU/ml)处理PK15细胞24小时，然后分别感染1000 TCID5g的TGEV和PRV，待VC孔形成90 100%CPE时，观察PoIFN-(3CHO 对处理孔病毒的抑制情况，结果(图5)表明104稀释倍数(36.7 AU/ml) 的PoIFN-Pcho能够完全抑制1000 TCID5o的TGEV感染PK15细胞(图5 A D)， 103稀释倍数(367 AU/ml)能够完全抑制1000 TCID5Q的PRY感 染PK15细胞(图5W Z)。并且即使再培养几天，TGEV和PRV也不能 复制产生CPE (数据未显示)，说明PoIFN-(3cHo能够给予PK15细胞充分 的保护，以抵稚P 1000TCID50的TGEV和PRV的感染。
3讨论
本实验建立的CHO-PoIFN-(3细胞能够稳定高水平表达重组PoIFN-(3， 累积表达的最大水平可达约7.7xl05 AU/ml，每天表达水平可达约4.6xl05 AU/ml，平均每个细胞每天能够表达约0.46 AU的重组PoIFN-J3。表达重 组PoIFN-P的CHO-PoIFN-p细胞是在G418的压力筛选下筛出的，但是经 过细胞单克隆筛选出的克隆，无论在有无G418的培养液中传20代，表达 能力基本不变，表明PoIFN-(3的表达框架已稳定整合至CHO-K1细胞的基 因组中。
CHO-PoIFN-p细胞表达的重组PoIFN-p处理PK15细胞后，以鸡Mx蛋白鼠多抗为一抗进行免疫印迹，检测出猪Mx蛋白被诱导表达，且与重 组PoIFN-p的抗病毒活性单位成正相关。这些都表明了 CHO-PoIFN-卩细 胞表达的重组PoIFN-p具有I型干扰素的生物功能，具有良好的天然猪 IFN-卩生物学活性。
哺乳动物细胞表达的IFN-p的糖基化和折叠与天然的完全相同，且正 确的糖基化对于IFN-卩的活性和稳定性至关重要。本研究CHO-Kl细胞稳 定表达的重组PoIFN-(3具有良好的热及振荡等稳定性(数据未显示)，且 具有极高的比活性，既使上清浓縮10倍也不能在SDS-PAGE胶上看到表 达的重组PoIFN-p条带(数据未显示)。
此外，本研究表达的重组PoIFN-p的完全抑制1000TCIDso的TGEV (36.7AU/ml)和PRV (367AU/ml)体外感染PK15细胞，表明了其具有 临床治疗应用的价值。此处可以发现，PoIFN-(3对TGEV (冠装病毒科， 正股单链RNA病毒)抗病毒活性是对PRV (疱疹病毒科，双链DNA病 毒)的10倍，表明PoIFN-J3对RNA病毒的抗病毒能力更强。
农业部颁布的兽用生物制品质量标准中的天然猪白细胞干扰素是以鸡 新城疫病毒诱导猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的 活性约10000 AU/ml。与此相比较，本研究表达系统的PoIFN-P表达水平 是其70倍，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。
结论，本发明人建立的CHO-PoIFN-P细胞表达的重组PoIFN-(3具有天 然猪I型IFN相同的生物学功能，表达水平高，抗病毒活性可达 7.7xl05QAU/ml，且具有极高的比活性和稳定性，可作为猪IFN-P生物学活 性检测时的标准品，在病原一宿主细胞的感染一抗感染天然免疫相关基础 研究中具有重要的应用价值，同时具有良好临床应用前景。参考文献 Weber F, Kochs G， Haller O. Inverse interference: how viruses fight the interferon system [J]. Viral Immunol, 2004， 17(4):498-515 Stetson D B, Medzhitov R. Type I interferons in host defense [J], Immunity, 2006, 25(3):373-381 Sen G C. Viruses and interferons [J], A匪Rev Microbiol, 2001, 55:255-281 Buddaert "W， Van Reeth K， Pensaert M. In vivo and in vitro interferon (IFN) studies
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<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 〈120〉表达猪e干扰素的CHO细胞系及其应用 〈130〉 IB083075 <160〉 2
〈170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 561
〈212〉 腿
<213> 猪
<400> 1
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561<400〉 2
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权利要求
1.一种表达猪β干扰素的CHO细胞系，其含有编码猪β干扰素的基因。
2. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述猪(3干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码猪(3干扰素的 基因如SEQ ID NO: 1所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码猪卩 干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2412的CHO细胞系。
6. —种生产猪卩干扰素标准品的方法，该方法包括1) 培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取(3干扰素，用作猪(3干扰素 的标准品。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2412的CHO细胞系。
8. 根据权利要求6或7的方法生产的猪p干扰素标准品。
9. 一种试剂盒，其包含根据权利要求6或7的方法生产的猪卩干扰素 标准品。
10. 根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的猪卩 干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于猪传染性疾病的预防和治疗。
全文摘要
本发明公开了表达脊椎动物β干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达猪β干扰素的CHO细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产脊椎动物β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的猪β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作猪β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于猪传染性疾病的预防和治疗，具有重要的应用前景和市场前景。
文档编号A61K38/21GK101603032SQ20081010994
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者步志高, 陈伟业 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所