专利名称：表达hERG的稳定细胞系的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及表达电压门控的hERG钾通道的稳定细胞系以及使用所述细胞对化合物测试其抑制hERG电流的能力的方法。
离子通道组成相对小的一组药物靶标，部分因为离子通道筛选测定法难于自动操作并设计为高通量形式。然而，电生理学的新发展(P.B.Bennett等人，Trends in Biotech(2003)21(12)563-69；C.Wood等人，Drug DiscToday(2004)9(10)434-41)重新点燃了将离子通道作为药物开发靶标的兴趣。许多离子通道与遗传性疾病有关，引起用于治疗和预防疾病的离子通道调节剂的研究(D.Owen等人，Drug Disc World(2002)48-61)。
HERG是制药业特别关注的离子通道，尽管更多地是由于安全性/毒理学问题而非开发调节剂的靶标而特别关注(ICH S7B Guidance forIndustry，Oct.2005；J.I.Vandenberg等人，Trends Pharm Sci(2001)22(5)240-46)。电压门控的hERG钾通道造成心脏动作电位快速激活的延迟整流钾电流(IKr)。心电图QT间期延长以及称为Torsades de Pointes(“TdP”；见C.E.Chiang和D.M.Roden，J Am Coll Cardiol(2000)36(1)1-12.；D.M.Roden，N Eng J Med(2004)3501013-22.)的心率失常暗示了药物与hERG钾通道的相互作用。TdP是可以致命的，诱导TdP的危险导致了药品的撤消和不批准。
已证明高通量筛选药物候选物以确定其对hERG的可能作用是困难的，很大程度上是基于不能获得以足够的表面浓度表达hERG、并且是高通量离子流测量仪器的合适受试物的稳定细胞系。
现在我们发明了hERG表达细胞系，使用标准的自动化膜片钳装置，所述hERG表达细胞系以巨大的电流振幅可再现地形成稳定封接(seal)。本发明的细胞系产生了文献中使用非高通量方法所报导的那些代表性IC50值。
本发明的一个方面是表达hERG、并能够展示测试电流的稳定真核细胞系，所述测试电流在对照条件下在一小时内变化低于峰电流振幅的约20％。
本发明的另一方面是确定测试化合物抑制hERG电导活性的倾向的方法，所述方法包括将本发明的细胞与所述测试化合物接触，在电生理条件下测量测试电流并确定在测试化合物存在下测试电流是否较低。
在本公开内容中引用的所有出版物在此以其整体引用作为参考。定义除非另外声明，用于本申请(包括说明书和权利要求书)中的下列术语具有下面给定的定义。必须注意的是，除非上下文另外明确指出，如本说明书及所附的权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“这个”包括复数指代。
“激动剂”指增强另一种化合物或受体位点的活性的化合物。
“拮抗剂”指降低或阻止另一种化合物或受体位点的作用的化合物。
术语“药物候选物”指将测试在治疗动物疾病状态中的可能作用的化合物或制剂，无论所述药物候选物是否具有任何已知的生物学活性。
如此处所用的术语“同源的”指在另一种受试者物种中执行基本相同的功能并与在本领域认为是相同蛋白质的不同形式的蛋白质共享重大的序列同一性，这些蛋白质主要区别在于其被发现的物种的不同。因此，将例如人ERG、小鼠ERG和大鼠ERG都视为彼此同源的。
“调节剂”指与靶标相互作用的分子。调节剂包括但不限于如在本文所定义的激动剂、拮抗剂等。“疾病”和“疾病状态”指任何疾病、状况、症状、不适或适应症。
术语“细胞系”指永生化哺乳动物细胞克隆。“稳定的”细胞系是随时间(例如每次倍增)基本表现一致特征的细胞系。在本发明范围内的稳定的细胞系提供了细胞的实质部分，所述细胞能够提供高于约50MOhm的封接电阻(seal resistance)、高于约200pA的电流振幅，并提供了在对照条件下一小时内变化不高于约20％的电流振幅。
