产生表达高水平感兴趣蛋白质的稳定细胞系的方法

专利名称：：产生表达高水平感兴趣蛋白质的稳定细胞系的方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质的工业生产。更具体地说，本发明涉及一种即使无选择压力的情况下培养，也能够获得稳定地表达感兴趣蛋白质的细胞的方法。使用DHFR作为替代标记。转染细胞的选择不是基于对有毒化合物的抗性，而是基于使用荧光MTX的FACS所测定的荧光。
背景技术：
：将异源基因引入动物宿主细胞并且筛选被引入基因的表达是一个冗长复杂的过程。通常需要克服很多障碍(i)构建大的表达载体；(ii)转染和选择具有长期表达的克隆；以及(iii)筛选有高表达率的感兴趣的异源蛋白质。1.选择表达异源基因的克隆1.1.转化体的筛诜采用对选择压力有抗性的选择标记选择整合了感兴趣基因的克隆。大多数选择标记对抗生素如新霉素、卡那霉素、潮霉素、艮大霉素、氯霉素、嘌呤霉素、zeocin或博来霉素有抗性。当要从表达载体产生表达感兴趣基因的细胞克隆时，通常用质粒DNA载体来转染宿主细胞，其中该质粒DNA载体在该同一个载体编码感兴趣蛋白质和选择标记。很多时候质粒的容量是有限的，不得不用第二个质粒表达选择标记，该第二个质粒与包括感兴趣基因的质粒一起共转染。通过典型方法进行的稳定转染导致表达载体在宿主细胞的基因组中随机整合。使用选择压力，例如向培养基施加抗生素，将会除去所有这样的细胞它们不能与含有对各自的抗生素或选择压力有抗性的选择标记的载体整合。如果选择标记与感兴趣基因在同一个载体上，或者如果选择基因在第二个载体上，与包含感兴趣基因的载体共整合，则细胞将同时表达选择标记和感兴趣基因。1.2.高水平牛产细胞的筛诜—旦获得了转化体，就重克隆细胞并选择高水平生产细胞(highproducer)。选择高水平生产细胞的一个可行方法是利用例如ELISA直接量化感兴趣蛋白质的表达。不过，通常首先筛选高水平表达能够容易地被测定的替代标记的高水平生产细胞。当使用替代标记时，感兴趣蛋白质和该替代标记通常处于同一个载体上，两种蛋白质的表达水平是有关联的。—种容易和方便的方法是使用荧光激活细胞分类术(FACS)重克隆细胞和量化荧光替代标记例如水母或海参绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平。因此，使用FACS筛选结合选择压力的选择方法来选择高水平生产细胞在本领域中得到广泛应用(例如参见Gubin等，1999;Yoshikawa等，2001;DeMaria等，2007)。例如，Yoshikawa等(2001)公开了一种改进方法，通过FACS选择由高水平生产基因扩增的CHO细胞。以对MTX的抗性选择细胞并扩增，然后通过使用f-MTX/DHFR系统的FACS筛选高水平生产细胞。—般在选择了转化体之后移去选择压力，其中在所述转化体中编码感兴趣蛋白质的核酸和选择标记被整合到基因组中。然后在无任何选择压力下通过FACS选择高水平生产细胞(例如参见Gubin等，1997)。无论如何，首先在选择压力下选择转化体。事实上，已经证实了在无选择压力下试图选择转染细胞是失败的(例如参见Migliaccio等2000)。Otto等(2005)公开了一种在不使用选择压力的情况下重克隆细胞的方法。然而，该方法的目的是重克隆先前已经转染的细胞。另外，通过FACS选择细胞是基于ZS绿色蛋白的表达水平。因为编码该蛋白的基因是从花群海葵真菌克隆而来的，这可能导致生产过程中存在中毒和安全问题。2.与选择压力有关的局限虽然选择压力被广泛地用于筛选高水平生产细胞，但使用选择压力仍然存在很多问题。当移去选择压力后，表达通常变得很不稳定，或者丧失表达。因此，只有小量的原始转化体能提供高水平和稳定的长期表达，而且需要耗费很多时间在大量的候选群体中鉴定这些克隆。典型地，分离出高水平表达候选者然后在无选择压力下培养。在这样的情况下，因为大部分原始选择的候选者在移去选择压力后丧失了感兴趣基因的表达而要排除。所以，有利的是在稳定转染的选择初始期之后在无选择压力下培养候选者，然后再筛选感兴趣基因的表达。另外，加入药物的选择压力与随机整合或扩增的多个基因复制数目事件相关。多个复制数目事件与基因表达不稳定有关，这可能由于在培养基无选择压力下复制数目随着时间慢慢丧失。其结果是低滴度生物生产发酵。因此，找到一种新颖又有效的方法来分离在其中感兴趣的异源蛋白质稳定地表达的高水平生产细胞，在工业生产治疗性蛋白质的领域中变得极为有用。
