一种赤眼鳍条细胞系及其建立方法与应用
【专利摘要】一种赤眼鳟鱼鳍条细胞系及其建立方法与应用，该赤眼鳟鱼鳍条细胞系的保藏号为CCTCC NO：C201642，是赤眼鳟的尾鳍经过原代培养、传代培养所得，所用的培养基为Leibovitz’sl?15培养所制得。所述赤眼鳟鱼鳍条细胞系的生物学特性包括：细胞为成纤维样细胞，细胞在含有20％体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl?15培养基在25℃恒温培养箱中呈最适状态。在此生长条件下复苏后的细胞经胎盼蓝染色，细胞的成活率达82.5％，细胞呈成纤维样，生长旺盛，其特征染色体数目为48条。另外，将质粒pEGFP?N1转入该细胞系中表达显示荧光。本发明的细胞系能应用于支持草鱼出血病病毒的生长与复制中，不仅可以用于外源基因的表达，还可以运用于毒理学。CCTCC NO：C20164220160316
【专利说明】
一种赤眼鳍条细胞系及其建立方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及动物细胞技术领域，具体涉及一种赤眼鳟鳍条细胞系，同时涉及该细胞系的建立方法与应用。
【背景技术】
[0002]草鱼属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，是中国主要淡水养殖对象。然而草鱼在养殖过程中，草鱼出血病一直非常突出，已严重影响了草鱼的养殖产量。赤眼鳟(Squal1barbus curricuhs)在分类学上属于鲤形目鲤科雅罗鱼亚科赤眼鳟属，俗称红眼鱼，是优质的经济鱼，其分布广泛，几乎遍布全中国各大水系。赤眼鳟因其病害少、肉质鲜美、适应性强，常用以研究。通常研究是以赤眼鳟为母本，草鱼为父本进行远缘杂交试验，对抗病机理进行分析。该赤眼鳟细胞系的建立可以为研究遗传学提供材料，还可以运用毒理学。
【发明内容】
[0003]本发明的主要目的是，基于上述问题，提供一种赤眼鳟鳍条细胞系SCF及其建立方法与应用。
[0004]上述赤眼鳟鱼鳍条细胞系SCF，保藏号为CCTCC NO:C201642，于2016年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0005]本发明还提供上述赤眼鳟鳍条细胞系SCF的建立方法，该方法包括以下步骤:
(I)制备细胞培养液:以Leibovitz’sl-15培养基为基础培养基，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清配置成细胞培养液;该细胞培养液中，胎牛血清占该细胞培养液总体积的25%，表皮生长因子的终浓度为1ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为 10ng/ml ；
(2 )原代培养:取健康的赤眼鳟，于20mg/ml的高锰酸钾液中浸泡30min，然后用75%质量浓度的酒精喷洒鱼体后擦干，在超净工作台内，剪取鱼体的尾鳍组织，转移至含有0.25%胰蛋白酶的培养皿中培养15min，用灭菌剪刀将尾鳍组织块剪成大小为1.5_3的小块，剪成的组织小块先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml的两性霉素B的磷酸缓冲液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml两性霉素B的Leibovitz’sl-15培养液洗I次;将漂洗过的组织小块均匀接种在没有加任何培养基的25cm2细胞培养瓶中，于25°C培养箱倒置干贴5h;再于该细胞培养瓶中加入原代培养所需的前述制备的细胞培养液lml，前20d每天更换该细胞培养液；
(3)传代培养:待原代细胞单层铺满细胞培养瓶时，取出组织小块，将组织小块用磷酸缓冲液清洗一次，再用Iml0.25%胰蛋白酶对细胞静止消化，待细胞开始收缩变圆成单个细胞时，加入2ml新鲜的细胞培养液中和终止消化，吸出加入的胰蛋白酶溶液和细胞培养液，再加入5ml新鲜的细胞培养液，吹打制成细胞悬液，于25 °C恒温培养箱中培养，待细胞再次形成单层时，进行下一次传代。