如此处所用的术语“子代”和“后代”指通过培养或生长本发明的细胞而获得的细胞。如此处所用的术语“衍生细胞”指通过修饰、融合、转染、转化或改变本发明的细胞而获得的细胞。例如，可以通过以质粒或病毒转染本发明的细胞、通过将其融合为杂交瘤细胞等产生衍生细胞。
术语“电生理学测量法”或“膜片钳实验”指实验程序，其中，将部分或全部细胞膜(一般在分离的细胞中)的电势保持在预先确定的电压、然后经过一次或多次电压改变，在此期间或此后测量通过膜的电流。在此所用的hERG测量实验中，首先把在其表面表达hERG的细胞电压钳制于-80mV的保持电位，从100毫秒脉冲至-40mV、随后于20mV1000毫秒(预脉冲)和于-40mV500毫秒(测试脉冲)计算漏减(leak subtraction)。以渗漏电流校正后，将于-40mV测量的hERG电流作为最高峰(测试脉冲的开始)。可以应用所述方案的变通方案。在测试脉冲期间测量由于药物与hERG钾通道相互作用导致的hERG电流抑制，并记录为“测试电流”。在本发明的细胞系中，测试电流在对照条件下持续直至一小时变化低于约20％。术语“膜片钳设备”指适于实施这类测量的任何仪器或装置，例如标准膜片钳、IonWorks HT、IonWorks Quattro、PatchXpress 7000A等。
“受试者”包括哺乳动物和鸟类。“哺乳动物”指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人；非人类灵长动物，例如黑猩猩以及其他猿和猴种；畜牧动物例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。术语“受试者”不表示特定年龄或性别。
疾病状态的“治疗”包括(i)预防疾病状态，即，使得可能暴露于或倾向于疾病状态、但是尚未经历或表现该疾病状态症状的受试者不出现该疾病状态的临床症状；(ii)抑制疾病状态，即，阻止疾病状态或其临床症状的进展；或(iii)缓解疾病状态，即，引起疾病状态或其临床症状的暂时或持续退化。
在此确认的所有专利和出版物在此以其整体引用作为参考。
一般方法本发明提供表达hERG并适于用于自动化高通量电生理学测定法的细胞系、以及使用这类细胞对化合物筛选可能的hERG抑制活性的方法。
由于其适合悬浮生长的事实，将本发明的细胞系设计用于平面膜片电生理学系统。它们已经被用于像IonWorks HT平面膜片系统和PatchXpress 7000A这类系统，但是也可以用于其他装置或系统。
可以使用Ex-cell301(JRH，目录号JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目录号16140-089)和0.25mg/ml遗传霉素(Gibco，目录号10131-035)悬浮培养细胞系。优选于35±2℃(补充5％CO2)以50-100ml的体积在1升摇瓶中于90-100转/分钟(rpm)(2英寸摇动振幅)培养细胞。为了最佳性能，将细胞滴定度(titer)保持在约105至约106个细胞/ml之间。
可以通过标准方法(例如在细胞裂解后通过蛋白质印迹)验证hERG的表达。hERG电流的表达可以依赖于细胞培养条件而变化。
可以使用标准膜片钳方法评价细胞系的稳定性，所述标准膜片钳方法包括钳制从该细胞系获得的细胞，将其脉冲，并在多个时间点测量引起的电流。在本发明的稳定的细胞系中，电流在对照条件下一小时内变化不超过20％。
对于贴壁细胞，移动通常需要使用解离试剂，例如添加胰蛋白酶或VerseneTM的培养基。对于适应悬浮的细胞，一般不需要解离试剂。在实验使用之前将细胞重悬于电生理学记录溶液中。
于测试化合物存在或不存在下对本发明的细胞实施hERG电流测量。对于筛选目的，记录测试化合物将hERG电流抑制约50％或更高的浓度就足够了。