发明内容本发明源自发现了一种建立能够稳定地表达高水平感兴趣蛋白质的细胞系的方法。该方法基于使用DHFR为替代标记，特征在于不需要基于药物抗性选择细胞。实施例l公开了本发明的这样一种方法。所述方法包括基于DHFR的表达选择细胞，其中DHFR的表达通过荧光标记和FACS分析来确定，不需要首先使用有毒化合物选择转染细胞。如实施例2和3所示，所述方法选择的细胞系稳定地表达高水平的感兴趣蛋白质。所以，本发明第一方面涉及一种筛选表达感兴趣蛋白质(POI)的细胞的方法，包括以下步骤a)使用以下物质转染细胞(i)编码所述感兴趣蛋白质的核酸；禾口(ii)编码DHFR的核酸；b)使用与DHFR结合的荧光化合物测定DHFR的表达；以及c)基于相对的高DHFR表达选择大约0.001%至大约25X在步骤b)中测试的细胞；其中所述细胞的选择不是基于对步骤a)和b)之间有毒化合物的抗性。本发明第二方面涉及一种筛选表达感兴趣蛋白质的细胞的方法，包括以下步骤a)使用编码所述感兴趣蛋白质的核酸转染细胞b)使用与所述感兴趣蛋白质结合的荧光抗体测定所述感兴趣蛋白质的表达；以及c)基于相对的高所述感兴趣蛋白质的表达选择大约0.001%至大约25%在步骤b)中测试的细胞；其中所述细胞的选择不是基于对步骤a)和b)之间有毒化合物的抗性。本发明第三方面涉及一种获得表达感兴趣蛋白质的细胞系的方法，所述方法包括以下步骤a)根据本发明上述任一方法筛选细胞；以及b)由至少一个所述细胞建立细胞系。本发明第四方面涉及一种生产感兴趣蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)在允许表达所述感兴趣蛋白质的条件下培养根据上述方法获得的细胞系；以及b)收集所述感兴趣蛋白质。本发明第五方面涉及使用DHFR筛选表达感兴趣蛋白质的细胞，或者获得表达感兴趣蛋白质的细胞系，特征在于所述细胞或细胞系的选择不是基于对MTX的抗性，也不是基于不存在次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)的代谢优势。图1比较了由本发明的方法获得的细胞系与由常规药物选择方法获得的细胞系的生产力。平均荧光强度(MFI)是与DHFR形成复合物的荧光MTX的结果。这些稳定细胞的获得和分析在实施例1和2中加以描述。PRE-Ro皿d1指的是进行第一次FACS分类之前的细胞。PRE-Round2指的是进行第二次FACS分类之前的细胞。POST-Round2指的是进行第二次FACS分类之后的细胞。图2所示为使用本发明的方法选择的细胞的稳定性研究。被研究的感兴趣蛋白质是人绒毛膜促性腺激素(hCG)的变体。特异性生产力以每日每个细胞皮克(pcd)记录。群体倍增水平(PDL)指累积的有丝分裂事件。群体倍增时间是生长的量度。具体实施例方式本发明源自发现了一种建立细胞系的方法。令人惊奇的是，所述方法不使用药物抗性来选择稳定的细胞(实施例1)。所述方法分离的细胞表达感兴趣蛋白质的水平与基于药物抗性的常规方法接近(实施例2)。因为FACS方法生产的重组的稳定细胞所使用的生长培养基没有药物，所以感兴趣基因的多个复制数目整合或表达都没有压力。因此，药物压力不存在引致的不稳定性不再是个问题。已经观察到群体倍增数大于50时特异性生产力是完全稳定的(实施例3)。因而本发明提供了一种有效的方法分离稳定地表达感兴趣蛋白质的方法。1.本发明的方法本发明的第一方面涉及一种筛选表达感兴趣蛋白质(POI)的细胞的方法，包括以6下步骤a)使用以下物质转染细胞(i)编码所述感兴趣蛋白质的核酸；禾口(ii)编码DHFR的核酸；b)使用与DHFR结合的荧光化合物测定DHFR的表达；以及c)基于相对的高DHFR表达选择大约0.001%至大约25%在步骤b)中测试的细胞；其中所述细胞的选择不是基于对步骤a)和b)之间有毒化合物的抗性。术语"DHFR"指属于二氢叶酸还原酶家族成员(EC1.5.1.3)并且能够催化以下酶反应的多肽，5，6，7，8-四氢叶酸+NADP+=7，8_二氢叶酸+NADPH所述编码DHFR的核酸可以为任何来源。例如，它可以来自细菌，如大肠杆菌(Miller等，2005)。DHFR较佳地来自真核细胞。更佳地它来自哺乳动物。它最好来自小鼠(Subramani等，1981)。在一个实施例中，克隆DHFR基因的种属与转染细胞相同。DHFR可以对应于野生型DHFR多肽或其突变体，只要所述突变体保留了催化上述反应的能力。具有改进动力学参数的突变DHFR多肽已为本领域所公知。术语"转染细胞"应理解为将重组核酸(例如载体)引入细胞。在一群细胞中，表现"相对的高DHFR表达"的细胞是比其他细胞表现更高水平DHFR表达的那些细胞。例如，细胞No.1表达10mg/LDHFR，细胞No.2表达lmg/lDHFR。在该实施例中，细胞No.1表现相对的高DHFR表达。本文使用的术语"筛选"指在大量的细胞中测试或检查特定的性状。本文使用的术语"选择"指在一组细胞中选择某些特异性细胞。