[0006]按照步骤(3)的过程传代，10代后所用培养基为含有20%血清的Leibovitz’sl-15培养基。该赤眼鳟鳍条细胞于20%血清的Leibovitz’sl-15培养基中25 °C下呈现最适生长。
[0007]上述赤眼鳟鳍条细胞系可以运用于外源基因的表达，质粒pEGFP-Nl在该细胞系中表达显不灰光。
[0008]本发明同时提供所述赤眼鳟鳍条细胞系SCF在支持草鱼出血病病毒(GCRV)的生长和复制中的应用。
[0009]本发明的优点:在组织块制备时，用0.25%的胰蛋白酶除去多余的组织，有利于较快的获得成纤维细胞，减小杂质细胞对所要获得细胞的影响；用含有抗生素的磷酸缓冲液漂洗三次后，用含有抗生素的Leibovitz’sl-15漂洗一次，使组织块获得一定营养，延长倒置干贴的时间，使其贴壁率上升。本发明的优点在于可以较快获得大量成纤维细胞;本赤眼鳟鳍条细胞系不仅能运用于外源基因的表达，还能用于病毒学、毒理学、遗传学等。
【附图说明】
[0010]图1是显微镜下本发明赤眼鳟鳍条细胞的原代培养图。
[0011]图2是显微镜下本发明赤眼鳟鳍条细胞的传代培养图。
[0012]图3是赤眼鳟鳍条细胞在不同血清浓度下的生长曲线图。
[0013]图4是赤眼鳟鳍条细胞在不同培养基类型的生长曲线图。
[0014]图5是质粒pEGFP-Nl在赤眼鳟鳍条细胞中表达显示的荧光图。
[0015]图6是接种草鱼出血病病毒后，赤眼鳟鳍条细胞系的形态图。
[0016]图7是赤眼鳟鳍条细胞染色体图，右图显示48条染色体。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合附图对本发明提供的具体的实施方式作详细的说明。
[0018]实施例1本发明赤眼鳟鳍条细胞系的建立
(I)制备细胞培养液
以Leibovitz’sl-15培养基为基础，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清，配置成细胞培养液。该培养液中，胎牛血清占该细胞培养液总体积的25%，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，配制成的细胞培养液于4°C保存。
[0019](2)原代培养
取健康的赤眼鳟，于20mg/ml的高锰酸钾液中浸泡30min，然后用70%质量浓度的酒精喷洒鱼体后擦干，在超净工作台内，剪取鱼体的尾鳍组织，转移至含有0.25%胰蛋白酶的培养皿中培养15min，用灭菌剪刀镊子刮去多余的组织，并用剪刀将组织块剪成大小为1.5mm3的小块，剪成的组织小块先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml的两性霉素B的磷酸缓冲液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml两性霉素B的Leibovitz’sl-15培养液洗I次。将漂洗过的组织小块均匀接种在25cm2细胞培养瓶(该培养瓶未加任何培养液)中，于25°C培养箱倒置干贴5hο于该细胞培养瓶中加入原代培养所需的前面步骤(I)制得的细胞培养液lml，前20d每天更换该细胞培养液观察(结合参见图1)。
[0020](3)传代培养
待原代细胞单层铺满细胞培养瓶时，移出细胞培养瓶中的细胞培养液，取出组织小块用磷酸缓冲液清洗一次，再用Iml的0.25%胰蛋白酶对细胞静止消化，待细胞开始收缩变圆成单个细胞时，用2ml前述制备的新鲜的细胞培养液中和终止消化，吸出液体(液体是指细胞培养瓶中加入的胰蛋白酶溶液和细胞培养液)，再加入5ml前述制备的新鲜的细胞培养液，吹打制成细胞悬液，于25 °C恒温培养箱中培养(结合参见图2 )。待细胞再次形成单层时，进行下一次传代。
[0021]实施例2细胞的保存与复苏 A液和B液的配置:
A液:按体积比由40%胎牛血清、20%二甲基亚砜及40% Leibovitz’s 1-15培养基配制而成。取lml A液放入冻存管中，并在冻存管上标记冻存日期、细胞名称、培养基类型、血清浓度。
[0022]B液:常规的Leibovitz’ sl-15培养液(不含有胎牛血清)。
[0023]细胞的保存:取生长旺盛的赤眼鳟鳍条细胞，用磷酸缓冲液洗一次后，用Iml
