专利名称：一种Aurora B稳定表达细胞系及其在抗癌小分子药物筛选中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Aurora B稳定表达细胞系及其在抗癌小分子药物筛选中的应用。
背景技术：
癌症已经成为严重威胁人类生命和健康的一大杀手，据统计，全球每年有1000 万人患上癌症，其中，有600万人死于癌症。在目前的癌症治疗方法中，针对癌细 胞中过量表达的基因设计小分子药物是重要的可行性方法之一。AuroraB是关键的 细胞周期调控激酶，在许多人类肿瘤细胞系中均过量表达，并且伴随着染色体不稳 定的状况，因此Aurora B是设计治疗癌症的小分子药物的重要靶点之一。
人类Aurora B基因(全称为Aurora kinase B)是在筛选癌细胞中过量表达的激 酶时发现的。它的编码基因位于基因组第17号染色体17pl3上，其cDNA序列全 长1032bp，蛋白分子量为39kD。 AuroraB蛋白的C端是个保守的催化结构域，N 端则差异相对较大，但仍含有A-box I、A-box II和A-box III三段保守序列(Fu J, Bian M， Jiang Q, Zhang C (2007) Mol Cancer Res 5:1—10.) 。 Aurora B是染色体乘客蛋白 (chromosome passenger protein)的核心组分，它在有丝分裂前期时与染色体结合； 中期时集中在中心粒上；后期开始时，AuroraB从中心粒转移到赤道板上，分裂沟 和收縮环就在这个位置形成(Adams et al., 2001. Curr Biol 2000;10:1075-8.) 。 Aurora B的定位说明其很有可能在有丝分裂前期与染色体活动有关，而在后期和末期与细 胞骨架有关。许多研究发现，AuroraB在有丝分裂染色体凝集、姐妹染色单体分离 和胞质分裂过程中起重要作用。AuroraB作为一个激酶，其磷酸化的底物主要有 H3、 CENP-A、 INCENP和Survivin等。Aurora B蛋白的编码基因在NCBI中的Gene ID是9212。
发明内容
本发明的目的是提供一种AuroraB稳定表达细胞系的制备方法。
本发明所提供的AuroraB稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤
1)将AuroraB的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载
体；
2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达AuroraB 的细胞系。
上述真核表达载体具体可为pEGFP-C2、 pCMV-Tag、 pCMV-Myc等。 为了便于对表达的AuroraB进行细胞定位，可在真核表达载体上加入可在宿主 中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GFP、 RFP。 上述宿主细胞可为HeLa细胞、293细胞、3T3细胞等。 利用上述方法制备的AuromB稳定表达细胞系也属于本发明的保护范围。 将一株GFP-AuroraB稳定表达的HeLa细胞株于2008年9月2日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京巿朝阳区大 屯路3号)，保藏号为CGMCCNo.2652。
本发明的AuroraB稳定表达细胞系具有以下优点(1)可以直接在荧光显微 镜下观察活体重组细胞中AuroraB的动态变化(f"wVo)，这与传统的免疫荧光方 法和用Western blot方法观察Aurora B的定位相比，更加快速，而且可以真实的反 应AuroraB在细胞内的状况；(2)本发明的AuroraB稳定表达细胞系上带有GFP 标签，并且Aurora B稳定、过量表达，因此可以方便的通过IP、 Pull down等实验 研究与AuroraB激酶相互作用的蛋白，这对于解析细胞周期进程中许多过程有重要 意义，也为肿瘤的治疗提供了很好的理论依据；(3)本发明的AuroraB稳定表达 细胞系可以加速抗癌小分子药物的筛选进程。GFP-AuromB在荧光显微镜下可作为 一个直观的动态指标反映出小分子药物对重组细胞的处理效果。
本发明的另一个目的是提供一种筛选抗癌小分子药物的细胞模型。 本发明所提供的筛选抗癌小分子药物的细胞模型是上述Aurora B稳定表达细 胞系。
本发明的Aurora B稳定表达细胞系可以方便地对细胞周期信号通路等基础理 论进行相关的研究，还可以用于抗癌小分子药物的筛选。AuroraB基因本身作为一 个潜在的致癌基因，在大部分肿瘤细胞系中均过量表达。在ZM447439的处理下， AuroraB在细胞内的定位会发生显著变化。因此，利用细胞系中的绿色荧光蛋白作 为标签，在荧光显微镜下可直观地显示出小分子药物处理对细胞的影响，同时可以 动态地观察AuroraB在药物处理下的定位变化，这将在很大程度上加速抗癌小分子 药物筛选的进程。
实验证明，本发明的AuroraB稳定表达细胞系对激酶抑制剂ZM447439敏感， 作用显著。本发明的AuroraB稳定表达细胞系为深入探索AuroraB在癌症发生中
的作用提供实验技术平台，可用于筛选抗癌的小分子药物。
图1为本发明的AuroraB稳定表达细胞系的构建总流程图
图2为重组表达载体pEGFP-C2-Aurora B和Aurora B稳定表达细胞系的具体构 建流程图
图3为Aurora B稳定表达细胞系的生长曲线
图4为Aurora B稳定表达细胞系的DIC照片和绿色荧光照片
图5为Aurora B稳定表达细胞系的Western blot检测结果
图6为AuroraB稳定表达细胞系在不同细胞周期中AuroraB在细胞内定位的 荧光照片