术语"有毒化合物"指任何这样的化合物因为该化合物能杀死未转染细胞或抑制未转染细胞的生长，所以在所述化合物存在下无法培养未转染细胞。这些化合物的例子包括例如MTX、嘌呤霉素、新霉素、卡那霉素、潮霉素、艮大霉素、氯霉素、ze0Cin和博来霉素。在本发明的一较佳实施例中，细胞的选择不是基于对有毒化合物的抗性，也不是基于在步骤(a)和(b)之间的代谢优势。术语"代谢优势"指转染细胞在化合物不存在下生长的能力，其中所述化合物对未转染细胞的生长是强制性的。例如，包含编码谷氨酰胺合成酶(CS)的基因的CHO细胞能够在谷氨酰胺不存在下生长，而包含编码DHFR的基因的CHO细胞能够在胸腺嘧啶脱氧核苷和/或次黄嘌呤(HT)不存在下生长。如果转染细胞不包含(或者包含失效的)谷氨酰胺合成酶或DHFR基因，该转染细胞就获得了一种代谢优势，S卩能够分别在谷氨酰胺或次黄嘌呤不存在下培养细胞而被选择。与DHFR结合的荧光化合物已为本领域所知，包括能够与DHFR共价结合的化合物，例如荧光标记叶酸类似物。这样的荧光标记叶酸类似物包括荧光甲氨蝶呤(f-MTX)和荧光甲氧苄氨嘧啶(f-TMP)(Miller等，2005)。任何测量荧光的常规手段都可用来测量DHFR的表达，例如荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪(FACS)等等。最理想的是采用FACS测量DHFR的表达。要在本发明方法的步骤(b)测量DHFR的表达，在结合DHFR的荧光化合物存在下培养细胞。虽然结合DHFR的这种荧光化合物可能对细胞有毒，但细胞培养的时间很短，不会杀死任何细胞。事实上，DHFR缺陷细胞需要在MTX或者f-MTX存在下培养24小时以上，以使药物选择发生。所以，该培养步骤不是基于对结合DHFR的荧光化合物的抗性选择细胞的步骤。在本发明的较佳实施例中，细胞在结合DHFR的荧光化合物存在下培养小于24、22、20、18、16、14、12、10、8、6、4或2小时。更好的是，细胞在结合DHFR的荧光化合物存在下培养大约20小时或大约4小时。任何细胞都适合进行本发明的方法。细胞可以是初级细胞或者来自各种各样真核生物的确立细胞株，包括植物和动物细胞。较佳地，所述细胞是真核细胞。更好地是，所述细胞是哺乳动物细胞。更好地，所述细胞是CHO细胞、人细胞、小鼠细胞或杂交瘤细胞。最好地，所述细胞是CHO-DUKX细胞(UrlaubandChasin，1980)。在第一实施例中，细胞是DHFR缺陷的(例如CHO-D區X或CH0-DG44)。在该实施例框架下，任何原始DHFR+细胞都可以被加工变成DHFR缺陷的。在第二实施例中，细胞是DHFR+(即它的基因组包括功能性内源DHFR基因)。事实上，即使当细胞是DHFR+，也可以在该细胞中测量DHFR基因的补加复制的稳定整合(参见例如Connors等1988)。在一较佳实施例中，编码感兴趣蛋白质的核酸和编码DHFR的核酸处于要被转染到步骤(a)中所述细胞的同一个载体上。或者，所述编码感兴趣蛋白质的核酸和编码DHFR的核酸可以处于不同的载体上，它们一起共转染至步骤(a)中所述细胞。当编码感兴趣蛋白质的核酸和编码DHFR的核酸处于同一个载体上，所述载体可以包括至少两个启动子，其中一个驱动所述编码感兴趣蛋白质的核酸的表达，另一个驱动所述编码DHFR的核酸的表达。或者，所述编码感兴趣蛋白质的核酸和所述编码DHFR的核酸可以由同一个启动子驱动，而所述载体包括位于所述核酸之间的内部核糖体插入位点(IRES)或者2A序列(deFelipe等，2006)。本文所用的术语"启动子"指这样的DNA区其功能是控制一或多个DNA序列的转录，对其结构鉴定为存在依赖DNA的RNA聚合酶的结合位或存在相互作用来调节启动子功能的其他DNA序列。启动子的功能性表达启动片段是保留了作为启动子活性的短的或截短的启动子序列。可以利用本领域已知的任何检测法测定启动子的活性，例如采用DHFR作为报道基因的报道基因检测法(SeligerandMcElroy，1960;Wood等，1984;deWet等，1985)，或者购自Promega③的检测法。〃增强子区〃指其功能是增加一或多个基因转录的DNA区。更具体地，本文所用的术语"增强子"是指不论它相对于要表达的基因的位置和方向，都能够增强、增大、改善或改进基因表达的DNA调节元件，并且可以增强、增大、改善或改进一个以上启动子的表达。在一较佳实施例中，本发明的载体包括至少一个小鼠CMV立即早期区的启动子。该启动子可以是例如mCMVIE1基因启动子("IE1启动子")，例如可从W087/03905中获知。该启动子也可以是mCMVIE2基因启动子("IE2启动子")，mCMVIE2基因本身可从例如Messerle等(1991)中获知。