0.25%胰蛋白酶消化，待细胞收缩快成单个时，吸出胰蛋白酶。用2ml专用培养基(该专用培养基中胎牛血清占该培养基总体积的20%)中和，再吸出专用培养基。用Iml B液吹悬细胞加入上述含有A液的冻存管底部。将冻存管放入东村盒中，置于_80°C超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。
[0024]细胞的复苏:取液氮中保存的细胞，在37°C水浴锅中解冻，待细胞即将融化完全时转入离心管中，加入3 m I专用培养基(该培养基中胎牛血清占该培养基总体积的2 O % )，1000rpm/min离心5min，弃上清液，用专用培养基重悬细胞，在25°C恒温培养箱中培养24h后，更换专用培养基，继续培养。同时，取少量的解冻细胞，加入台盼蓝(Trypan Blue)，用血球计数法计数，活的细胞为白色，死的为蓝色。计算细胞的存活率。复苏细胞的存活率为82.5%左右，细胞呈成纤维样，生长旺盛。
[0025]实施例3细胞最适生长条件的确定
最适血清浓度的确定:将初始密度为20 X 16个/ml的赤眼鳟鳍条细胞分别种植在含有体积分数分别为5%、10%、15%、20%的FBS的Le i bo v i t i z ’ s 1-15培养基(该培养基中还添加有表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，该培养基中表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，)的25cm2培养瓶中。在第2、4、6、8、10、12天分别用
0.25%胰蛋白酶消化细胞，在血球计数板计数并绘制生长曲线。结果参见图3，细胞生长速度随着FBS浓度的增加而加快，在该含有FBS的Leibovitiz’sl-15培养基中，FBS的体积分数为20%时细胞生长速度最快。表明:本发明所建立的赤眼鳟鳍条细胞在含20%体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培养基中最适生长。
[0026]最适培养基类型的确定:将初始密度为20X16个/ml的赤眼鳟鳍条细胞分别种植在含20%体积分数的FBS的Leibovitiz’sl-15(简称L-15)培养基、M199培养基、R-1640培养基和MEM培养基的25 cm2培养瓶中。在第2、4、6、8、1、12天分别用0.25%胰蛋白酶消化，在血球计数板计数并绘制生长曲线。结果见图4，细胞在含20%体积分数的FBS的L-15培养基中明显高于其他培养基;在含20%体积分数的FBS的MEM培养基中生长缓慢，直至死亡。
[0027]实施例4细胞的转染将质粒pEGFP-Nl转入赤眼鳟鳍条细胞中的步骤如下:将赤眼鳟鳍条细胞接种到6孔板中，第二天，待细胞密度达到80%以上时，进行细胞的转染实验。将1ul pEGFP-Nl加入到含有240ul常规Leibovitz’sl-15培养液的管中，将5ul Lipofectamine2000加入到含有245ul常规Leibovitz’sl-15培养液的另一管中。5min后，将上述两管溶液混合，室温放置20min，再于25 °C培养5h，然后将混合溶液中的培养液替换为专用培养基(该培养基中含有20%体积分数的胎牛血清)，24h后，在显微镜下观察显示荧光，结果参见图5，质粒pEGFP-Nl转入赤眼鳟鳍条细胞，显示荧光。说明赤眼鳟鳍条细胞系能用于外源基因的表达。
[0028]实施例5病毒的敏感性
病毒按照梯度稀释，取10个EP管依次标上编号，在第一个EP管中加入Iml的草鱼出血病病毒，后面9个EP管都加900ul不含有胎牛血清的培养基(这个培养基指不加任何物质的常规L-15培养基)，第二个EP管从第一个EP管中吸取10ul的病毒，后面的EP管依次从前一个EP管中吸取 I OOul 的病毒液，使得病毒按照 10°，10—1，10—2，10—3，10—4，10—5，10—6，10—7，10—8，10一9的梯度稀释。取96孔板作上标记，以2组只含常规L-15培养基的为对照组，后10组依次从浓度低的加入到96孔板中，每一排加入10ul的病毒液。