图7为Aurora B稳定表达细胞系对Aurora B激酶特异的抑制剂ZM447439的 敏感性检测的荧光照片
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的AuroraB稳定表达细胞系的具体构建流程如图1所示，重组表达载体 pEGFP-C2-Aurora B和Aurora B稳定表达细胞系的具体构建流程如图2所示。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度皆为质量 百分比浓度，所用限制性内切酶均由TaKaRa公司提供，所用引物均由北京赛百盛 生物工程公司合成。
实施例1、重组表达载体pEGFP-C2-AuroraB的构建
根据人类Aurora B激酶编码基因的cDNA全长序列(NCBI中GenelD:9212，序
列表中序列1)设计引物如下正向引物
5'-TCGAC|GAATTC|ATGGCCCAGAAGGAGAACT-3'(方框内碱基为限制性内切酶
五CO及I的识别位点)和反向引物
5'-TGTAC|CTCGAG[rCAGGCGACAGATTGAAGG-3'(方框内为限制性内切酶WoI
的识别位点)。
取离体人的HeLa细胞并提取其总RNA，将其反转录成cDNA，以该cDNA为 模板，在上述引物的引导下，使用高保真Pyrobest酶(TaKaRa公司)利用RT-PCR 方法扩增出Aurora B基因。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，用
限制性内切酶￡co/ I和屈ol对纯化回收后的产物进行酶切，酶切产物再次进行琼 脂糖凝胶电泳纯化和回收，得到AuroraB蛋白编码框的cDNA序列。同时，将真核 表达载体pEGFP-C2 (购自Clontch公司，Catalog #6083-1)用五co/ I和Sa/I(S"/1是 ^0i的同尾酶)进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收。用DNA连 接酶连接上述扩增得到的AuroraB蛋白编码框的cDNA序列和真核表达载体 pEGFP-C2酶切后的产物，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，并涂布于含 有卡那霉素的LB平板上，挑取单克隆进行PCR检测。对PCR产物进行测序，以 检测阳性克隆中插入序列的正确。测序结果表明，插入的1035bp的AuroraB蛋白 编码框的cDNA序列的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基 酸序列如序列表中序列2所示。提取重组大肠杆菌的质粒，将得到的重组表达载体 命名为pEGFP-C2-Aurora B 。
实施例2、 AuroraB稳定表达细胞系的建立
将上述步骤一得到的重组大肠杆菌利用PEG8000提取质粒，得到高纯度的重组 表达载体pEGFP-C2-Aurora B 。将重组表达载体pEGFP-C2-Aurora B以通用的磷酸 钙沉淀的方法转染HeLa细胞，继续于37°C 5% C02的培养箱中培养转染后的HeLa 细胞24小时以上。转染两天后，将转染的细胞转入6cm培养皿中培养，待细胞贴 壁后在培养基中加入G418，使其最终浓度为800ug/ml。之后每三天换液一次，培 养两至三周后，细胞大量死亡，余下的细胞克隆即为AuroraB的稳定表达细胞系。 同时以转入真核表达载体pEGFP-C2的HeLa细胞作为对照。
AuroraB稳定表达细胞系的DIC照片和荧光显微照片如图4所示。其中，A为 AuroraB稳定表达细胞系的荧光显微照片；B为该细胞系的明视场DIC细胞形态照 片。将AuroraB稳定表达细胞系中的细胞株B4经-2(TC预冷的甲醇固定后，用含有 10mg/ml DAPI的Mowoil封片，然后在Zeiss荧光显微镜下观察，并拍摄荧光照片。 结果如图6所示。从图6中可以看出，AuroraB稳定表达细胞株B4中不同细胞周 期时Aurora B在细胞中的定位。结果表明，Aurora B在细胞间期时定位在细胞核内， 中期时定位在中心粒上；后期时则转移到赤道板上，这种周期依赖性定位和内源性 AuroraB在普通HeLa细胞内的定位相同，且绿色荧光蛋白标签不影响AuroraB在 细胞中的正常定位。
实施例3、 Aurora B稳定表达细胞系的鉴定
一、Aurora B稳定表达细胞系的生长曲线的测定
取上述实施例2构建的生长状态良好的Aurora B稳定表达细胞系，用血球计 数板在普通光镜下统计细胞的初始密度为1.45 x 105个细胞/ml，将细胞稀释10倍 (细胞密度为1.45 x 1(T个细胞/ml)后培养到30个直径为5cm的细胞培养皿中， 每天统计3个培养皿中的细胞密度，连续统计10天。同时以未转入任何载体的HeLa 细胞作为对照。在此期间，每两天为培养皿中的细胞换一次新鲜培养液，使得细胞 始终处于良好的生长状态。Aurora B稳定表达细胞系的生长曲线如图3所示。
从图3的生长曲线可以看出，此Aurora B稳定表达细胞系的生长周期约为每 天一代，和未转入任何载体的HeLa细胞几乎没有区别，所以，Aurora B稳定表达 细胞系虽然稳定表达带有绿色荧光蛋白标签的Aurora B，但对HeLa细胞的生长周 期几乎没有影响。