IE2启动子和IE2增强子区在W02004/081167中都有详细记载。较佳地，本发明的载体包括至少两个小鼠CMV立即早期区的启动子。更好地，所述两个启动子是IE1和IE2启动子。在一较佳实施例中，本发明的载体包括至少两个小鼠CMV立即早期区的启动子，其中一个驱动本发明的多肽的表达，另一个驱动感兴趣蛋白质的表达。根据本发明，感兴趣蛋白质可以是希望生产的任何多肽。感兴趣蛋白质可以应用在研究实验室的制药、农业综合企业或家倶领域中。较佳的感兴趣蛋白质用在制药领域中。例如，感兴趣蛋白质可以是例如天然分泌的蛋白质、正常胞质蛋白质、正常跨膜蛋白质、或者是人源或人化抗体。当感兴趣蛋白质是正常胞质蛋白质或正常跨膜蛋白质时，最好对该蛋白质进行加工以使它变得可溶解的。感兴趣多肽可为任何来源。较佳的感兴趣多肽来自人。在较佳实施例中，感兴趣蛋白质选自绒毛膜促性腺激素、卵泡剌激素、促黄体素-绒毛膜促性腺激素、甲状腺剌激素、人生长激素、干扰素(例如，干扰素P-la、干扰素P-lb)、干扰素受体(例如，干扰素y受体)、TNF受体p55和p75、白介素(例如，白介素-2、白介素-11)、白介素结合蛋白(例如，白介素-18结合蛋白)、抗-CDlla抗体、促红细胞生成素、粒细胞集落剌激因子、粒细胞_巨噬细胞集落剌激因子、垂体肽类激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长因子(例如，生长调节素-c)、角质细胞生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、凝血调节蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、凝血因子VIII、促生长素、骨形态生成蛋白_2、血小板衍生的生长因子、水蛭素、促红细胞生成素(印oietin)、重组LFA-3/IgGl融合蛋白、葡糖脑苷脂酶、单克隆抗体、以及其突变蛋白、片段、可溶型式、功能性衍生物、融合蛋白。较佳地，所述单克隆抗体针对以下蛋白质CD3(例如0KT3、NI-0401)、CDlla(例如依法珠单抗(efalizumab))、CD4(例如zanolimumab、TNX—355)、CD20(例如ibritumomabtiuxetan、rituximab、tosit咖omab、ocrelizumab、ofatum咖ab、I匪U□106、TRU_015、AME-133、GA-101)、CD23(例如lumiliximab)、CD22(例如印ratuzumab)、CD25(例如basiliximab，daclizumab)、上皮生长因子受体(EGFR)(例如panitumumab、cetuximab、zalutumumab、MDX-214)、CD30(例如MDX-060)、细胞表面糖蛋白CD52(例如alemtuzumab)、CD80(例如galiximab)、血小板GPIIb/IIIa受体(例如abciximab)、TNF—a(例如infliximab、adalimumab、golimumab)、白介素_6受体(例如tocilizumab)、癌胚抗原(CEA)(例如99mTc-besilesomab)、a-4/P_1整联蛋白(VLA4)(例如nataliz丽b)、a-5/P_1整联蛋白(VLA5)(例如volociximab)、VEGF(例如bevacizumab，ranibizumab)、免疫球蛋白E(IgE)(例如omalizumab)、HER-2/neu(例如trastuzumab)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)(例如111In-卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、MDX-070)、CD33(例如吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuz咖abozogamicin))、GM-CSF(例如KB0(^、MT203)、GM-CSF受体(例如CAM-3001)、EpCAM(例如adecatumumab)、IFN-y(例如NI-0501)、IFN-a(例如MEDI-545/MDX-1103)、RANKL(例如denosumab)、肝细胞生长因子(例如AMG102)、IL-15(例如AMG714)、TRAIL(例如AMG655)、胰岛素样生长因子受体(例如AMG479，R1507)、IL-4andIL13(例如AMG317)、BAFF/BLyS受体3(BR3)(例如CB1)、CTLA-4(例如ipilimumab)。