在本发明方法的实践中，将来自本发明细胞系的细胞与测试化合物接触或暴露于测试化合物(任选地包括阳性和阴性对照化合物)，并通过确定在电生理学测量期间对电流的影响(如果有任何影响)而测量对hERG活性的抑制程度。因此，例如，人们可以将本发明的细胞应用于膜片钳设备基质，并将个别细胞与测试化合物接触。测试化合物可以以多个浓度使用、或可以以预先确定的浓度使用(例如10μM、20μM、50μM等)。一般将化合物溶解于电生理学记录溶液中。然后如在此所述将细胞膜片钳制并脉冲，并检测测试电流。将引起测试电流实质性降低的化合物视为在该浓度抑制hERG活性。优选地，将测试电流与一个或多个对照比较，所述对照可以是应用测试化合物之前的本发明的相同细胞，或者可以是基本相同的细胞(例如，来自相同细胞培养物)并受试于阳性和/或阴性对照化合物。
效用本发明的细胞系可用于以稳定的产量提供hERG的细胞表面表达，并作为使用电生理学方法进行高通量hERG活性筛选的合适基质(substrate)。因此，使用本发明的细胞系，人们可以快速并有效地对药物候选物筛选其与hERG的可能的相互作用。本发明的方法可用于药物候选物及其他化合物的高通量筛选，以确定其对hERG的相互作用和/或调节、及其少许潜在的心脏毒性。
实施例提供下列制剂及实施例以使本领域技术人员更清楚地理解并实施本发明。不应将其理解为限制本发明的范围，而是仅仅作为其说明和代表。
细胞培养基成分包括Ex-cell 301(JRH，目录号JRH-14331)、10％胎牛血清(Gibco，目录号16140-089)及0.25mg/ml遗传霉素(Gibco，目录号10131-035)。于35±2℃(补充5％CO2)以50-100ml的体积在1升摇瓶中于90-100rpm(2英寸摇动振幅)培养细胞。为了最佳性能，将细胞滴定度保持在约105至约106细胞/ml之间。
标准和自动化膜片钳(PatchXpress 7000A)二者的电生理学记录溶液包括内部缓冲液(mM，除非另外指出，来自Sigma)140KCl(目录号P-9541)、6EGTA(目录号E-3889)、5Hepes(目录号H-3784)、5MgCl2(目录号M-1028)、5ATP-Na2(目录号A-2383)，以KOH(J.T.Baker，目录号3143-01)调至pH7.2；外部缓冲液(mM，除非另外指出，来自Sigma)150NaCl(目录号S-3014)、10Hepes(目录号H-3784)、4KCl(目录号P-9541)、1.2CaCl2(目录号C-3306)、1MgCl2(目录号M-1028)以HCL(J.T.Baker，目录号5619-02)调至pH7.4。膜片基片包括MolecularDevices Corp供应的PatchPlatesTM(目录号9000-0688)和SealChipsTM(1-SealChip16-K)。
电生理学电压脉冲方案保持电压为-80mV，从100毫秒脉冲至-40mV、随后为于20mV(预脉冲)1000毫秒、以及于-40mV(测试脉冲)500毫秒计算漏减。以渗漏电流校正后于-40mV测量hERG电流作为峰(测试脉冲的开始)。
IC50曲线的产生及统计在Excel Fit(版本3，ID-BS)中以FourParameter Logistical Model或Sigmoidal Dose Response Model，Equation205拟合浓度-反应曲线。抑制分数(I化合物/I对照)＝1/(1+[化合物]/IC50)nH，其中I为电流，IC50为将电流抑制50％所需的化合物浓度，且nH为Hill系数。