二、 Western blot对Aurora B稳定表达细胞系中Aurora B表达量的检测 用胸腺嘧啶阻断法将生长状态良好的AuroraB稳定表达细胞系同步化到中期， 具体做法如下用2.5mM的胸腺嘧啶脱氧核苷(购自Sigma公司，Catalog #M1404) 处理上述Aurora B稳定表达细胞系17h，然后释放3h，最后用50ng/ml的诺考达唑 (Nocodazol)(购自Sigma公司，Catalog存T1895)处理12h。将处理好的细胞裂解后 用western blot检测Aurora B的表达量。同时对未转入任何载体的HeLa细胞进行 平行处理，标记其内源AuroraB作为对照。Western blot检测结果如图5所示。结 果表明，在上样量一致的情况下，AuroraB稳定表达系中有两条带外源表达的 Aurora B和内源Aurora B。且外源表达的Aurora B条带比未转入任何载体的HeLa 细胞中的内源AuroraB条带要粗，说明AuroraB稳定表达系中AuroraB的表达量 比未转入任何载体的HeLa细胞中AuroraB的表达量要大得多。已将一株 GFP-AuroraB稳定表达的HeLa细胞株于2008年9月2日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路3号)， 保藏号为CGMCC No. 2652。
实施例4、 Aurora B稳定表达细胞系对Aurora B特异的小分子抑制剂ZM447439 的敏感性实验
取两皿生长状况良好的AuroraB稳定表达细胞系的细胞， 一皿作为对照组不做 任何处理， 一皿加入2,的ZM447439(购自Tocris公司，Catalog # 2458)。将两 个培养皿分别放在荧光显微镜下，寻找处于有丝分裂中期的细胞，通过观察不同处 理的细胞来确定ZM447439对细胞有丝分裂的影响，观察结果如图7所示。
从图7可以看出，Aurora B稳定表达细胞系中Aurora B的表达受ZM447439 的明显影响。在52min之内，未用ZM447439处理的细胞已经完成胞质分裂，进入 了下一细胞周期的间期，而加入ZM447439处理的细胞在52 min之内姐妹染色单体 却未能分开， 一直持续到大约9小时后细胞染色体去凝集，退出有丝分裂期，形成 多倍体细胞。结果表明，ZM447439可以使AuroraB在细胞内的定位发生显著变化。序列表
<160> 2
〈210> 1
〈211〉 1035
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400> 1
atggcccaga aggagaactc ctacccctgg ccctacggcc ctgagcaccc tgccccagcg agtcctccgg aaagagcctg ctcatgagcc gctccaatgt ccagcccaca gctgcccctg agcagtggga cacccgacat cttaacgcgg cacttcacaa cgtcctctgg gcaaaggcaa gtttggaaac gtgtacttgg ttcatcgtgg cgctcaaggt cctcttcaag tcccagatag cagctgcgca gagagatcga aatccaggcc cacctgcacc tacaactatt tttatgaccg gaggaggatc tacttgattc gagctctaca aggagctgca gaagagctgc eicatttgacg atggaggagt tggcagatgc tctaatgtac tgccatggga ataaagccag aaaatctgct cttagggctc aagggagagc tggtctgtgc atgcgccctc cctgaggagg aagacaatgt cccccagaga tgattgaggg gcgcatgcac aatgagaagg gtgctttgct atgagctgct ggtggggaac ccaccctttg
gacagacggc tccatctggc 60
tcaccccatc tgcacttgtc 120
gccagaaggt gatggagaat 180
ttgatgactt tgagattggg 240
ctcgggagaa gaaaagccat 300
agaaggaggg cgtggagcat 360
atcccaacat cctgcgtctc 420
tagagtatgc cccccgcggg 480
agcagcgaac agccacgatc 540
agaaggtgat tcacagagac 600
tgaagattgc tgacttcggc 660
gtggcaccct ggactacctg 720
tggatctgtg gtgcattgga 780
agagtgcatc acacaacgag 840
acctatcgcc gcatcgtcaa ggtggaccta aagttccccg cttctgtgcc cacgggagcc 900
caggacctca tctccaaact gctcaggcat aacccctcgg aacggctgcc cctggcccag 960
gtctcagccc acccttgggt ccgggccaac tctcggaggg tgctgcctcc ctctgccctt 1020
caatctgtcg cctga 1035
<210〉 2
〈211〉 344
<212〉 PRT <213〉人工序列
<400> 2
Met Ala Gin Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Arg Gin Thr 15 10 15
Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gin Arg Val Leu Arg Lys Glu 20 25 30
Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu Val Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gin 35 40 45