从用专用培养基培养赤眼鳟鳍条细胞的培养瓶中吸出专用培养基，将吸出的专用培养基放入离心管中以3000r/ min离心5min，而该培养瓶中加入Iml 0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，轻拍使得细胞从培养瓶脱落，再于该培养瓶中加入2ml前述离心后的上清液中和，吸出上清液，将上清液放入离心管中以I OOOr/min离心5min，弃掉离心后的上清液，再用含有2%体积分数的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培养基吹悬细胞，再将吹悬的细胞加在上述作有标记的96孔板中，每孔滴加I滴的细胞悬液，用封口膜封口，放入25 0C培养观察。细胞出现病变效应，测得TCID5Q=10—8.52/0.1ml。表明:本赤眼鳟鳍条细胞系对草鱼出血病病毒有易感性。
[0029]实施例6染色体分析
赤眼鳟鳍条细胞传代培养24h后，向培养瓶加入终浓度为lug/ml的秋水仙素，置于25°C恒温培养箱继续培养14h，然后用Iml 0.25%胰蛋白酶消化，再用2ml专用培养基中和终止消化，将消化为单个的细胞转入离心管，以1500rpm/min离心5min，收集细胞。用冰的双蒸水低渗，然后用固定液(固定液按体积比甲醇:冰乙酸为3:1配置)固定20min，重复3次后滴片，自然干燥后用Giemsa染液染色。
[0030]显微镜下观察拍照，染色体数目计数，根据染色体的着丝点位置、臂长等特征对染色体进行分组、配对，显示染色体数目为48条，见图7。
[0031 ] 本文中的0.25%膜蛋白酶购置于So Iarb1公司。
[0032]本文中提及的专用培养基是以Leibovitz’sl-15培养基为基础培养基，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清配置成，其中，胎牛血清占该培养基总体积的20%，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml。
【主权项】
1.一种赤眼鳟鳍条细胞系SCF，保藏号为CCTCC NO: C201642。2.如权利要求1所述的赤眼鳟鳍条细胞系SCF在支持草鱼出血病病毒的生长与复制中的应用。3.权利要求1所述赤眼鳟鳍条细胞系SCF的建立方法，其特征在于，该方法步骤如下: (I)制备细胞培养液:以Leibovitz’sl-15培养基为基础培养基，于其中加入表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及胎牛血清配置成细胞培养液;该培养液中，胎牛血清占该细胞培养液总体积的25%，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml； (2 )原代培养:取健康的赤眼鳟，于20mg/ml的高锰酸钾液中浸泡30mi η，然后用7 5%质量浓度的酒精喷洒鱼体后擦干，在超净工作台内，剪取鱼体的尾鳍组织，转移至含有0.25%胰蛋白酶的培养皿中培养15min，用灭菌剪刀将尾鳍组织块剪成大小为1.5_3的小块，剪成的组织小块先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml的两性霉素B的磷酸缓冲液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的链霉素及12.5ug/ml两性霉素B的Leibovitz’sl-15培养液洗I次;将漂洗过的组织小块均匀接种在没有加任何培养液的25cm2细胞培养瓶中，于25°C培养箱倒置干贴5h;再于该细胞培养瓶中加入原代培养所需的前述制备的细胞培养液lml，前20d每天更换该细胞培养液； (3)传代培养:待原代细胞单层铺满细胞培养瓶时，取出组织小块，将组织小块用磷酸缓冲液清洗一次，再用Iml0.25%胰蛋白酶对细胞静止消化，待细胞开始收缩变圆成单个细胞时，加入2ml新鲜的细胞培养液中和终止消化，吸出加入的胰蛋白酶溶液和细胞培养液，再加入5ml新鲜的细胞培养液，吹打制成细胞悬液，于25 °C恒温培养箱中培养，待细胞再次形成单层时，进行下一次传代。
【文档编号】C12N5/071GK105925523SQ201610277718
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】肖调义, 邓亚林, 乔庆, 李伟, 赵鑫, 周智愚, 何美凤, 金生振
【申请人】湖南农业大学