根据本发明可以筛选任何数目的细胞。例如，可以筛选至少10、100、1'000、10'OOOUOO'000、1'000'000、5'000'000、10'000'000、20'000'000、30'000'000、40'000'000、50'000'000、60'000'000、70'000'000、80'000'000、90'000'000、100'000'000个细胞的荧光。可以使步骤(c)完成后选择的群体重复进行步骤(b)(即通过荧光测量DHFR的表达)和步骤(c)(即选择荧光最强的细胞)。例如，可以重复至少2、3、4、5或10次。这可在改变或维持选择步骤之间的条件下进行。改变条件包括例如改变培养条件，例如培养基成分或理化参数。在一较佳实施例中，最后一次重复步骤(c)之后选择的细胞在无任何药物选择的情况下表现出稳定的感兴趣蛋白质的表达，群体倍增水平(PDL)至少为10、20、30、45或50。在一较佳实施例中，最后一次重复步骤(c)之后选择的细胞在PDL为15之后损失的特异性生产力(pcd)不会超过20%、15%、10%、5%或1%。较佳地，所述细胞在PDL为50之后损失的特异性生产力(pcd)不会超过20%、15%、10%、5%或1%。更好地，所述细胞在PDL为50之后损失的特异性生产力(pcd)不会超过10%。最好地，所述细胞在PDL为50之后没有损失任何特异性生产力(pcd)。在本发明一具体实施例中，使步骤(c)结束之后选择的细胞进行进一步筛选，所述筛选包括以下步骤(i)用编码所述感兴趣蛋白质的核酸转染细胞；(ii)使用结合所述感兴趣蛋白质的荧光抗体测量感兴趣蛋白质的表达；以及(iii)根据相对的高感兴趣蛋白质的表达选择大约0.001%至大约25%步骤(b)中测试的细胞。在基于荧光进行最后一次选择(即最后一次重复步骤(c))之后，可以进一步测量所述选择的细胞中感兴趣蛋白质的表达水平(步骤d)。感兴趣蛋白质的表达水平可以采用本领域已知的任何方法来测量，例如ELISA、FACS、RNA印迹或RT-PCR。然后，可以根据相对的高感兴趣蛋白质的表达选择大约0.001%至大约25%步骤(d)中测试的细胞(步骤e)。例如，可以选择大约O.001%、0.005%、0.01%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%至大约15%、18%、20%或25%表现出相对的高感兴趣蛋白质的表达的细胞。本发明另一方面涉及一种获得表达感兴趣蛋白质的细胞系的方法，所述方法包括以下步骤a)根据上述方法筛选细胞；以及b)由所述细胞建立细胞系。本文使用的术语"细胞系"指一种具体细胞类型，它们能够在实验室内生长。细胞系通常能够在永久确立的细胞培养基中生长，并且只要有适当的新鲜培养基和空间就会无限地增生。从分离的细胞建立细胞系的方法已为本领域技术人员所公知。在一较佳实施例中，所述细胞系是稳定的细胞系，即在无任何药物选择的情况下群体倍增水平(PDL)至少为10、20、30、45或50时，其损失的特异性生产力(pcd)不会超过20%、15%、10%、5%或1%的细胞系。较佳地，所述细胞系在PDL为50之后损失的特异性生产力(pcd)不会超过10%。最好地，所述细胞系在PDL为50之后没有损失任何特异性生产力(pcd)。本发明另一方面涉及一种生产感兴趣蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)在允许表达所述感兴趣蛋白质的条件下培养根据上述方法获得的细胞；以及b)收集所述感兴趣蛋白质。本领域技术人员使用标准方法可轻易地确定允许表达感兴趣蛋白质的条件。例如，可以使用实施例3.3.1公开的条件。10在一较佳实施例中，上述生产感兴趣蛋白质的方法还包括纯化所述感兴趣蛋白质的步骤。本领域技术人员可以任何公知的技术来进行纯化。若感兴趣蛋白质用在制药领域中，所述感兴趣蛋白质最好被配制成药物组合物。本发明的又一方面涉及使用DHFR筛选表达感兴趣蛋白质的细胞，其特征在于，所述细胞的选择不是基于对MTX的抗性，也不是基于次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷不存在下的代谢优势。本发明的再一方面涉及使用DHFR获得表达感兴趣蛋白质的细胞系，其特征在于，所述细胞系的选择不是基于对MTX的抗性，也不是基于胸腺嘧啶脱氧核苷不存在下的代谢优势。较佳地，所述细胞系稳定地表达感兴趣蛋白质。另外，使用结合感兴趣蛋白质的荧光抗体代替使用结合DHFR的荧光化合物，也可以测量转染细胞的荧光。