Pro Thr Ala Ala Pro Gly Gin Lys Val Met Glu Asn Ser Ser Gly Thr 50 55 60
Pro Asp lie Leu Thr Arg His Phe Thr lie Asp Asp Phe Glu lie Gly 65 70 75 80
Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu 85 90 95
Lys Lys Ser His Phe lie Val Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ser Gin 100 105 110
lie Glu Lys Glu Gly Val Glu His Gin Leu Arg Arg Glu lie Glu lie 115 120 125
Gin Ala His Leu His His Pro Asn lie Leu Arg Leu Tyr Asn Tyr Phe 130 135 140
Tyr Asp Arg Arg Arg lie Tyr Leu lie Leu Glu Tyr Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160
Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Gin Lys Ser Cys Thr Phe Asp Glu Gin Arg 165 170 175
Thr Ala Thr lie Met Glu Glu Leu Ala Asp Ala Leu Met Tyr Cys His 180 185 190
Gly Lys Lys Val lie His Arg Asp lie Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 195 200 205
Gly Leu Lys Gly Glu Leu Lys lie Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His 210 215 220
Ala Pro Ser Leu Arg Arg Lys Thr Met Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu 225 230 235 240
Pro Pro Glu Met lie Glu Gly Arg Met His Asn Glu Lys Val Asp Leu 245 250 255
Trp Cys lie Gly Val Leu Cys Tyr Glu Leu Leu Val Gly Asn Pro Pro 260 265 270
Phe Glu Ser Ala Ser His Asn Glu Thr Tyr Arg Arg lie Val Lys Val 275 280 285
Asp Leu Lys Phe Pro Ala Ser Val Pro Thr Gly Ala Gin Asp Leu lie 290 295 300
Ser Lys Leu Leu Arg His Asn Pro Ser Glu Arg Leu Pro Leu Ala Gin 305 310 315 320
Val Ser Ala His Pro Trp Val Arg Ala Asn Ser Arg Arg Val Leu Pro 325 330 335
Pro Ser Ala Leu Gin Ser Val Ala 340
权利要求
1、Aurora B稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤1)将Aurora B的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达Aurora B的细胞系。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述真核表达载体为pEGFP-C2、 pCMV-Tag或pCMV-Myc。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述宿主细胞为HeLa细胞、293 细胞或3T3细胞。
4、 利用权利要求1-3中任一所述的方法制备的AuroraB稳定表达细胞系。
5、 根据权利要求4所述的Aurora B稳定表达细胞系，其特征在于所述Aurora B稳定表达细胞系为GFP-Aurora B稳定表达的HeLa细胞系，所述GFP-Aurora B稳 定表达的HeLa细胞系的保藏号为CGMCCNo. 2652。
6、 权利要求4或5所述的Aurora B稳定表达细胞系在筛选抗癌小分子药物中 的应用。
7、 筛选抗癌小分子药物的细胞模型，是权利要求4或5所述的Aurora B稳定 表达细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种Aurora B稳定表达细胞系及其在药物筛选中的应用。本发明所提供的Aurora B稳定表达细胞系的制备方法，包括以下步骤1)将Aurora B的编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；2)将步骤1得到的重组表达载体导入宿主细胞中，筛选得到稳定表达Aurora B的细胞系。本发明的Aurora B稳定表达细胞系为深入探索Aurora B在癌症发生中的作用提供实验技术平台，可用于筛选抗癌的小分子药物。
文档编号C12N15/85GK101343634SQ20081011970
公开日2009年1月14日 申请日期2008年9月5日 优先权日2008年9月5日
发明者傅静雁, 张传茂, 青 蒋, 辛广伟 申请人:北京大学