实施例1表达hERG的CHO-K1细胞系(A)如下产生稳定表达高水平功能性hERG通道的CHO-K1细胞。首先，以编码(CMV-启动子-蓝色荧光蛋白-IRES-潮霉素抗性标记)盒的质粒转染野生型CHO-K1细胞。两个不同的loxP位点定位于该构建体上，一个在CMV-启动子和蓝色荧光蛋白(cyan fluorescence protein)ORF之间，且一个在潮霉素抗性标记3’末端。从生长在潮霉素中的随机CHO细胞转染子中，基于其高水平的蓝色荧光蛋白表达而选择一个细胞系。这些水平经过多个世代保持稳定；基因组DNA印迹法证实出现了单个染色体整合事件。然后通过CRE重组酶介导的交换将(loxP-hERG-IRES-新霉素抗性标记-loxP)盒重组至所述受体细胞系。通过i)不存在蓝色荧光蛋白，ii)对潮霉素敏感，以及iii)成功的基因组DNA PCR证实所选CHO细胞克隆中的正确重组事件，所述基因组DNA PCR使用定位于CMV启动子中的正向引物及hERG-ORF中的反向引物。五百万个细胞的转染及后来的选择产生16个满足上述三条标准的克隆。扩增这些克隆，并且通过蛋白质印迹分析hERG蛋白质的表达以及在Ionworks仪器上分析hERG离子通道活性。然后使得到的一个细胞系(“CHO crelox hERG UG#7”)适应于悬浮生长。通过在Ex-cell 301培养基、5％FBS、0.25mg/ml G418中将细胞稀释到75万/ml而制备起始悬浮培养物。该培养物培养24小时，并达到约106个细胞/ml的密度。然后将其在新鲜培养基中稀释至20万细胞/ml，并培养72小时以达到106细胞/ml的密度。将此稀释-转移重复四次，在此点认为细胞适应于悬浮培养。在布达佩斯条约(Budapest Treaty)规定下，于2005年6月22日将所述细胞系(CHO crelox hERG UG#7)以保藏号PTA-6812保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
实施例2表达hERG的细胞的评价使用IonWorks HT仪器对细胞系的描述已经记录于H.Guthrie等人，(2005).“A Place for High Throughput Electrophysiology in CardiacSafetyGenerating a Novel hERG Cell Line and Screening Early withIonWorks HT.”J Biomol Screening(2005)10(8)832-40。
使用PatchXpress 7000A仪器对细胞系的描述已经记录于L.Guo和H.Guthrie(2005).“The Role of Automated Electrophysiology in thePrediction of QT Prolongation.”J Pharmacol Toxicol Methods52(1)123-35。
实施例3
hERG活性的高通量筛选细胞系CHO crelox hERG UG#7展示800pA的平均电流振幅，＞80％的封接成功率(seal rate success)、100-200MOhm之间的封接以及高于80％的总体成功记录，并获选用于化合物文库筛选。筛选三百种化合物以发现在施用30μM化合物之后将hERG电流抑制＞50％的那些化合物。将来自若干计划的化合物用于筛选，尽管本实验是盲法实施的，在使用标准膜片钳研究时已经知道其中某些化合物阻滞hERG通道。在96孔板上制备三个化合物板，并将各板运行两次，每板大约90种化合物(将各化合物测试四次)。采用384孔PatchPlate，在一个八小时工作日内完成300种化合物单点筛选。使用化合物板的一次运行占用大约40分钟。总体而言，各化合物用于八个PatchPlate孔，通常使得一个浓度下三至八个成功细胞(数据点)。
筛选期间，将各化合物浓度筛选两次以保证每个数据点的足够数量的细胞。由于成功率的变异性，八孔的冗余是必要的。因此对于各化合物可以使n值具有从一到八的范围。因为细胞系内细胞与细胞间的变异性，重复的PatchPlate孔也是重要的。
图1显示在(非连续的)九个实验日以CHOcrelox hERG UG#7细胞系观察到的变异性。在此期间，在最初的细胞系评价之后，该细胞系产生650pA的平均电流振幅，所述平均电流振幅从该研究的细胞系评价期所观察到的800pA降低至此。电流稳定性是高的并且接近90％。尽管用于这些实验的重复可能增加了我们的筛选时间，但是在指定筛选时间内产生了足够数据。使用组合了Population Patch ClampTM技术的新的IonWorks Quattro技术(PatchPlate孔中记录孔数量增加)，将消除这里实行的冗余。