典型地，这种筛选表达感兴趣蛋白质的细胞的方法包括以下步骤a)使用编码所述感兴趣蛋白质的核酸转染细胞b)使用与所述感兴趣蛋白质结合的抗体测定所述感兴趣蛋白质的表达；以及c)基于相对的高所述感兴趣蛋白质的表达选择大约0.001%至大约25%在步骤b)中测试的细胞；其中所述细胞的选择不是基于对步骤a)和b)之间有毒化合物的抗性。所有其他步骤与上述方法中使用DHFR的步骤相同。2.本发明相对于现有技术的优点本发明提供了一种基于FACS获得稳定细胞的选择方法，完全不需要选择对药物的抗性。在所述方法中，用FACS筛选高水平生产细胞的过程合并到选择稳定细胞的过程中。因此，所述筛选方法具有减少方法步骤的优点。所述方法还可以在无选择压力的情况下选择稳定的细胞系。事实上已经发现，在无药物选择压力下当群体倍增数大于50时，选择细胞中感兴趣蛋白质的表达是稳定的。这对于工业上生产蛋白质是极为有利的。另外，不必使用药物细胞都能够维持基因表达的稳定，在生产过程中也不需要药物。最后，DHFR是天然存在的蛋白质，它天然存在于真核细胞如CHO细胞中。换言之，使用本发明的方法获得的细胞系仅仅表达两种重组蛋白质重组的感兴趣蛋白质和重组的DHFR蛋白质，其中DHFR蛋白质的基因在任何情况下都天然存在于所述细胞中。这是与包括细菌和/或蓝细菌标记(如GFP或ZS-Green)的细胞系的一个明显差别。具体地，生产感兴趣蛋白质的细胞系中DHFR的表达不会如使用例如GFP或ZS-Green作为替代标记的情形那样会有毒性问题。所以，使用本发明的方法获得的细胞系在生产过程中是安全的。以上对本发明进行了完整的叙述，本领域技术人员在不脱离本发明的思路和范围内，可以在宽范围的等效参数、浓度和条件内进行相同的工作，而无需作多余的实验。虽然结合具体实施例对本发明进行了叙述，但应明白，它能够作其它改进。总之，本申请包括遵循本发明的原理而对本发明作出的任何改变、应用或适应性变化，包括那些本发明没有公开的内容，其通过与本发明相关的本领域所公知或常规技术推导出的并可应用于上文所述的在所附权利要求书范围内的基本专题。本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均纳入本文参考文献中。包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。总之，参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关
技术领域：
中公开得到、启发或者暗示。上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术的常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解释。实施例实施例1:方案1.1.细胞、培养某和质粒研究由CH0-DUKX-B11得到的中国仓鼠卵巢细胞系中感兴趣蛋白质的稳定表达。在转染前，使宿主细胞适合于在化学合成培养基(下称"生长培养基")中无血清高密度悬液生长，所述合成培养基来自PR0CH0-5培养基(Bio-Whittaker/Cambrex，EastRutherford,N.J.)，补充了2%次黄嘌呤钠和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)。除非另有指出，所有试剂都由InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA.提供。将转染细胞在含有上述生长培养基的一次性振荡培养瓶中培养，所述振荡培养瓶置于37t:、5XC(^培养箱中，125rpm振荡。转染包括施加编码失活的异二聚体激素人绒毛膜促性腺激素(hCG)的a和13亚基的线性质粒DNA组合。表达载体(下称D-a)含有N-末端与人生长激素信号序列融合的感兴趣基因，由金属硫蛋白1启动子(MTT-1)启动。它还含有由sv-40早期启动子启动的野生型小鼠DHFR基因和对氨苄青霉素有抗性的基因。D-a载体在Keltonet.al.(1992)中有详细描述。1.2.转染将90iiL脂质体转染试剂(DMRIE-C)和DNA(共15yg，亚基的容积比率为1:1)分别与1.5mL生长培养基混合，得到的混合物在室温培育10分钟，然后合并，再在室温培育30分钟，生成DNA-质粒复合物。800rpm离心5分钟，收获转染用的2千万个宿主细胞，将细胞沉淀物重悬于25mLT烧瓶中的3mL生长培养基中。向细胞加入质粒/DNA混合物，在37°C、5%0)2下静置培养。4小时后，加入生长培养基，配至40mL，将细胞转移至250mL振荡培养瓶中。在37°〇、5%0)2环境中125rpm振荡，保持细胞培养基。1.3.第一次FACS分类转染后48小时，计算细胞数目，收集2千万个细胞，如上所述那样离心。细胞沉淀物重悬于加入了4mML-谷酰胺和5iiM荧光素MTX(f-MTX)的20mLPR0CH0_5+中，培养是在37°C、5%C02黑暗环境中125rpm振荡，过夜。第二天，离心沉淀标记的细胞，用5mL冻磷酸盐缓冲液(PBS)+0.5%PluronicAcid+25ii.MH印es缓冲液洗涤，洗二次。然后将细胞重悬于2mL洗涤缓冲液中，并一直置于冰上，直至使用FACSAria流式细胞分选仪(BDBiosciences,SanJose，CA)评价荧光，所述流式细胞分选仪设置成使用氩激光器在488nM线激发异硫氰酸荧光素(FITC)。鞘压力(sheathpressure)设置为低的25psi，孔径为100ym。FACS闸门过程由基于表示细胞物理参数的光散射事件的第一闸门(选择群体1，称之P1)、正向和侧向散射(FSC-H/SSC-H圆点曲线)组成。按照制造商手册(BDFACSAria操作手册，版本336951RevA.，Aug2003)设定参数。再将P1门控(gate)至FSC-W/FITC-A圆点曲线的象限中。象限l(Ql)含有阳性荧光细胞(表示由于插入载体导致DHFR表达)，FSC-W低(表示单细胞的评价)。将宿主细胞载入FACSAria流式细胞分选仪，优化压力设定散射事件100，000，平均荧光强度<200。用Accudrop技术(BDFACSAria操作手册)测定液滴延迟(dropdelay)。宿主细胞经过单细胞闸门(Pl)，然后群体在象限闸门(Ql-Q4)中显示。设定x轴象限闸门的最小阈值为荧光基线。Q1对应所希望的分类闸门，在Q1中没有发现有背景事件。为了选择表达感兴趣基因的细胞，将转染细胞汇合，再载入FACSAria流式细胞分选仪，并如上所述那样门控。所希望的群体Q1的分析经采用因子19.l(与Pl相比较)与装置(FITC)的分离是一致的，该群体占总体3.1%。Ql闸门的单细胞经分类后汇合至一个收集试管中，所述试管含有2mL生长培养基，补充了1%透析胎牛血清和2X青霉素链霉素，以防止细胞感染("分类后培养基")。离心沉淀细胞，并重悬于5mL分类后培养基中，静置于T25瓶中直至汇合。然后，培养基经受胰蛋白酶作用，放大后置于振荡培养瓶中，如上所述那样培养。分类群体"Ql"在分类后培养基中培养大约14天。进行第二轮分类之前，先分析表达。要进行特征鉴定所选择的细胞集合的表达，在10ml选择培养基中接种1百万个细胞/mL，产生条件培养基，并在37t:—次性振荡培养瓶中培养24小时。800rpm离心5分钟，清除条件培养基，4t:储存上清液，作分析表征。使用DSLhCGELISA并参照制造商的规定禾口试剂盒标准(DiagnosticSystemsLaboratories,Webster,TX)量化蛋白质的表达。以下列方程式计算特异性生产力Qsp(p/c/d)=(P厂P》XIn(Nt/N0)/(T厂T》(N「N0)P。初始滴度(皮克)&:最后滴度(皮克)Nt:最后群体大小(细胞数)N。初始群体大小(细胞数)T。初始时间(天)T2:收获时间(天)在第二次分类之前细胞的平均特异性生产力是0.2pcd。1.4.第二次FACS分类要分离最高表达的细胞，将第一次分类(Ql)产生的细胞群体放大，用f-MTX标记4小时，并如上所述那样经历另一轮评价和分类。所希望的群体Q1的分析经采用因子19.l(与Pl相比较)与装置(FITC)的分离是一致的，该群体占总体3.1%。分类后的群体Q1-Q1的分析经采用因子8.4(与P1相比较)与装置(FITC)的分离是一致的，该群体占总13体1.3%。细胞分类后，置于含有5mL无HT的分类后培养基的T25瓶中静置，然后放大再放入振荡培养瓶中，并如上所述那样培养。在最后分类之后，对细胞集合(cellpool)进行表达分析，得到的平均特异性细胞生产力为3.2pcd。^MMl:FACS选择的细胞与药物选择的细胞的平均荧光强度(MFI)比较作为对照，按以下方法建立药物选择的细胞系在转染后48小时，将细胞转移到选择培养基(在PR0CH0-5培养基中的0.5iiM甲氨蝶呤，补充了4mML-谷酰胺)。每二至三天，离心细胞使其传代，并重悬于新鲜的选择培养基中，得到的最后密度是5X105个细胞/mL。大约三星期之后，细胞显示出恢复生长的迹象。当生长率是恒定的并且存活率大于90%时，可以认为CHO细胞集合是稳定的。标记细胞，并按照上文所述那样通过FACS评价不同加工点(对于FACS选择的细胞系第一次分类前、第二次分类前和第二次分类后；对于药物选择的细胞系在选择过程之后)的荧光。FITC-A直方图显示单细胞闸门(Pl)。观察到MFI有明显的移动，这是因为转染细胞经过了多轮FACS选择(la-lc)。