在30μM，160种化合物阻滞hERG电流＞50％。使用八点浓度反应以IonWorks HT系统重新筛选这样鉴定的160种化合物。每次运行与阳性(氟哌啶醇)和阴性(含0.1％DMSO的PBS)对照一起筛选五种药物。以IonWorks HT产生的平均氟哌啶醇IC50为0.74+0.36μM(来自31个实验)。在不同实验条件下于37℃以不同细胞系收集的关于氟哌啶醇的传统膜片钳数据从0.025至0.12μM变化。这160种化合物筛选占用五天以完成在16个PatchPlate孔中测试的单个浓度。如前所讨论的，化合物测试中的冗余是为了保证产生大量数据点以建立数据集的可靠性。由于该子集中所有化合物均经过标准膜片钳测试，为进一步评价，选择来源于一个计划的一个数据集。传统膜片钳数据与IonWorks HT数据正相关(Spearman r＝0.53，p＜0.004)。在IonWorks HT上产生hERG IC50值＞30μM的化合物具有20.2+10.0μM(SD)的平均标准膜片钳IC50值。在略微不同的条件下收集标准膜片钳值，所述略微不同的条件包括全细胞结构(相对于穿孔膜片)、电压脉冲方案、记录溶液、细胞系(CHO-hERG)、温度(37℃)和分析方法。一些化合物表现对IonWorks HT系统较低效，而一些甚至略高效。然而，两组的平均IC50值没有表现出统计学差异。
尽管以其具体实施方案对本发明进行了描述，但是本领域技术人员应当理解，可以进行多种改变并且可以用等同物替代而不背离本发明的实质精神或范围。另外，可以进行许多修改以使具体情况、材料、物质组成、方法、工序或步骤适应于本发明的客观精神和范围。确定所有这些修改在此处所附的权利要求的范围内。
权利要求
1.稳定的真核细胞系，所述细胞系表达hERG并在对照条件下显示出测试电流的变化低于20％。
2.权利要求1的细胞系，其基本由CHO crelox-hERG UG#7、ATCCPTA-6812、或其子代、衍生细胞或后代组成。
3.权利要求1的细胞系，其基本由ATCC PTA-6812、或其子代、衍生细胞或后代组成。
4.确定测试化合物抑制hERG的能力的方法，所述方法包括a)提供稳定的真核细胞，所述细胞表达hERG，并在对照条件下于膜片钳设备中的连续电生理学测量中显示出测试电流的变化低于20％；b)将所述细胞与测试化合物接触；c)在膜片钳设备中测量测试电流；并d)确定在所述测试化合物存在下测试电流是否降低。
5.权利要求4的方法，其中所述稳定的真核细胞包括CHOcrelox-hERG UG#7(ATCC PTA-6812)。
6.权利要求4的方法，其中在将所述细胞与所述测试化合物接触之前和之后比较所述细胞中的所述测试电流。
7.权利要求4的方法，其中在所述测试化合物不存在时将所述细胞中的所述测试电流与基本相同的细胞中的测试电流比较。
8.权利要求4的方法，其中将所述细胞中的所述测试电流与基本相同的细胞中的测试电流比较，所述基本相同的细胞已经与已知不具有hERG抑制作用的化合物接触。
9.权利要求4的方法，其中将所述细胞中的所述测试电流与基本相同的细胞中的测试电流比较，所述基本相同的细胞已经与已知显示出不可接受水平的hERG抑制的化合物接触。
全文摘要
提供了表达hERG并在电生理学测试条件下显示稳定电流的稳定的真核细胞系。
文档编号C12N15/12GK1986783SQ20061016924
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月21日 优先权日2005年12月21日
发明者P·迪特里希, U·古布勒, H·格思里, B·科克 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司