FACS选择(lc)产生的并在无药物选择压力的培养基中生长的稳定CH0细胞显示了与在O.5uMMTX存在下生长的药物选择细胞系(ld)相似的曲线轮廓。图1的结果表明，本发明的方法获得了高水平生产重组细胞系。实施例3:稳定件评价在分类后培养基(无药物选择)中培养细胞至群体倍增长度为50，以便研究FACS选择的稳定细胞系的基因表达的稳定性。每周均进行表达分析，测定特异性细胞生产力。结果示于图2中。最后分类的细胞在群体倍增长度(PDL)达到50之后，细胞稳定地表达hCG蛋白质，其平均特异性生产力没有任何损失。细胞保持稳定一致的生长率，平均倍增时间是27小时。结论，本发明的方法可以选择稳定的高水平生产重组细胞系，可以用在蛋白质的研究或生产上。参考文献Co画rs，R.W.，Sweet，R.W.，Noveral，J.P.，Pfarr，D.S.，Trill，J.J.，Shebuski，R.J.，Berkowitz，B.A.，Williams,D.，Franklin,S.，Reff，M.E.(1988)DHFRcoamplificationoft_PAinDHFR+bovineendothelialcells:Invitrocharacterizationofthepurifiedserin印rotease.DNA7，651—661deFelipe,P.，Luke，G.A.，Hughes,LE.，Gani，D.，Halpin，C.，andRyan，M.D.(2006).Eunumpluribus:multipleproteinsfromaself-processingpolyProtein.TrendsBiotechnol.24，68_75.deWet，J.R.，Wood,K.V.，Helinski，D.R.，andDeLuca，M.(1985).CloningoffireflyluciferasecDNAandtheexpressionofactiveluciferaseinEscherichiacoli.ProcNatlAcadSciUSA82.7870-7873.DeMaria，C.T.，Cairns，V.，Schwarz，C.，Zhang，J.，Guerin，M.，Zuena，E.，Estes，S.，andKarey，K.P.(2007).AcceleratedcloneselectionforrecombinantCH0CELLSusingaFACS-basedhigh—throughputscreen.Biotechnol.Prog.23，465_472.Gubin，A.N.，Kod訓，S.，Njoroge，J.M.，Bhatnagar，R.，andMiller,J丄(1999).StableexpressionofgreenfluorescentproteinafterliposomaltransfectionofK562cellswithoutselectivegrowthconditiohs.Biotechniques27，1162—1170.Gubin，A.N.，Reddy，B.，Njoroge，J.M.，andMiller,J丄(1997)丄ong-term，stableexpressionofgreenfluorescentproteininmammaliancells.Biochem.Biophys.Res.Commun.236，347—350.Kelton，C.A.，Cheng，S.V.Y.，Nugent,N.P.，Schweickhardt，R.L，Rosenthal,J.L.，0verton，S.A.，Wands，G.D.，Kuzeja，J.B.，Luchette，C.A.，andChappel，S.C.(1992)ThecloningofthehumanfolliclestimulatinghormonereceptoranditsexpressioninC0S_7，CH0，andY—lcells.MolecularandCellularEndocrinology,89，141-151.Messerle，M.，Kei1，G.M.，andKoszinowski，U.H.(1991).Structureandexpressionofmurinecytomegalovirusimmediate—earlygene2.J.Virol.65，1638-1643.Migliaccio,A.，R.，Bengra，C.，Ling，J.，Pi，W.，Li，C.，Zeng，S.，Keskint印e，M.，Whitney,B.，Sanchez,M.，Migliaccio,G.，andTu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